关于透明质酸的科研论文开题报告

近日，玻尿酸 科技 企业国纤美正式宣布与“中国玻尿酸之父”、国家糖工程技术研究中心主任凌沛学院士达成战略合作，双方将在玻尿酸科研成果转化、玻尿酸技术在功能食品领域的应用等方面进行深入合作。在此次签约会上，双方强强联手研发的口服玻尿酸产品——悦彦秀壹号糖果正式面世。

打破国际垄断，39年如一日专注玻尿酸研究

人体中的透明质酸含量约为15g，在人体的生理活动中发挥着重要作用。组织和器官中的透明质酸减少，可导致关节炎、动脉硬化、脉搏紊乱和脑萎缩等。人体中透明质酸的减少会产生早老症。

上个世纪90年代以前，国内透明质酸主要从鸡冠中提取，原材料数量有限且成本高。同时，透明质酸与动物组织中的蛋白质和其它多糖以复合体形式存在，分离纯化工艺复杂、收率低，产能十分有限。那段时期，国内的玻尿酸主要依靠进口，一度被西方所垄断。

早在1983年，凌沛学即投入到玻尿酸的研发中。为了实现玻尿酸的国产化，以凌沛学为代表的科研团队经过数百次实验，终于在90年代中期在国际上率先发明了利用生物技术发酵法生产玻尿酸，实现中国玻尿酸量产并推向了全球，被中国生化制药工业协会授予“中国透明质酸之父”。

他所创建的透明质酸理论技术体系和产品质量达到国际先进水平，将玻尿酸技术应用到医疗领域，治疗几千万眼科、骨科、皮肤科患者，为中国医疗事业的发展做出了重要贡献。中国成为玻尿酸领域的强国，凌沛学的贡献功不可没。

凌沛学院士专注研究玻尿酸39年，数十年如一日坚持不懈科研工作，拥有300多项国内外专利，先后获得2项国家 科技 进步二等奖、1项三等奖，何梁何利基金科学与技术创新奖，山东省科学技术最高奖，中国青年 科技 奖。凌院士还入选全国杰出专业技术人才、国家有凃出贡献中青年专家等诸多荣誉，获得国家级奖项4项，省部级奖20余项，发表学术论文100余篇。

2021年，凌沛学当选国际欧亚科学院院士，是玻尿酸领域唯一的院士。

百亿级食品级玻尿酸新赛道开启

2021年1月7日，国家卫生 健康 委员会发文，批准透明质酸钠（透明质酸，俗称玻尿酸）为“新食品原料”，可应用于普通食品添加。

清华大学药学院教授、药理学研究所主任王钊联合首都医科大学基础医学院、北京协和医院临床营养科等作者在《食品科学》期刊发表论文《经口给予透明质酸的生理功能及其作用机制研究进展》。

论文指出：“经体内、体外实验以及患者双盲实验初步证明，口服透明质酸在维持皮肤 健康 、修复关节损伤、调节肠道免疫、缓解干眼等方面扮演着重要的角色，对人体皮肤、眼部、关节，有一定保护功效，且口服透明质酸可以提高紫外线照射后皮肤中水分含量，最终实现改善皮肤状态、减缓皮肤衰老的功效。”

关于口服玻尿酸，中国工程院陈坚院士公开表示，研究表明口服高分子量透明质酸经过胃肠化学消化以及部分酶解后，部分透明质酸钠被人体吸收，有助于维持人体的透明质酸含量。另外，每日口服补充120 mg、200 mg的透明质酸钠可以在保护胃肠道 健康 、护眼、缓解骨关节炎、改善皮肤功效等方面发挥作用。

安信证券研究报告提出：玻尿酸未来有望作为食品原料搭配胶原蛋白、虾青素等成分，结合消费者喜好推出不同组合或剂型，应用于下游乳及乳制品、饮料、巧克力制品、糖果及其他功能性食品。

自2021年玻尿酸入食获批以来，玻尿酸食品成为新的风口和赛道。安信证券预判，中长期国内食品级玻尿酸终端产品市场空间有望达154亿元，其中，国纤美成为玻尿酸食品领域“最早吃螃蟹”的 科技 企业之一。

悦彦秀壹号糖果，口服玻尿酸的新黑马

国纤美在成立之初，就制定了聚焦“玻尿酸+”的中长期战略，国纤美通过与玻尿酸最顶级的科学家进行强强合作，构建了一体化的“玻尿酸+”产学研用平台。此次与凌沛学院士的战略合作，正式拉开了国纤美“玻尿酸+”战略的序幕。

国纤美旗下的悦彦秀壹号糖果，即采用了凌沛学院士的最新科研成果与最新专利技术——全分子量玻尿酸Gaussian HA，它通过酶工程切割、梯度光热处理及低温干燥等技术，将大、中、小玻尿酸分子进行均衡分布，通过协同机制，使全分子玻尿酸和这些有效成分快速被人体的皮肤、关节、眼部等各个部位吸收，从而达到抗衰修复、细胞保护的效果。

“均衡分布的全分子玻尿酸，可通过精准地缓释、控释与长效吸收的方式渗透到细胞膜中，实现持续长效的保健功效。”国纤美执行总裁薇薇表示，“除了全分子量玻尿酸之外，悦彦秀壹号糖果还特别添加了抗坏血酸、鱼肽胶原蛋白肽、抗性糊精、酵母抽提物、Y-氨基丁酸等有效成分，在有效成分的综合作用下，可达到良好的抗衰保健效果。”

在过去的十五年里，薇薇从摆地摊开始，带领团队管理过三千多家大 健康 门店，积累了丰富的线下渠道拓展经验与门店管理经验。2021年，薇薇进一步放大自身优势，极富远见地与“玻尿酸之父”凌沛学院士进行战略合作，精准布局“玻尿酸+”战略。

与凌沛学院士的战略合作，确保了产品的安全 健康 与强功效性，而强大的线下渠道拓展能力，有助于国纤美开辟新的线下大 健康 市场，而这正是被玻尿酸巨头所忽略的领域。

强大的研发基因与领先的渠道优势，构成了国纤美的核心竞争力。薇薇表示，国纤美将进一步打造“玻尿酸+”的产学研用平台，成为全球首屈一指的玻尿酸 科技 企业，用优质的玻尿酸产品为国人的 健康 造福。

医学类开题报告范文模板三篇

引导语：一篇论文的开题报告的好与坏，关系着这篇论文的评价度，所以我们要有一个好的开题，给读者耳目一新的感觉。

医学类开题报告范文(1)篇

课题背景

课题研究的意义

促进网络教学的发展，提高网络教学的质量

由于网络教学可以实现信息资源共享，在网上组织最优秀的教材和教法，使学习者在网上可以学到最新的知识，因此是教学改革发展的方向。通过本项目的研究与实践，使网络教学更能为学习者提供一个建构主义的学习环境，充分体现学生的首创精神，学生有更多的机会在不同情境下去运用他们所学的知识，而且学生可以根据自身的行动的反馈来形成对客观事物的认识和解决实际问题的方案，从而提供网络教学的质量。

寻找利用计算机技术和网络技术实现学生远程交互自主学习的教学设计的技术解决方案

完善和发展教学设计理论

网络环境下的教学与传统教学，不仅是教学环境的不同，在教学内容、教学手段、教学传播形式上都有本质的区别。通过本项目的研究，能够解决网络环境下，教学如何进行教学设计，如何调控教学过程，如何有效实施教学活动以达成教学目标，是对教学设计理论的完善和发展。

国内外的研究现状

网络教学的设计理论与方法的研究缺乏系统性

通过对国内外有关的学术刊物(如《电化教育研究》、《中国电化教育》、《Educational Technology》等)、教育网站和国际国内有关学术会议(GCCCE、ICCE、CBE等)的论文集进行分析，网络教学的设计研究主要是关于建构主义学习环境的设计和协作学习的设计等方面，缺乏系统的研究。可以说，网络教学的设计理论的研究还处于初级阶段，还有很多问题需要去研究和探索。例如，在网络环境下如何利用网络资源进行主动学习、利用虚拟情境进行探究学习、利用通讯工具进行协商学习、利用工具进行创造学习的设计以及教师指导性活动的设计等方面，都值得我们去研究。

网络教学的评价研究才刚刚起步

随着Internet应用的普及，网络教学已成为一种重要的教学手段和教学场所。然而，与传统教学相比，网络教学的质量保证体系却显得不够完善、健全。如何保证网络教学的质量，建立一个行之有效的网络教学评价模型，已成为网络教学研究的一个重要课题。时至*年，教育部批准全国31所高校建立网络教育学院，但却没有制定出如何保证网络教育质量的相关政策。美国国家教育政策研究所(The Institute For Higher Education Policy)于*年4月也发表了一份名为 在线教育质量：远程互联网教育成功应用的标准 的报告，然而，这些文章(报告)也仅仅是描述性的定义网络教学的评价指标，而对如何组织评价、如何获取定量数据、评价数据如何促进教学等方面则很少涉及。目前，网络教学的支撑平台中的学习评价模块往往只含有测试部分，而缺乏相应的分析与反馈。

课题研究内容

研究的主要内容

网络教学设计理论体系的研究

包括教学目标的设计、建构性学习环境的设计、学习情境的设计、学习资源的设计、学生自主学习活动的设计、学生协作学习活动的设计、教师指导性活动的设计、学习评价工具的设计等。

基于网络环境下的教学策略与教学模式的研究

(1)网络教学策略的研究，如网络环境下的教学内容组织策略、网络环境下的教学情景营造策略、网络环境下的教学对话组织策略、网络环境下的的课堂管理策略等

(2)网络教学模式的研究，如项目化学习模式、探索性学习模式、研究性学习模式等

网络教学评价的内容体系、方法、步骤与模型的研究

网络教学设计系统软件的开发与应用

网络教学评价系统软件的开发与应用

根据上述研究内容，总课题下设如下子课题：

网络教学设计与教学评价的理论研究(*、*)

网络教学资源的开发(邓文新)

网络教学设计与教学评价系统的开发(*)

Web课程的教学过程设计及支持系统的研究(陈品德)

网络教学设计与教学评价理论的应用研究(余红)

课题的研究目标

本项目的研究目标是：运用现代教学理论与建构主义学习理论，通过教学改革与实验，探索网络教学的设计与评价的理论和方法，开发相配套的网络教学的设计和评价系统软件，探索普通中小学利用网络资源进行网络教学的途径与方法。

预期成果形式

论文与专著

发表有关网络教学的设计与评价的一系列学术论文，出版专著《网络教学的设计与评价》。

电脑软件

开发《网络教学设计系统软件》和《网络教学评价系统软件》，制作《网络教学设计》专题教学(学习)网站，建立《教学设计》多媒体资源库。

研究方法与技术路线

研究方法与步骤

本项目的研究主要采用行动研究、实验研究、评价研究等方法。

对于较大规模的教学设计与教学模式的试验研究，将采用行动研究方法。

对于个别带有创新性的，能提出重要见解的小范围的教学研究，则通过建立科学的假设，采用实验研究的方法。

关于教学模式的评价和有关教学效果的分析，则采用评价研究方法。

研究步骤如下：

*年9月-20*年1月，开发软件

*年2月-20*年8月，教学试验，评价修改

*年9月-20*年12月，扩大试验，归纳总结

关键技术

基于网络的协作化设计思维工具的通讯模型的构建;

教学设计系统中师生教学活动的可视化表示与分析;

网络教学的教学评价模型的构建;

网络教学过程中学习反应信息的自动采集与处理。

课题研究价值

创新点

建立网络教学设计的理论体系与方法。

建立基于网络环境的各类教学评价指标体系。

开发出操作性强、具有实际应用价值的网络教学的设计工具和评价系统软件。

理论意义

传统的教学设计是应用系统方法分析和研究教学的问题和需求，确立解决他们的方法与步骤，并对教学结果作出评价的一种计划过程与操作程序。现代教学设计理论已经不拘泥于系统论的理论基础，不强调对教学活动的绝对控制，逐渐放弃呆板的设计模式，开始强调教学设计的关系性、灵活性和实时性，从而更加有利于学生的创新精神和实践能力。本课题的理论成果将完善和发展传统的教学设计理论与方法。

应用价值

通过课题的研究与实践，总结并形成基于网络环境下学科教学设计的理论与方法，优化中小学课堂教学结构。

通过课题的研究与实践，探索并总结信息化时代如何改革传统的思想和模式，使学生学会利用网络资源进行学习的方法和经验。

通过课题的研究与实践，探索普通中小学利用网络资源的途径与方法，形成一批优秀的网络教学课例。

通过课题的研究与实践，开发出具有应用推广价值的网络教学的设计工具和评价系统软件。

研究基础

已有相关成果

曾于*年、*年两度获得国家级优秀教学成果奖，其中《多媒体组合教学设计的理论与实践》项目的成果在全国的大中小学广泛应用，《多媒体组合教学设计》(*、*编著，科学出版社)多次再版发行。

出版的《多媒体教学软件设计》(含教材与光碟)(*等编著，电子工业出版社，*年)、《多媒体教学软件设计与制作》(含教材与光碟)(*、*、*编著，中央广播电视大学出版社，*年)和《信息技术与学科教学整合》(*、*、*等，万方数据电子出版社，20*年)在全国广泛应用。

*年《多媒体技术在基础教育改革中的应用实验研究》和《小学语文 四结合 教学改革试验研究》获国家教委全国师范院校面向基础教育改革科学研究优秀成果二等奖。

承担国家 九五 重点科技攻关项目《计算机辅助教学软件研制开发与应用》(简称96-750)《小学语文科学小品文》、《小学语文古诗欣赏》、《小学语文扩展阅读》、《初中语文新诗赏析》四个子课题的研制与开发，4个项目6张光盘全部通过教育部组织的专家组鉴定，被评为优秀软件，并由北京师范大学出版社和电子工业出版社出版，在国内及东南亚地区发行。

*年所完成的《学习反应信息分析系统》获广东省高等学校优秀多媒体教学软件一等奖，并出版专著《学习反应信息的处理方法与应用》(*、*著，暨南大学出版社，*年)。

研究条件

华南师范大学教育技术学科是国家级重点学科，华南师范大学教育信息技术学院是 211工程 重点建设学科单位，我国的教育技术学博士点之一。华南师范大学教育技术研究所拥有从事计算机教育应用研究的人员近30名，其中包括教授2名、副教授5名、讲师8名、博士研究生4名和硕士研究生近15名。他们在长期的研究工作中，对各种多媒体教学软件、网络教学应用软件、学科教学工具、资源库管理应用系统进行了深入的研究与探索，并已取得了实质性的进展和成果。本研究所拥有先进的计算机软件开发实验室两个、国家级的多媒体教学软件制作基地一个，在国内教育技术领域方面处于领先地位。

医学类开题报告范文(2)篇

研究背景及意义

研究背景

随着医疗卫生体制改革的进一步深入，医院的经营模式及所有制形式正处在变革当中，医院国家、集体、个体等多种所有制并存的形式代替了原来单一的国家所有，国有医院的经营模式和运行方式也在朝着适应市场运作规律的方向发展，医院必将面临日益激烈的竞争。

在新形势下，随着国家卫生改革政策的不断推进，医疗市场的竞争迫使医院必须抓管理，讲效益，运用营销策略[1]。因此，医院管理者要转变观念，运用现代营销学的观点，通过营销手段树立良好的医院品牌形象，提高竞争力，更好地满足广大人民群众对医疗服务的多层次需求，根据我国卫生事业的性质，借鉴国内服务行业市场营销和国外医院市场营销的成功经验，并结合我国的国情，建立一套适合中国医院发展的市场营销模式。

近几年来，国内大部分医院开始有市场营销的意识，开展了一些诸如广告、传播、服务措施优质化与多样化的操作。但由于缺乏系统的营销理论和实操经验，许多操作还很不规范，使医院的市场营销工作很难有针对性，其结果是医院在制定竞争策略时大多没有体现差异，缺乏个性，形不成自身的核心竞争力。

湖南省中医院是一所有着 7余年历史的省级中医名院。素有 湖湘中医发祥地 三湘名医之摇篮 誉称。属国家三级甲等中医医院，是省内集医疗、保健、教学、科研于一体的中医龙头医院之一。

拥有 17 个中医特色专科和 5个中医专科专病门诊，其中 4 个国家重点专科、6 个湖南省重点专科。开放病床 606 张。医院正在着手修建一栋 28 层医疗教学综合大楼，大楼建成后将增加病床 100张。湖南省中医院历史悠久、名医荟萃、中医特色浓郁、专科专病建设突出。但医院身居闹市，周边医院林立，市场竞争激烈 。因此，正视服务营销在医院发展中的作用，提升医院的知名度和美誉度，提高医院的市场占有率，让更多的病()友享受到中医简便廉验的预防与治疗，是当前一个亟需思考、比较迫切的问题;如何利用服务营销的系统理论，对湖南省中医院进行服务营销策略研究显得迫在眉睫。

选题意义

新时期，医疗机构的改革和医疗市场的竞争给医院的发展带来了机遇，同时也带来了挑战。在充满竞争的市场经济中，医院管理者已经开始意识到营销的.重要性，重视医院营销活动，但当前许多医院，由于其特定的专业性、技术性，缺乏整体的市场营销理念和理论，没有充分发挥营销在医院发展中的重要作用。

研究思路与基本框架

论文主要包括以下五个部分的内容：第一章绪论。介绍本文的研究背景、研究的方法以及对医院服务营销、医疗服务消费者研究、服务质量理论、关系营销理论、内部营销理论等相关文献研究进行综述。

第二章运用波特五力模型、SWOT 分析法等对湖南省中医院服务营销内外部环境进行深入分析。

第三章通过对湖南省中医院市场进行细分，对其目标市场选择和定位进行深入研究。

第四章是在前文分析研究的基础上，系统而又有重点的分析和制定医院服务产品、服务价格、服务渠道、服务促销、服务人员、服务过程、有形展示等要素的具体应用策略。

第五章是提出实施湖南省服务营销策略的保障措施。

最后对本文进行总结。

医学类开题报告范文(精品)(3)篇

###医学院

研究生学位论文开题报告书

学 号： 1037

姓 名：

导师姓名：

研究方向： 病理生理学

论文题目： 血清TLR4及肠型脂肪酸结合蛋白在NEC早期诊断中的临床意义

院(系)： ###医学院

入学时间： 20XX年 6 月 1日

开题时间： 20XX年2月24 日

二○一四 年 二 月 二十四 日

立论依据

(包括研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处)

对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述本课题的科学意义;

对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用情景。

研究意义：

新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)是新生儿时期严重威胁生命的消化系统急症，以早产儿、小于胎龄儿发病者较多，在NICU患儿中的发病率高达10%，是早产儿死亡的重要原因之一。临床以腹胀、腹泻、黏液血便和胆汁样呕吐为主要表现，腹部X线平片以肠壁囊样积气为特征，肠道病变范围可局限或广泛，回肠累及最多，黏膜呈凝固性坏死，粘膜下层弥漫性出血或坏死，严重者肠壁全层坏死甚至穿孔。

目前有很多方法用于诊断NEC。除了可以根据临床表现诊断外，腹部X线片是最常用的辅助检查方法，虽然其用于诊断NEC的特异度较高，但对于早期诊断NEC帮助不大，目前也有很多关于IL-8、IL-10、IL-1受体拮抗剂等生化指标用于诊断NEC的研究，但缺乏较好的用于早期诊断NEC的血生化指标。

TLR是由Nomuria等在哺乳动物体内发现与果蝇Toll蛋白相似的一种蛋白。TLR在不同细胞的表达和识别不同细胞因子在多种疾病的发病机制中起重要作用，目前研究发现TLR参与肿瘤、肠道免疫性疾病等多种疾病的发病。在人类体内发现的TLR家族共有10个成员，其中TLR4是近年来研究较多的其中一个，TLR4主要表达在内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及DC上。

I-FABP是由小肠单层柱状上皮细胞分泌的一种小分子蛋白质，占成熟的细胞基质蛋白的2%。肠缺血早期仅有黏膜受累时即可因为细胞通透性升高而导致IFABP释放入血，具有较好的器官特异性。

本研究旨在通过检测NEC患儿血清中的TLR4及肠型脂肪酸结合蛋白，监测其在NEC中的动态变化，作为NEC严重程度的生化指标，可为辅助诊断NEC提供依据，达到早期干预的目的。

国内外研究现状分析：

TLR4上调导致NEC发生的机制研究

)、与LPS结合后，被激活的TLR4可以通过髓样分化因子88(MyD88)依赖性和非依赖性两个途径介导炎症因子的释放。其中MyD88依赖性途径主要介导NF-kB活化和细胞因子产生，而MyD88的非依赖性途径主要诱导LPS的干扰素(IFN)，以及干扰素诱导蛋白10(IP10)基因、糖皮质激素衰减反应基因16(GARG-16)、干扰素调节基因1(IRG-1)的表达和DC的成熟，激活下游NF-kB、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38信号通路，诱导促炎症因子如()白细胞介素-1(IL-1)6、12和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等的表达。

)、Chan等研究发现，TLR4激活后能影响肠道粘膜的修复能力，此与其减少肠道细胞增殖、降低内皮细胞基底部粘附力及减少内皮细胞移动到受损位置的数量有关。Sodhi等研究证明，TLR4通过抑制细胞的增殖分化作用于wnt-β-5信号系统，使肠道粘膜修复能力受损，加重NEC的病理变化。

)、最新研究表明，TLR4不仅可以与LPS结合诱导炎症反应、损伤肠道粘膜导致NEC发生，许多分子蛋白如纤维结合蛋白、透明质酸。硫酸肝素等均能激活TLR4，在无外来病原菌时TLR4表达可能增高，释放大量炎症因子从而发生NEC的炎症瀑布链式反应。这一发现，可以解释一些无明显感染因素引起的NEC。

细菌及其产物如何引起肠上皮细胞的损伤探讨

血小板活化因子(PAF)在NEC的发生中起重要作用。有研究应用缺氧、低温、人工喂养、细菌感染等方法制成了NEC的动物模型，结果发现肠上皮的PAF及其受体的表达增高，阻断PAF的受体表达后NEC的发生率明显下降。PAF表达增高可使肠壁血管通透性增高、白细胞游出、细胞粘附分子的合成增多及活性氧生成增加，从而损伤肠壁。有研究表明，PAF可活化肠上皮细胞的STAT，使磷酯酶A2及内皮素一1的合成增加，并可通过上bax的表达而诱导肠上皮细胞凋亡，从而损伤肠上皮细胞、破坏细胞问的连接而引起细菌移位。另外，PAF还可诱导肠上皮细胞产生TLR4，后者可活化IKK，从而激活NFxB而引起炎症级联反应。如果敲除TLR4，则NEC的发生率明显降低，说明TLR4在NEC的发生中也有重要作用。

沈涤华等研究表明I FABP可以作为早期肠缺血较理想的生物学指标，国外学者研究发现NEC患儿血清I-FABP水平明显升高，且与NCE严重程度有关。

Thuijls等研究发现重症NEC患儿在早期血I-FABP水平即明显升高。当临床出现轻度腹胀，大便隐血阳性怀疑NEC时，血、尿I FABP水平在发展成为重症NEC的患儿会明显高于诊断为其他疾病和病情稳定在NECI期或Ⅱ期的患儿。

主要参考文献

Hans Van Goudoever，陈超，张蓉.新生儿坏死性小肠结肠炎的热点问题.中国循证儿科杂志 20XX，06(5).

邹静静，陈运彬.TOLL样受体在新生儿坏死性小肠结肠炎中的表达及作用.中国新生儿科杂志 20XX,27(5).

李志杰，刘靖华，姜勇.ToLL样受体的发现及其研究进展.中国危重病急救医学，2015,15:694-697.

Viriyakosol S,Tobias PS,Kitchens RL,et al..MD-2 binds to bacterial Biol Chem，2015,276:38044-38051.

Johnson GB, Bruun GJ,Kodaira Y,et monitoring of tissue well-being via detection of soluble heparin s。

药学毕业论文开题报告篇3 题 目 名 称： 番泻叶对小鼠尿量的影响 研究现状： 一、普鲁兰酶 普鲁兰酶(Pullulanase，. 2. 1. 41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的脱支酶。普鲁兰酶还可以分解普鲁兰多糖，普鲁兰酶来源于微生物，R-酶则来源于植物。普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气气杆菌Aerobacter. aerogenes}(典型菌为肺炎克雷伯氏杆)发酵获得，他们报道了该酶良好的酶学性能。之后，各国的科研人员经过广泛深入研究，从不同的地区、微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。 在淀粉加工工业中，α淀粉酶最为常用，它的功能是水解淀粉的α-1,4糖苷键，单独用它时，产物中含有大量分支结构的糊精，其中就含有大量的α-1,6糖苷键。假如不把淀粉的α-1,6糖苷键彻底分解的话，势必会造成很大的浪费。自然界中，存在有能分解淀粉的α-1,6糖苷键的酶，通称为解支酶。如寡α-1,6葡萄糖苷酶( , Oligo-l,6-glucosidase )，普鲁兰酶( )，异淀粉酶( , Isoamylose )，支链淀粉一6-葡聚糖酶( )，其中普鲁兰酶要求的底物分子结构最小，故而可以将最小单位的支链分解，导致可以最大限度的利用淀粉，所以在淀粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。故而许多国家都争相开发，但是到现在为止，只有丹麦的NOVO公司具有普鲁兰酶的生产能力。我国只有向其进口，但是其价格昂贵，限制了普鲁兰酶在我国的应用。其实，我国早在七十年代就开发普鲁兰酶的产生菌，但是该菌的酶学性质不适合生产，至今我国在普鲁兰酶的国产化方面还没有报道。 在淀粉的加工行业上，对普鲁兰酶的酶学性质的要求是耐酸耐热，其原因是因为通常使用外加酶化法，由于所用酶类的限制，普鲁兰酶的添加可以在两步反应的任何一步，但必须满足上述的反应的条件。因此所开发的普鲁兰酶的酶学性质必须满足现有的酶法水解制糖的条件，也就是耐酸耐热。 二、普鲁兰酶的研究现状 1.产普鲁兰酶的微生物 普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气杆菌(Aerobacter aerogenes)发酵获得。他们报道了该酶的良好性能之后，各国的科研人员经过广泛深入的研究，从不同的地区的微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。但是迄今为止，尽管发现许多微生物能够产普鲁兰酶，但是由于当今工业生产条件(酸性，温度)，大多数微生物所产的普鲁兰酶并无商业价值。以下便介绍一下普鲁兰酶的生产菌种。 蜡状芽抱杆菌覃状变种(Bacillus cereus ) 由日本的ToshiyukiTakasaki于1975年发现。该菌同时产生两种淀粉酶:β-淀粉酶和普鲁兰酶。最佳作用条件为pH6～，温度50℃，最大转化率(淀粉水解产生麦芽糖)大约为95%.酶学研究中发现，此酶在pH5，温度60℃依然保持大部分活性，该菌的营养细胞呈棒杆状，聚集成长短不等紊乱链状，无运动性，格兰氏阳性，产芽抱时细胞无明显膨胀。该菌最适生长温度30℃～37℃ ,最高生长温度在41℃～45℃，可以利用葡萄糖，甘露糖，麦芽糖，海藻糖，淀粉和糖原。 嗜酸性分解普鲁兰多糖芽抱杆菌() 上世纪八十年代初，丹麦Novo公司获得此菌，此菌所生产的普鲁兰酶耐热 (60℃)，耐酸()。该公司经过投入巨资开发研究，1983年Nov。公司在日本和欧洲市场同时商业化销售，商品名Prornozyme。如今，它是应用最广，产量最大的普鲁兰酶。呈棒状，深层发酵几小时后，可观察到类原生质体的膨胀细胞，较稳定，饱子呈圆柱体或椭圆体。格兰氏反应阳性，37℃生长良好，45℃以上和pI-1高于以上不长，在以普鲁兰糖为碳源的培养基(( ～)上生长良好。 枯草芽饱杆菌(Bacillus subtilis) 1986年，日本的Yushiyuki Takasaki报道了一株能产生耐热耐酸普鲁兰酶的菌种，被命名为Bacillus subtilis TU。此菌种所产生的酶为普鲁兰酶和淀粉酶的混合物，可水解淀粉为麦芽三糖和麦芽搪.水解普鲁兰糖为麦芽三糖，其中普鲁兰酶最佳作用pH为～，但在时亦有约50%的酶活，此普鲁兰酶最佳作用温度60℃。 耐热产硫梭菌(Clostridum Themosulfurogenes) 1987年.德国的等报道了一株能同时产a淀粉酶、普鲁兰酶和葡萄糖淀粉酶的菌种:耐热产硫梭菌。该菌种所产普鲁兰酶有较广的温度适应范围(40℃～85℃)，在～有较高的活性，在如此广的范围内都有较强活力无疑将扩大该普鲁兰酶的应用领域. Bacillusnaganoensis,Bacillus deramificans, 上世纪九十年代，Deweer发现了普鲁兰酶产生菌Bacillus naganoensis;Tomimura筛选出Bacillus deramifrcans。这两株菌所产的普鲁兰酶的酶学性质与Bacillus. Acidopullulyticus的酶学性质相似。这两株菌都是中度嗜酸菌，在以上就不生长，温度超过45℃以上同样也不生长。这两株普鲁兰酶产生菌的发现，进一步拓宽了普鲁兰酶的应用。 产普鲁兰酶的高温菌菌种 自上世纪八十年代以来，人们逐渐意识到在通常的自然条件下，很难筛选得到极端耐热的普鲁兰酶生产菌种，于是各国的科学家便把目光转移到温泉嗜高温细菌的筛选，而且现在已经取得较多的成果。Bacillus如vorcaldarius所产普鲁兰酶的最适温度和pH分别是75～85℃, , Thermotoga maritime的最适温度和pH分别是90℃, , Thermurs caldopHilus的最适温度和pH分别是75℃,, Fenidobacterion pernnavoran最适温度和pH分别是80～85℃, 2.普鲁兰酶的分子结构 至今为止，许多普鲁兰酶的基因己经被克隆，但是还没有见到任何有关普鲁兰酶结构的报道，但是在根据序列相似性对糖普键水解酶的分类，普鲁兰酶属于第13家族，α淀粉酶家族，这个家族中包含了30多种酶，可以分为水解酶，转移酶。异构酶三大类。这些酶能够水解和合成α～,α～,α～,α～,α～,α～糖苷键。其中很多酶的结构已经被报道，它们都采取了(β/α)8的结构，通过生物信息学的研究，这个家族的蛋白都有一个共同的结构，酶的活性中心都是(β/α)8折叠筒的结构，命名为结构域A。第13家族的大多数酶还具有结构域B，它是位于(β/α)8折叠筒中，第三个β片层与第三个α螺旋之间的一段序列，其特点是结构和长度差异较大，推测其功能是与底物的结合有关。在紧接着(β/α)8折叠筒后，还有C结构域，紧接C结构域，部分家族成员还有结构域D。 3.普鲁兰酶的应用 普鲁兰酶，在食品工业中是一种用途广泛的酶制剂和加工助剂。它能专一性分解淀粉中的支链淀粉和糖原分子及其衍生的低聚糖分支中的α～l, 6糖苷键，使分支结构断裂，形成长短不一的直链淀粉。因此，将该酶与 其它 淀粉酶配合使用时，可使淀粉糖化完全。近年来，普鲁兰酶己作为淀粉酶类中的一个新酶种，应用于淀粉为原料的食品等工业部门，在食品工业中有如下几方面的作用: 单独使用普鲁兰酶，使支链淀粉变为直链淀粉 直链淀粉具有凝结成块，易形成结构稳定的凝胶的特性，因此，可作为强韧的食品包装薄膜。这种薄膜对氧和油脂有良好的隔绝性，又因涂布开展性好，故适合于作为食品的保护层。它还适合于淀粉软糖制造，也可用作果酱增稠剂，用于装油脂含量高的食品，以防止油的渗出以及肉食品加工。近年来在食品工业中提倡使用可被生物降解的薄膜，直链淀粉在这些方面具有较大的发展前途。豆类直链淀粉含量较高，因此绿豆淀粉制成的粉丝韧性比其它淀粉好，如果用普鲁兰酶处理谷物淀粉，再制成直链淀粉后，可以制成高质量的粉丝。一般谷物淀粉中，直链淀粉含量仅占20%，支链淀粉含量约为80%。工业上每生产1吨直链淀粉就有4吨副产品的支链淀粉。美国虽然通过遗传育种的方法.得到含直链淀粉60%玉米新品种，但不大适于大量生产。国外已采用普鲁兰酶改变淀粉结构，可使支链淀粉变为直链淀粉。据报道，采用此法收率可达100%.制造直链淀粉的方法为，先采用普鲁兰酶分解经液化的分支部分，使其转变为直链淀粉，并以丁醇或缓慢冷却法沉淀淀粉。再回收含少量水分的晶型沉淀物，最后通过低温喷雾干燥法制成粉状的直链淀粉。 普鲁兰酶与β～淀粉酶配合使用生产麦芽搪 饴糖是我国传统的淀粉糖产品，其中所含部分麦芽糖，广泛用于糖果、糕点等食品工业。目前生产方法是以α～淀粉酶进行液化，再用β～淀粉酶水解支链淀粉，这样只能水解侧链部分。接近交叉地位的α～糖苷键时，水解反应停止。但如果使用普鲁兰酶共同水解，便能使分支断裂，提高淀粉酶水解程度，降低了β极限糊精的含量，大大提高了麦芽糖的产率，有利于生产麦芽搪浆。目前对加普鲁兰酶进行糖化己作了较大规模的试验。 试验条件为。每批投料量约为900公斤碎米，粉浆浓度为15～16Be°数皮用量(对碎米计)，β～淀粉酶活性2,000单位/克以上，;普鲁兰酶活性45,000～55,0 00单位/克，系由产气气杆菌生产，每批用量为1公斤。试验结果表明，加入普鲁兰酶糖化的试验糖与对照糖品相比，还原糖平均增加，麦芽糖含量平均增加了，糊精含量平均减少了高浓度麦芽糖浆较之高浓度葡萄搪浆，具有不易结晶，吸湿性小的特点，所以高浓度麦芽糖浆在食品工业中有着广泛的用途。采用普鲁兰酶与p一淀粉酶配合使用，成本低廉，麦芽糖收率达到70%左右，其至更高。 用于啤酒外加酶法糖化 啤酒生产中麦芽，既是酿造啤酒的主要原料，也为酿造过程提供了丰富的酶源。在啤酒酿造的糖化过程中，麦芽中分解淀粉的主要酶是α～淀粉酶、β～淀粉酶和分解淀粉α～1. 6糖瞥键的R一酶(植物普鲁兰酶或植物茁霉多糖酶)。β～淀粉酶与另两种淀粉酶协同作用，可使淀粉分解成麦芽糖(也包括少量的麦芽三糖和极少量的葡萄糖)和低分子糊精。使麦芽汁有比较理想的糖类组成。在工业生产中为了节约麦芽用量，采用所谓外加酶法糖化，即在减少麦芽用量的前提下，增加淀粉质辅助原料的比率，并加入适当种类的酶制剂进行搪化。要使大麦及其它辅助原料糖化完全，需要外加a一淀粉酶和分解α～糖苷键的普鲁兰酶制剂等。单独使用a一淀粉酶时产生麦芽糖和麦芽三搪是很不完全的。假如分解淀粉α～糖苷键的酶活性不足，淀粉分解就不完全，其结果是可发酵性糖含量低，制成的啤酒发酵度达不到要求。若采用能分解α～和α～糖苷键的糖化型淀粉酶，则其反应产物为葡萄糖，容易使酒味淡薄。采用普鲁兰酶与α～淀粉酶协同，效果良好，其分解产物主要是麦芽糖和少量的麦芽多糖。采用外加酶法糖化时，加入酶制剂的用量为:淀粉酶6～7单位/克大麦及大米:蛋白酶，60-80单位/克，并配合以菠萝蛋白酶10ppm，普鲁兰酶50单位/克大麦。以上三种酶制剂均添加于糖化或酒化开始。 总之，普鲁兰酶无论作为酶制剂和食品工业的加工助剂均有广阔的发展前途。 研究目的和意义： 酶制剂工业是上世纪七十年代就己经形成的一个重要的产业，目前世界酶制剂总产值达100亿美元，我国的产值约为100亿人民币，并且随着其应用领域的不断扩大以及新酶种的开发，这一市场正在迅猛发展。但是全球酶制剂产业几乎被几家外国公司所垄断，其中丹麦的NOVO公司几乎占全球总销售额的一半。本研究对普鲁兰酶的开发，对酶制剂产业的发展有重要的意义。 其次我国自从七十年代开始便对普鲁兰酶进行研究开发，但是所开发得到的普鲁兰酶，既不耐热也不耐酸，这就使其在工业化应用中受到了局限。为了改变我国对进口产品的依赖，填补我国这一领域的空白，寻找一条国产化的道路，本研究的目的是利用自然微生物资源，普鲁兰酶，提高我国淀粉原料的利用率，从而提高整个淀粉加工行业的生产率，这对我国淀粉加工产业的意义是不言而喻的。 研究内容(内容、结构框架以及重点、难点)： 一.普鲁兰酶产生菌的筛选 (1)样品的采集; (2)菌种初筛; (3)菌种复筛; (4)菌种保藏方法; (5)酶活力测定方法的建立。 二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究 (1)碳源，氮源对发酵产酶的影响; (2)初始PH对发酵产酶的影响; (3)接种量对发酵产酶的影响; (4)发酵温度对产酶的影响; (5)金属离子对产酶的影响。 重点或关键技术： (1)纯菌株的分离; (2)菌株的鉴定方法的选择。 研究方法、手段： 一.普鲁兰酶产生菌的筛选 (1)样品的采集：选择适合产生的地点(面粉厂.菜地.果园等)采集土样 (2)菌种初筛：在采集的土样用无菌水稀释后，在含有淀粉类的培养基中做平板涂步， 37℃培养48h后，用碘液进行显色反应，将有淀粉酶产生的菌落接于斜面中保存。 (3)菌种复筛：将前期分离的能产生淀粉酶的菌株涂步于普鲁兰糖平板上，37℃培养48h后用95%乙醇进行透明圈实验。有透明圈产生说明菌株产生普鲁兰酶，将产生透明圈的菌落挑于斜面培养基培养。 (4)菌种保藏方法： 采用4℃低温保藏。 (5)酶活力测定方法的建立：采用发酵培养液经过离心后利用DNS显色法 520nm测定吸光值，测定标准葡萄糖标准曲线，利用标准曲线计算普鲁兰酶酶活大小。 二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究 (1)碳源，氮源对发酵产酶的影响：采用不同碳源，氮源培养基培养一段时间，测定酶活力。(其他条件相同：接种量，装瓶量，初始PH值，转速，培养时间。) (2)初始PH对发酵产酶的影响：采用相同发酵培养基，在不同初始PH下接种等量种子液。在相同条件下培养，测定发酵液的酶活。(其他条件相同：接种量，装瓶量，转速，最佳培养温度，最佳培养时间。) (3)接种量对发酵产酶的影响：在发酵培养基中分别接入2%，4%，6%，8%， 10%，14%，18%的种子培养液于最佳碳源，氮源，最佳初始PH的培养基中，在相同条件下培养，分别检测酶活。(采用以上确定的最佳碳源，氮源，最佳初始PH。) (4)发酵温度对产酶的影响：采用相同培养基，在不同温度下(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃)培养一定时间，测定酶活力。 (5)金属离子对产酶的影响：在基础培养基中加入少量不同金属离子，发酵后测酶活。(金属离子有： 锰离子，钙离子，锌离子，镁离子，铁离子，铜离子。) 研究进度 ：完成项目总体进度30%，样品土样的采集及前期的准备工作,菌株的初筛，包括(样品土样原液的涂步培养及摇床培养，产支链淀粉酶菌株的挑选及斜面培养)。 ：完成项目总体进度50%,菌株的复筛，包括(产普鲁兰酶菌株的筛选及斜面培养),葡萄糖标准曲线的测定,酶活测定方法的建立,并以酶活大小对菌株进行再次筛选。 ：完成项目总体进度80%,产酶条件的研究。包括：碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。并通过各中单因素试验确定发酵培养基的最佳碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。 2009、4—2009、5 ：完成项目总体进度100%,课题总结，撰写论文。 文献综述(包括：国内外研究理论、研究方法、进展情况、存在问题、参考依据等) 自从1961年Bender H.等人在研究一株产气气杆菌Aerobacter aerogenes(典型菌为肺炎克雷伯氏杆菌)时首次发现普鲁兰酶后，国际上对产生这种酶的微生物进行了广泛研究，发现许多微生物可以产生此酶，并筛选出一些适用于工业化生产的优良菌株。随着该酶的应用发展，对耐热性普鲁兰酶的研究也逐渐增多，已成功克隆并表达了该酶的基因。国内1976年开始对一株产气气杆菌(Aerobacteraerogenes 10016)的普鲁兰酶进行研究，对该菌株的产酶条件、酶的分离提取及酶学性质作了报道，并研究了该酶的食品级提取技术。此外，陈朝银、刘涛等人从云南温泉水样中筛选到一株产普鲁兰酶高温栖热菌菌株，通过诱导等实验将该酶的酶活从提高到170u/mL，酶产量提高了近2500倍左右，酶的最适作用温度及pH分别是75℃和，具有一定的耐热和耐酸特性。 陈金全等从温泉水样中筛选到一株产耐热耐酸普鲁兰酶的野生菌株，并根据形态、生理生化特征、细胞化学组分分析及16SrDNA序列比对、基因组DNA的G+C摩尔百分含量、同源性比对等实验，鉴定其为脂环酸芽抱杆菌属(Alicyclobacillus)的一个新种，所产酶最适作用温度为60℃，最适pH值，具有较好的耐热耐酸特性。杨云娟等利用毕赤酵母成功构建了普鲁兰酶表达量较高的基因工程菌，摇瓶发酵酶活可达，最佳发酵条件下产量可达 .酶的最适作用温度为600C，最适pH值，具有较好的耐热耐酸性。目前我国仍没有具备独立生产普鲁兰酶能力的厂商，要实现低成本、国产化的生产，还有很长的路要走。 技术应用于耐热脱支酶的研究，使耐热异淀粉酶的研究有了很大发展。Coleman等人将嗜热厌氧菌T. brockii普鲁兰酶基因克隆到中得到的克隆子分泌的普鲁兰酶数量高于出发菌株，Okada等人将Bacillus Steanther, onhiu:中编码热稳定异淀粉酶的基因克隆到:中，得到的转化菌株其异淀粉酶能在60 ℃稳定15分钟。Burchadf将。ostridium thermosulf urogenes DSM38%的嗜热异淀粉酶基因克隆并在中表达，所得酶的最适pH和最适温度与出发菌相同，而且在高温下仍能保持活性.Antranikiam等人将Pyrococcus舟riousous的异淀粉酶基因克隆到中并分离得到了酶蛋白。尽管如此，目前尚未有已将转基因的耐热性异淀粉酶工程菌应用到工业生产中的报道。众所周知，利用物理和化学诱变剂单独或复合处理微生物细胞是选育高产变种菌株行之有效的经典方法，它在为培育多种抗生素、氨基酸、核苷酸激酶(尤其是蛋白酶和淀粉酶)的高产变种菌株方面曾经起过极为重要的作用，至今仍然是方便易行和行之有效的方法之一。 主要参考文献： [1][美]惠斯特勒等编王雏文等译.淀粉的化学与工艺学[M].北京：中国食品出版社，1988 [2]张树政.酶制剂工业[M]. 北京: 科学出版社，1998 [3]邬显章.酶的工业生产技术[M]. 吉林: 吉林科学技术出版社，1988 [4]Taniguchi H, Sakano Y, Ohnishi M, Okada G(1985) Pullulanase[J].TanpakushitsuKakusan Koso. 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