肝素的制备与运用研究进展论文

肝素钠精制新工艺本工艺采用酶解结合氧化法精制肝素，在该过程中采用低温离心技术,解决在除酸性蛋白过程中，粗品肝素钠中残留杂蛋白在纯化过程中很难被除去的缺点。在粗品肝素钠中加入胰蛋白酶对这些杂蛋白进行酶解,再结合一次氧化除杂过程,从而提高精品肝素钠的效价和效价回收率。1、工艺流程2、溶解称取适量肝素钠粗品加质量分数3%左右NaCI溶液进行溶解。50℃水浴加热，用NaOH溶液调pH至静置2小时，过滤除不溶性杂质。3、酶解法除蛋白肝素在动物体内是以肝素-蛋白质复合物的形式存在，通过酶解或盐解去除复合物的蛋白质成分，游离肝素。但在实际生产过程中，复合物的解离，蛋白质的除去是不完全的，粗品中总存在数量不等的蛋白质。粗品肝素钠必须经过精制，可以进一步去除粗品中残存的结合蛋白质，不仅因杂蛋白的去除而提高效价，而且因被“掩蔽”的肝素活性得到释放而获得较高活性。为此，利用蛋白水解酶专一水解蛋白的特点，并结合调酸除蛋白和氧化除蛋白方法,采用酶解除蛋白法，该法能在除去蛋白质时较少影响肝素总效价。在肝素钠溶液中加入少量的胰蛋白酶，使残留在肝素中的少量蛋白质降解成小分子肽,从肝素-蛋白质复合物中解离出来，再结合调酸碱和氧化法除蛋白,制得精品肝素钠的效价和效加回收率均有不同程度提高。酶解反应条件：蛋白酶加入量， pH 7~9， 温度40℃，反应时间5h。4、调酸除蛋白在调酸除蛋白过程中，为防止肝素失活,加入亚硫酸氢钠作保护剂。在低温下离心脱除蛋白。5、氧化条件H2O2用量2/% ，温度25~27℃，时间15h。6、沉淀 将氧化液调，加人等量的95%乙醇沉淀。抽出上清液得沉淀物，将沉淀物慢慢加无水酒精或丙酮中脱水。7、干燥55℃，真空干燥3小时以上即得精品。采用酶解结合过氧化氢一次氧化的肝素钠精制工艺，产品较白，且效价和效价回收率均高于二次氧化方法，效价达150U/mg以上，效价回收率达95 %以上。

肝素 中文名称：肝素 英文名称：heparin 定义1：N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；糖类（二级学科） 定义2：N-硫酸化程度高和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖。是由D-β-葡糖醛酸（或L-α-艾杜糖醛酸）和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的黏多糖。由紧靠血管的肥大细胞产生，并贮存于肥大细胞的颗粒中，应一定的刺激而释放，具有抗凝血作用。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞结构与细胞外基质（二级学科） 1、抗凝血： （1）增强抗凝血酶3与凝血酶的亲和力，加速凝血酶的失活； （2）抑制血小板的粘附聚集； （3）增强蛋白c的活性，刺激血管内皮细胞释放抗凝物质和纤溶物质。 2、抑制血小板，增加血管壁的通透性，并可调控血管新生。 3、具有调血脂的作用。 4、可作用于补体系统的多个环节，以抑制系统过度激活。与此相关，肝素还具有抗炎、抗过敏的作用。 1、肝素是需要迅速达到抗凝作用的首选药物，可用于外科预防血栓形成以及妊娠者的抗凝治疗，对于急性心肌梗死患者，可用肝素预防病人发生静脉栓栓塞病，并可预防大块的前壁透壁性心肌梗死病人发生动脉栓塞等。 2、肝素的另一重要临床应用是在心脏、手术和肾脏透析时维持血液体外循环畅通。 3、用于治疗各种原因引起的弥散性血管内凝血（DIC），也用于治疗肾小球肾炎、肾病综合征、类风湿性关节炎等。 在临床上肝素广泛应用于防治血栓栓塞性疾病、弥漫性血管内凝血的早期治疗及体外抗凝。临床应用及研究显示:肝素除具有抗凝作用外，还具有多种生物活性和临床用途。现简述如下。 心绞痛 与阿司匹林合用治疗不稳定型心绞痛 为观察阿司匹林加肝素和单独接受阿司匹林治疗的不稳定型心绞痛病人发生心肌梗死（MI）和死亡的危险性 ，病人被随机分为阿司匹林加肝素组和单独接受阿司匹林组。研究报告了心肌梗死和死亡的发生率。不稳定型心绞痛病人接受阿司匹林加肝素治疗与单独接受阿司匹林治疗相比较，随机治疗过程中MI或死亡的总的相对危险性（RR）为［95%可信限（CI），～］。阿司匹林加肝素治疗与单独接受阿司匹林治疗的病人比较，次要终点的总的RR为:反复缺血性疼痛（95%CI，～），随机治疗后2～12周的MI或死亡（95%CI，～）;血管再通术（95%CI，～）;重要出血（95%CI，～）。所有试验结果均未发现显著的统计学异质性。结论:不稳定型心绞痛病人接受阿司匹林加肝素治疗比单独接受阿司匹林治疗的MI或死亡的危险性下降33%，足够的证据表明:大部分不稳定型心绞痛病人应同时接受阿司匹林和肝素治疗。 晶体上皮细胞 抑制晶体上皮细胞的增殖或移行 后囊混浊是白内障囊外摘出术的首要并发症，肝素对晶体上皮细胞的增殖或移行有抑制作用。晶体上皮细胞的增殖、移行和纤维化在后囊混浊的发生中起重要作用 。目前，后囊混浊的预防以手术中彻底清除晶体上皮细胞及皮质、植入双凸或后凸的后房型人工晶体为主。其治疗主要靠激光后囊膜切开。研究发现，Dispase（一种中性蛋白酶）、依地酸（EDTA）、肝素及抗代谢药5-氟尿嘧啶、柔红霉素、秋水仙碱、丝裂霉素等对晶体上皮细胞的移行和（或）增殖有抑制作用。多种细胞因子对晶体上皮细胞的增殖或抑制作用也引人注目。 硬脑膜窦血栓 近年来，国外在肝素和组织纤溶酶原激活物（tPA）联用治疗硬脑膜窦血栓形成中取得一定进展。组织纤溶酶原激活物（tPA）较尿激酶安全，与小分子肝素联合应用较单用肝素药物效果好。 溃疡性结肠炎 对溃疡性结肠炎（UC）发病机制中免疫异常、感染、氧自由基损伤等研究较多。此外，研究发现溃疡性结肠炎病人血中，WF、抗心磷脂抗体、凝血酶原片段1+2、凝血酶抗凝血酶复合物、D-二聚体、组织因子途径抑制剂、血小板球蛋白等血栓前状态指标与健康对照者比较差异有显著性，并有肝素成功治疗难治性UC的报告 ，提示微血栓的形成可能是UC的重要发病机制之一。 急性脑梗塞 为观察低分子肝素的治疗急性脑梗塞的临床疗效和对血流动力学参数的影响，应用低分子肝素（LMWH）治疗急性脑梗塞患者30例（观察组），并以常规治疗急性脑梗塞患者30例作为对照组（控制血压、应用钙拮抗剂、清理自由基、应用脑代谢激活剂等） 。结果:观察组总有效率为90%，明显高于对照组的（P<）。治疗前、后神经功能缺损评分比较，观察组降低数明显高于对照组（P<）。对观察组患者治疗后全血粘度、血浆比粘度、还原比粘度、血沉以及血沉方程K值测定，均较治疗前明显降低（P<）。结论:低分子肝素治疗急性脑梗塞患者临床应用安全，疗效可靠，具有较强的抗凝、抗栓和降低血液粘度作用。 严重烧伤 严重烧伤并发全身多器官功能障碍，病死率较高，创面愈合后常留下瘢痕及其挛缩，并发不同程度的畸形或功能障碍。氨基葡聚糖（GAG）用于治疗烧伤已有许多临床、动物实验研究 ，已初步揭示其抗凝、抗感染、促进血管再生等作用的机制。这些机制有利于组织修复及再上皮化。GAG有肝素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白、硫酸4、6软骨素及透明质酸等，肝素含有大量硫酸基，是酸性最强的GAG，主要经肠外途径、局部外用和吸入等方式给药，也有制成胶丸口服，或与人工合成皮肤合用，或作为人工合成皮肤的原料。肝素治疗烧伤可以缓解疼痛、抗凝、抑制炎症反应、促进血管再生，恢复局部血供，并能影响胶原的合成和降解，创面愈合后皮肤光滑，减轻瘢痕及瘢痕挛缩。肝素还能保护肠道屏障功能，减少细菌移位的发生;保护肺组织，改善肺功能;保护及改善肾功能;提高机体免疫力，预防感染。局部应用肝素是治疗烧伤的一种有效手段。 其他 肝素在肿瘤应用方面:肝素的抗癌机制有增强免疫系统功能、抗增生、抑制肿瘤细胞的转移等。肝素可与类固醇类药物合用治疗肿瘤，还可用于放疗综合征、肿瘤并发症的治疗。肝素对炎症过程的影响:肝素与肥大细胞的关系、肝素抑制白细胞粘附于血管内皮及其随后向组织的迁移等方面表明，肝素对炎症的作用机制是有影响的。 编辑本段低分子量肝素 低分子量肝素的活性/抗凝血活性的比值为～，而普通的肝素为1，保持了肝素的抗血栓作用而降低了出血的危险。具有半衰期长，生物利用度高等优点，正广泛应用于血栓栓塞性疾病的预防及治疗，其有效性和安全性均优于普通肝素，量效关系明确，可用固定剂量无需实验室监测调整剂量，应用方便。有实验证明:来自水蛭素的Hiru-log多肽比肝素抗凝安全。低分子量肝素可以降低鼠移植肾脏免疫活性 。方法:异体移植受体皮下注射低分子量肝素2mg/（kg·d），每周5天，持续24周。结果:低分子量肝素治疗后移植肾单核吞噬细胞，T细胞的浸润减少，主要组织相容性抗原M HC-Ⅱ的表达降低。实验结果表明:低分子量肝素可以降低鼠移植肾脏免疫活性从而减轻移植肾脏慢性排斥反应。 编辑本段用法 肝素的临床常用方法为注射给药，而呼吸系统疾病可采取雾化吸入达到治疗目的。为评价肝素通过超声雾化吸入治疗呼吸系统疾病的疗效 ，将其按一定剂量加生理盐水20～40ml，每日1～2次超声雾化吸入。结果:肝素总有效率94%，其超声雾化吸入的用药途径，在临床应用中证明确有疗效。 在心急梗塞或血管血栓形成的治疗同时,应同时检测活化部分凝血活酶时间(APTT,此为目前推荐应用的内源凝血系统的筛选试验,亦是检测肝素治疗的首选指标),力求将APTT控制在正常值的倍.(正常值为32~43s). 编辑本段不良反应 肝素的主要不良反应是易引起自发性出血，表现为各种黏膜出血、关节腔积血和伤口出血等，而肝素诱导的血小板减少症是一种药物诱导的血小板减少症，是肝素治疗中的一种严重并发症。药物所致的血小板减少症主要分为两型 : （1）骨髓被药物毒性作用抑制所致; （2）药物通过免疫机制破坏血小板所致。后者中以肝素、奎宁、奎尼丁、金盐与磺胺类药物发病较高。临床症状极不一致，血小板减少至（～80）×10 9 /L，轻者无症状，重者可因颅内出血或因肝素导致内皮细胞的免疫损害，合并危及生命的肺栓塞与动脉血栓形成致死。诊断主要依靠: （1）药物治疗期间血小板减少; （2）停药后血小板减少消除。严重患者血清中可检出药物依赖性血小板抗体，但敏感性不高而常呈假阴性。治疗的关键是:立即停用相关药物，严重病例可使用输注血小板、激素、丙球甚或血浆置换。肝素不宜用于溶血尿毒综合征。溶血尿毒综合征（HUS）是小儿急性肾功能衰竭常见病因之一。儿童期典型腹泻后HUS90%由出血性大肠杆菌O157:H7引起。目前认为 HUS发病的中心环节是内毒素启动内皮细胞受损，继而出现凝血系统激活，炎症介质释放，内皮素-一氧化氮轴紊乱等多环节参与发病。全身各器官均有不同程度受累，主要是肾脏，其次是脑。治疗上强调支持疗法和早期透析，典型HUS的治疗不提倡应用肝素、抗生素和激素。不典型HUS可适用血浆置换，有一定疗效。 编辑本段肝素的特效解毒剂 鱼精蛋白

肝素酶具有许多重要的医药用途，主要用途如下：（1）制备低分子和超低分子肝素低分子量肝素和超低分子量肝素具有抗凝血功能，在抑制血管增生，阻止肿瘤转移，治疗癌症，抗过敏等方面也有特殊的功效。利用肝素酶生产低分子肝素条件比较温和，环境友好而且不会作用于硫酸基团，是理想的工业生产方法。（2）体外循环血液中肝素的消除某些重症病人例如尿毒症患者在手术过程中需要进行血液的体外循环，在体外循环的过程中为防止血液凝固需要加入肝素。为防止肝素残存在血液中影响血液凝固，临床上需要加入鱼精蛋白来中和肝素。临床研究发现鱼精蛋白严重损害血小板，影响动脉血压得稳定，而肝素酶没有这种副作用，因此是理想的替代材料。需要注意的是，由于肝素酶对细胞外基质也有降解作用，因此用于血液肝素化去除的肝素酶也需进行固定化，并且要求肝素酶不能有免疫原性。（3）肝素精确结构的确定将待分析的肝素先用来自肝素黄杆菌的经过纯化所得到的肝素酶进行降解，得到四糖产物，然后再用同样来自肝素黄杆菌的经过纯化所得到的乙酰肝素酶进行深层降解处理，通过对最终的产物分析，就可以推测出相应的肝素的结构。（4）制备抗肿瘤药物由于肝素酶与肿瘤转移密切相关，因而越来越受到重视。许多研究人员试图寻找肝素酶的抑制剂，如硫酸海带多糖等，抑制肿瘤的生长和转移。（5）抑制新血管生成及碱性成纤维细胞生长因子介导血管内皮细胞的增殖新血管的形成关系到组织的分化，伤口的愈合和肿瘤的转移。大多数的研究者都把精力放在肝素类物质在新血管的形成过程中所起的作用。其实众多的体外还是体内的新血管生成及碱性成纤维细胞生长因子介导血管内皮细胞的增殖实验表明，肝素酶I和III（不包括肝素酶II）可以有效地抑制它们的发生。其作用的机理可能是在过程中起重要作用的乙酰肝素的某一部分被肝素酶切除，使新血管的形成得到抑制。（6）肝素酶在产科领域中的应用胚泡植入需要子宫内膜细胞表面成分发生相应的变化。肝素酶能调节胚泡滋养层细胞，使其更易粘附和植入子宫内膜。同时，肝素的侧链可结合多种活性因子:如表皮生长因子，血管内皮细胞生长因子，肝素结合的表皮生长样因子及其他生长因子与细胞因子。肝素酶分解肝素侧链后，这些因子释放，可以促进滋养细胞分裂、增殖和血管生成。胎盘组织是一种细胞滋养细胞侵入子宫内膜后形成的特殊结构，滋养细胞有很强的侵入能力。肝素酶通过分解肝素侧链，释放出细胞因子，促进滋养细胞侵入血管基底膜，使新生血管形成，为胚胎组织生长发育奠定基础。肝素酶与妊娠的成功和分娩的发动也有一定的关系。

参考教材《动物药物提取制备实用技术》 1．备料：取冰冻牛肺脏融化后，剪去主气管和较大的气管，然后剪成长条，用3毫米绞板绞磨成肉糜状，净肺糜量为毛肺的70％～80％。2．自溶：取牛肺糜300千克，加水150升，搅拌均匀，加温至45℃，加入6升甲苯，在39～41℃保温自溶20小时，每半小时搅拌1次。3．提取：将27千克硫酸铵溶于90升水中，加入自溶液内，用40％氢氧化钠溶液调至pH值～。用水浴加热至50℃，保温搅拌小时开始过滤；滤饼加100升水、6千克硫酸铵再提取1次。弃去滤渣，合并2次提取液4．酶解：提取液按每公斤牛肺重量加克2709碱性蛋白酶PH控制在在50度条件中反应小时；调盐度4度升温到90度保温15分钟过滤后续工艺经吸附-洗涤-洗脱-酒精沉淀-干燥-干燥品盐水稀释过滤-再次吸附-洗脱-酒精沉淀-干燥即可-得至3吨牛肺提取1亿单位的牛肺肝素钠肝素钠提取专利 2、利用废脱附盐水加工粗品肝素钠的方法 3、一种吸附肝素钠专用树脂的生产方法 4、肝素的喷雾干燥方法 5、生产肝素的方法 6、一种肝素及其制备方法 7、利用猪、牛、羊肺沉淀法生产肝素钠 8、利用生产肝素钠后废液提取冠心舒工艺 9、用活化生物酶解法提取肝素钠的生产工艺 10、免树脂长链季铵盐沉淀法提取肝素钠 11、低分子肝素及其制备方法 12、一种用综合生物法提取肝素钠的新工艺 13、一种低亚硝酸盐含量的低分子肝素钙的制备方法 14、一种肝素钠及其制备方法 15、一种肝素化合物及其制备方法和应用 16、肝素银的制备及其应用 17、一种制备低分子量肝素的方法 18、含有肝素锌的组合物及其应用 19、低分子肝素纯化方法 20、利用动物肺提取肝素钠粗品的制备工艺 21、酶解法生产肝素钠 22、一种从牛肺中提取抑肽酶和肝素钠的联产工艺 23、一种低分子量肝素钠及其亲和层析制备方法 24、肝素钠粗品生产方法 25、粗品肝素钠分离纯化为高纯度肝素钠的方法 26、一种同步提取肝素钠和猪肠粘膜抗菌肽的方法 27、肝素钠副产物中分离提纯硫酸皮肤素和低分子硫酸乙酰肝素的方法 28、一种依诺肝素钠的纯化生产方法 29、低分子肝素或者其盐、含有其的医药组合物及其制造方法 30、肝素钠生产工艺方法 31、低分子量的肝素及其制备方法 32、肝素钠吸附树脂中残留有效成分的提取方法 33、使用HPLC定量测定具体组成肝素或低分子量肝素的方法 34、采用卵磷脂液膜分离法提取肝素的方法 35、一种低分子量肝素钙生产工艺 36、壳聚糖及其衍生物与低分子肝素形成的复合物及制剂与制备方法 37、一种类肝素的制备方法 38、肝素钠生产中所用的液体射流吸附、解析装置 39、肝素提取装置 40、一种利用肠衣生产肝素的设备 41、低分子肝素钠（钙）及其制备方法 肝素钠提取文献资料 42、酶降解法精制肝素钠 43、牛肺肝素钠提取工艺研究 44、浅谈肝素钠及其生产 45、提高肝素钠粗品效价的生产工艺 46、一种提高肝素钠收率和效价的方法 47、一种新型沉淀剂去除肝素钠中蛋白质的条件研究 48、影响肝素钠产量关键因子的研究 49、猪肺提取肝素钠新工艺 50、猪肺提取肝素钠新工艺 2 51、猪小肠生产肝素钠粗品技术的创新及应用 52、D-254树脂在肝素钠精制过程中的应用 53、凹凸棒土和活性炭除去肝素钠精品制备过程中杂质 54、层析技术在肝素钠纯化中的应用 55、沉淀剂YNB99-1在肝素钠精制中的应用 56、从牛肺提取精品肝素钠工艺的研究 57、从猪大肠腌液中提取肝素钠的研究 58、从猪小肠粘膜中提取肝素钠的生产技术改进 59、粗品肝素钠质量情况和效价范围的判断 60、对“肝素钠生产工艺”的补充 61、肝素钠粗品工业化高效生产工艺的探讨 62、肝素钠粗品生产工艺 63、肝素钠的三氯化铝精制工艺 64、肝素钠的生产及其存在的问题和解决的方法Ⅰ 65、肝素钠的生产及其存在的问题和解决的方法Ⅱ 66、肝素钠的生产及其存在的问题和解决的方法Ⅲ 67、肝素钠精制工艺研究 68、肝素钠的提取 69、肝素钠分离工艺研究 70、肝素钠简单生产工艺介绍 71、肝素钠精品生产工艺的改进 72、肝素钠精制工艺探讨 73、肝素钠精制工艺研究 1 74、肝素钠精制工艺研究 2 75、肝素钠精制工艺研究 3 76、肝素钠生产过程中对重金属的处理 77、肝素钠生产中间产物效价的检测 78、肝素钠树脂精制工艺的研究 79、肝素钠制备工艺研究 80、含高浓度无机盐的肝素钠废水的处理 81、均匀设计法筛选肝素钠的纯化条件 82、利用动物小肠提取肝素钠的技术及生产工艺