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【综述】几种用于发现未知病毒核酸序列的技术及其应用翁康生 病毒是引发人类传染性疾病的主要病原体之一, 它们极大地威胁着人类健康。目前还存在人类尚未认知或新出现的病毒, 随时可能严重危害人类健康安全〔1 - 3〕。及早地发现,鉴别未知的或新出现的病毒, 是有效的预防和控制的先决条件之一。因此, 建立、储备、改良、发展、乃至创新应用于发现、鉴别未知或新出现病毒的技术方法是十分必要的。近20 多年来, 常采用传统的微生物学技术方法和现代分子生物学技术方法相结合的途径, 发现和鉴别未知病毒。通过细胞培养的方法分离病毒、电镜观察、用已知病毒的抗血清建立的免疫学方法作排他性检测、用已知病毒核酸序列建立的PCR、杂交等方法, 作特异核酸序列的检测、用分子生物学技术获得未知病毒核酸序列, 查询基因数据库, 检出并确定未知病毒基因组序列, 最终发现鉴别出未知病毒。对于无法用细胞分离培养的未知病毒, 有的采用免疫学与分子生物学技术相结合, 筛选获取病毒特异抗原编码基因的克隆, 进而发现鉴别出该病毒。更多的则是采用相应的分子生物学技术, 从被检样品中发现获取未知病毒的核酸序列,进而发现鉴别未知病毒。无论未知病毒是否可以用细胞培养分离, 最终对其基因组序列的测定分析, 是鉴别和判断的决定性依据之一, 而获取未知病毒的核酸序列是前提条件。从少量样品中, 从高度复杂的宿主细胞核酸物质中, 分离、扩增、获取足够量的无基因序列资料的未知病毒的核酸片段, 供进一步克隆、测序、生物信息学分析, 是用分子生物学技术发现、鉴别未知和新出现病毒的关键之一〔4〕, 也是最终测定分析, 拼接出未知和新出现病毒基因组序列的瓶颈步骤。病毒所携核酸物质有DNA 和RNA 之分, 可采用的技术方法也有所不同, 现将有关技术与其应用作一简介, 以供参考。1 代表性差异分析法代表性差异分析法是为寻找分析两个生物样品复杂的基因组间有何差异而发展建立起来的分子生物学技术方法, 并不断得到演化, 发展和应用。病毒感染宿主细胞后, 与未感染的同类细胞相比, 二者核酸物质间的差异主要在于是否存在病毒核酸。消减去二者核酸间相同序列的背景部分, 扩增、比较、选取余下可能存在差异的部分, 进一步分析以发现未知病毒的核酸序列。病毒的核酸结构各有不同, 可选用相应的代表性差异分析法, 见表1 。111 DNA 代表性差异分析法(DNA Representation differenceanalysis , DNA RDA)此方法是Lisitsyn 等〔5〕利用核酸消减杂交技术〔6〕、PCR 方法和双链DNA 热变性后互补链退火复性的二级动力学原理〔7 - 8〕作者单位:上海市疾病预防控制中心 200336表1 病毒核酸类型与各代表性差异分析法的选用病毒核酸类型DNA RDA c DNA RDA非rRNA 序列6 核苷酸引导c DNA RDAds DNA 线状√ds DNA 环状√ss RNA polyA( + ) √ss RNA polyA( - ) 3 √ds RNA polyA( - ) √ 3 负链ss RNA polyA( - ) 视病毒在宿主细胞的转录机制而定。而建立的。方法中将需分析的样品DNA(Test DNA ,T- DNA) 和对照DNA(Driver DNA ,D - DNA) 设为二组,分别用同一种限制性内切酶酶切处理,并接上5′端去磷酸化的人工接头,补齐接头后,加入与接头序列互补的引物作PCR 扩增。切除扩增产物上的人工接头后,切出的T - DNA 连上第二种人工接头,变性后与过量的变性D - DNA 杂交。通过杂交,消减去T- DNA 中与D - DNA 中同源的核酸序列,而只存在于T - DNA 中的靶序列DNA(Target DNA) 则自我退火复性,其两端连有第二种人工接头。加入与第二种接头互补的引物作PCR ,只有靶序列DNA呈指数扩增,因而得到进一步富集。进过如此重复的几个轮回后,以电泳检测比较T- DNA 和D - DNA ,将T- DNA 中呈现的差异部分作分离,克隆,序列分析。Lisitsyn 等以10μg 人淋巴细胞基因组DNA 作为D - DNA ,在相同的人DNA 中加入相当于单拷贝量的120 pg 腺病毒DNA作T- DNA。以此作为实验模型,用DNA 代表性差异分析法成功的寻找、鉴定出外加入的腺病毒DNA 序列。应用此技术,Chang 等〔9〕在艾滋病相关的卡波西肉瘤(Kaposis Sarcoma) 中发现一段类似人类疱疹病毒的基因, 并由此发现一种新的病毒HPV8。以后人们又以此技术发现鉴定了HPV6、TTV 病毒、黄热病毒样基因组、MDV 等〔10 - 13〕DNA 病毒。112 cDNA 代表性差异分析法(cDNA Representation differenceanalysis , cDNA RDA)Hubank 等〔14〕针对mRNA 所含序列相对简单的特点,提出了cDNA 代表性差异分析法。它的基本原理与DNA RDA 相同,主要不同在于,采用识别4 核苷酸序列的限制性内切酶,它的识别位点在mRNA 反转录成的cDNA 中出现的频率更高,平均酶切片段长度约256 bp ,保证了cDNA 序列群中绝大多数序列,至少被切出一个片段可扩增,供差异分析,分离鉴定。cDNA RDA 技术相对经济,可高效灵敏地用于非常少的起始材料而获得结果〔15〕。具有polyA( + ) - RNA 病毒,其核酸可类似于mRNA 分离纯化,因此可应用此技术。利用cDNA RDA技术,发现鉴定了TiV、MenV ,等〔16 ,17〕RNA 病毒。113 非rRNA 序列6 聚核苷酸引导反转录的cDNA RDA中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13 ·317 ·© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. ( - ) - RNA 病毒,其核酸物质不似于mRNA ,需和宿主细胞总RNA 同时分离,并用随机引物作反转录。因为宿主细胞总RNA 中rRNA 约占80 % ,由于竞争反应、靶序列信号被湮灭等原因,从这样的总RNA 抽提物中,用随机6 聚核苷酸引物引导反转录的cDNA RDA 技术,发现鉴别polyA( - ) - RNA 病毒核酸序列是困难的。Endoh 等〔18〕罗列了6 聚核苷酸所有可能的排列组合,共计4 096 个序列模式,以大鼠18S、518S、28S 等rRNA、微卫星重复序列、SARS - CoV、BI - 3 病毒等的序列数据为模型,筛选出在rRNA 序列中出现频率极低或不出现的6 聚核苷酸序列模式共96 种。将这些序列分别合成并混合后,称之为非rRNA 序列6 聚核苷酸引物。生物信息学分析96 种序列模式在哺乳动物病毒科具代表性的1 791 个病毒基因组序列中出现的频率,数据表明,非rRNA 序列6 核苷酸引物可引导绝大多数病毒的cDNA 合成。分别用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物和随机6 核苷酸引物作cDNA 反转录效率、cDNA RDA 试验,结果表明,二类引物对人工合成的RNA (二类引物在其序列中出现的频率相似) 反转录效率几乎相等,而前者对细胞总RNA反转录效率远低于随机引物。用二类引物作cDNA RDA ,检测人工合成的RNA ,前者灵敏度是用随机引物的30 倍。在模拟实验中用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物引导反转录,串联cDNARDA 技术,检测鉴别出感染细胞的BI - 3 和SRAS - Cov 核酸序列片段。此方法能从1μg 总RNA 中检测出3 ng 的外来RNA ,其检测灵敏度不及普通的PCR 检测方法,但对于检测鉴别在宿主细胞中复制,但不知其基因序列的poly A( - ) - RNA 病毒而言,也是一个可选择的方法。114 抑制消减杂交cDNA RDA 技术结合消减杂交和PCR 抑制作用〔19〕的技术原理,Diatchenks 等〔20〕等发展出了抑制消减杂交技术( suppressionsubtractive hybridization ,SSH) 。与前两种RDA 技术不同点在于,SSH 技术将内切酶酶切处理的T - cDNA 分为两份,分别接上不同序列的去磷酸化的接头1 和2 ,分别于过量的D - cDNA作第一轮杂交。杂交过程中两组中的单链T - cDNA 浓度趋同,T- cDNA 中的非靶序列单链cDNA 与D - cDNA 中相应序列形成杂交双链而被消减, T - cDNA 中差异表达的单链cDNA被显著富集。合并一轮杂交物,加入过量变性D - cDNA ,作第二轮杂交。合并的二组份一轮杂交物中剩下的趋同化、经消减杂交后的单链T - cDNA 能互补杂交, 可以形成: 原组内T- cDNA 单链间的杂交、T - cDNA 与D - cDNA 单链间的杂交、二组间T- cDNA 单链间的杂交。补齐杂交反应后双链cD2NA 末端,用分别与接头1 和2 的外侧部分序列互补的寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。二组份间T- cDNA 互补单链杂交物,因两端分别具有接头1 和2 ,可被指数扩增;T - cDNA 与D -cDNA 杂交物和剩余单链T- cDNA ,因一端具接头序列,被线性扩增;而同组间T- cDNA 杂交物两端具反转重复长序列,因抑制性PCR 效应,在PCR 反应循环中分子内退火形成稳定的“锅柄结构”〔19〕而不被扩增。因此,SSH 技术通过二轮消减杂交和抑制性PCR 特异扩增,使假阳性大大降低,提高了检出低丰度靶mRNA 的灵敏度。Hu 等〔21〕应用SSH 技术,结合反转录酶的模板切换(tem2plate - switching) 功能, 以HCV RNA 阳性血清体外感染的人MOLT- 4 急性淋巴母细胞白血病T 细胞系为模型,通过反转录合成全长cDNA、抑制性消减杂交、消减的cDNA 文库构建、反相斑点杂交筛选,在被筛的96 个克隆里,T- cDNA 探针杂交呈特异阳性的16 克隆中,序列分析后得到4 个插入HCV 序列的克隆。2 非特异多重引导滚环式扩增法乳头瘤病毒、痘病毒等,其基因物质为环状DNA 分子。在事前未知基因序列的情况下,发现和鉴别这类病毒核酸序列还可选择非特异多重引导滚环式扩增法(multiply primed rolling -circle amplification ,RCA) ,扩增、分离、获取其基因片段供进一步分析。自然状况下,环状DNA 经常以滚环方式进行复制。Dean等〔22〕应用随机6 聚核苷酸作引物,加入φ29 DNA 聚合酶,以质粒DNA 和噬菌体DNA 为模型,建立了多重引物引导的滚环式扩增法。φ29 DNA 聚合酶可长距离( > 70 000 nt) 地结合于DNA模板,进行链置换DNA 合成。而随机6 聚核苷酸引物可多位点的与单链环状DNA 互补复性。在φ29 DNA 聚合酶作用下,以随机引物引导,合成与模板互补的DNA 链。当合成链延伸到与模板结合的随机引物5′端时,在φ29 DNA 聚合酶的链置换活性作用下,下游被延伸的随机引物链被“甩”出模板。而上游的延伸链继续在环状模板上复制合成。同时,被从单链环状模板上“甩”出的互补链,又成为新的模板,随机引物与之结合,在φ29 DNA 聚合酶作用下,继续以枝杈的形式进行链延伸和链置换,最后以双链DNA 串联体形式释放。用此法可使1 ng 纯pCU18 环状DNA 模板延展式地扩增至107倍。Rector 等〔23〕以此原理建立了不依赖已知的特定基因序列(非序列依赖性) 的多重引导滚环式扩增环状DNA 病毒基因组方法,并应用其扩增获取了HPV 16 的基因组DNA。在接近实样的试验样品中,由于稀释倍数和环状DNA 分子较大等原因,将HPV 16 基因组DNA 扩增了214 ×104 倍。3 病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增病毒核酸可包裹于病毒外壳内,病毒的蛋白外壳或脂膜对病毒核酸具有保护作用。而病毒颗粒具有不同于细菌或其他真核细胞的理化特性。利用这样的特点Allender 等〔24〕和Stang等〔25〕各自建立了病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增方法(sequence - independent amplification) 。两种方法的共同点在于,依据病毒颗粒小、具一定密度,用0122μm 滤器过滤、或再串上超速密度梯度离心,从样品中分离出病毒颗粒,DNA 酶酶解游离的DNA ,裂解病毒颗粒,抽提获取较纯的病毒颗粒相关核酸。Allender 等〔24〕借鉴RDA 原理,对病毒颗粒相关核酸用限制性内切酶酶切后,作非序列依赖性单引物PCR 扩增( sequence -independent single primer amplification ,SISPA) :将抽提获取的DNA或RNA 分别补齐,合成第二链DNA ,或反转录,合成双链cDNA。限制性内切酶酶切后,酶切片段两端连接一种接头,并以与接头同序列的单一寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。扩增产物进一步克隆与序列分析。用此法检验HBV 阳性血清和GBV - B 阳性血清样品,结果在相当于106/ ml 个基因组拷贝浓度的50μl样品中,可重复试验检出相应的病毒基因片段。Stang 等〔25〕则在得到双链DNA 或双链cDNA 后加入k - 随机引物,此种引物5′端含有20 个固定序列的核苷酸,3′端则有·318 · 中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 核苷酸随机简并序列。与变性模板退火时,6 核苷酸随机简并序列随机地与模板相应序列互补退火,在T4 DNA聚合酶作用下作链延伸。然后在延伸产物中加入k - 随机引物中固定序列部分的20 寡核苷酸作引物,进行PCR 扩增。扩增产物电泳分析、克隆、测序。用此方法检验由实时- PCR 定量,包括病毒颗粒相关核酸及游离核酸在内的病毒基因组拷贝数为109/ ml 的Cox - 3 和MAV - 1 培养物。前者的12 克隆中,9 个克隆插入有肠道病毒的四个不同区域的同源基因片段;而6 个MAV - 1 中分离的克隆内,5 个含有99 % 同源MAV - 1 基因片段。基于病毒颗粒分离纯化、DNase 处理、病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增,获取、鉴定未知病毒的基因片段,尽管灵敏度不够高,但其实验时间较短,步骤相对简单,对于病毒拷贝数高,时间紧急的样品鉴别,是较适宜的一套方法。病毒的种类、结构、特性多种多样,感染病毒后需要检验的样品又各不相同,因此用于发现鉴别未知病毒的核酸序列的技术,也不是固定不变和完全通用的。以上的技术方法各有优缺点和适用范围。而针对扩增获取未知病毒基因组序列片断,这一发现鉴定未知病毒的分子生物学技术的要点或瓶颈,必然还会有新的改进、创新技术出现,将会更快、更灵敏、更简便、更准确的发现鉴别未知病毒。参 考 文 献〔1〕 Drosten C , Gunther S , Preiser W, et al1 Identification of novel corona2virus in patients with severe acute respiratory syndrome1 N Engl J Med ,2003 , 348 : 1967 - 19761〔2〕 ven den Hoogen BG, de Jong JC , Groen J , et al , A newly discoveredhuman pneumovirus isolated from young children with respiratory tractdisease1 Nat Med , 2001 , 7 : 719 - 7241〔3〕 Fouchier RA , Hartwig NG, Bestebroer TM, et al1 A previously unde2scribed coronavirus associated with respiratory disease in human1 ProcNatl Acad Sci U S A , 2004 , 101 : 6212 - 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中国预防医学杂志，其实都还行，望采纳
解放军预防医学
《解放军预防医学杂志》（双月刊）创刊于1983年，是由中国人民解放军总后勤部卫生部主管、军事医学科学院卫生学环境医学研究所和解放军预防医学中心主办的预防医学学术性刊物，是面向国内外公开发行的中国自然科学...
标题中没有“不公平”，但是摘要或者关键词中有。序号 篇名 作者 刊名 年/期 1 2404例农民工急诊医疗现状调查与对策研究 蒋树源 医学与哲学(人文社会医学版) 2008/10 2 我国城镇卫生筹资公平性研究——基于医疗保健支出累进度的测算 吕文洁 财经研究 2009/02 3 医疗保险制度公平:国内近年研究的若干进展 张立 财经政法资讯 2006/04 4 我国当前城乡医疗保障制度的衔接问题探析 彭明春 科技信息(学术研究) 2008/36 5 我国医疗卫生服务体制改革问题分析——基于公平与效率视域的分析 罗娟 劳动保障世界 2008/11 6 中国农村医疗筹资公平性研究——基于全国八个农业县医疗筹资系统的实证研究 王晶 社会学研究 2008/05 7 中国农村医疗保险制度的现状和建议 李二曼 中国新技术新产品 2008/08 8 我国卫生保健服务不公平性的主要表现及对策 孙喜琢 中国医院管理 2008/08 9 从分散到统一:荷兰基本医疗保险制度改革对我国的启示 尹莉娟 中国卫生事业管理 2008/02 10 城镇职工基本医疗保险个人账户的公平性与效率分析 李跃平 中国全科医学 2008/05 11 台湾医疗健保制度之公平性:一个初步分析 李瑞全 医学与哲学(人文社会医学版) 2007/12 12 从社会和谐的角度看待现行的医疗保险制度 刘穗 中医药管理杂志 2007/09 13 试析我国医疗保障制度的公平性 张茂松 中州学刊 2007/05 14 我国社会保险制度公平性刍议 冉岚 中国经贸导刊 2007/17 15 新型农村合作医疗保险制度问题及建议 花俊 合作经济与科技 2007/19 16 用正义分配理论分析我国城镇职工基本医疗保险的公平性 刘平 中国全科医学 2007/13 17 浅析农村公共医疗卫生的公平性 何珩 农村经济与科技 2007/06 18 我国城乡贫困人口医疗保障研究 房莉杰 人口学刊 2007/02 19 我国医疗卫生服务如何不公平? 汪大海 中国社会导刊 2006/24 20 我国医疗保障公平性研究 刘玉恩 中国卫生法制 2006/05 序号 篇名 作者 刊名 年/期 21 突破自愿性的困局:新型农村合作医疗中参合的激励机制与可持续性发展 方黎明 中国农村观察 2006/04 22 社会保障制度的不公平对收入分配公平性的负效应分析 袁琳琳 商场现代化 2006/24 23 我国城镇职工基本医疗保险公平性存在的问题及原因分析 刘平 中国全科医学 2006/09 24 我国卫生服务公平性探析 刘玉恩 医院管理论坛 2006/04 25 对医疗卫生改革与发展的若干思考 郭宝才 中国卫生资源 2006/02 26 政策导向、汲取能力与卫生公平 王绍光 中国社会科学 2005/06 27 我国医院实行三级价格歧视的理论研究 王文祥 卫生经济研究 2005/10 28 社会医疗保险公平性与政府保险政策建议研究 吴传俭 中国卫生经济 2005/04 29 现行医疗保险制度的缺失及对策 李凯峰 中国卫生经济 2005/06 30 重视贫困问题和不公平性的研究 胡善联 卫生经济研究 2004/08 号 篇名 作者 刊名 年/期 1 我国现行三种医疗保险制度的现状及并轨的框架研究 唐尧根 中国医药技术经济与管理 2008/09 2 我国城镇基本医疗保险改革现状的分析 钱秋华 现代商业 2008/33 3 农村医疗保险现状与对策 马侠 现代经济信息 2008/08 4 浅谈灵活就业人员医疗保险现状与对策 张炜 内蒙古科技与经济 2008/14 5 长春市老年人医疗保险制度的现状及改革措施 李柏昌 中国老年学杂志 2008/14 6 浅谈基本医疗保险制度现状及存在的主要问题 孙晓谦 内蒙古统计 2008/04 7 中国农村医疗保险制度的现状和建议 李二曼 中国新技术新产品 2008/08 8 从老年人的卫生服务利用现状看社会医疗保险 张桂萍 中国实用医药 2008/25 9 灵活就业人员参加基本医疗保险的现状和对策 周静锋 卫生经济研究 2008/07 10 上海医疗保险现状问题和发展建议 鲍勇 中华全科医学 2008/08 11 国外医疗保险模式现状 庞浩 天津社会保险 2008/02 12 从水利事业单位医疗保险体系分析医疗保险现状 滕玉珊 黑龙江水利科技 2008/03 13 湘西州农村医疗保险现状、问题及对策研究 谢江 边疆经济与文化 2008/06 14 基于因子分析的我国城镇职工基本医疗保险现状的实证研究 周以林 中国卫生经济 2008/01 15 对我国社会医疗保险的若干思考——论我国社会医疗保险的现状、存在问题及完善思路 李琴 清江论坛 2008/01 16 昆山市流动人口医疗保险现状及其参保意愿分析 李存艳 中国全科医学 2008/09 17 浅议贫困农村医疗保险改革现状 阿木吉尔图 农业科技与信息 2008/10 18 青岛市医疗保险现状及发展策略 马涛 科技信息(科学教研) 2008/12 19 农村医疗保险的现状、问题及对策——以滁州市为例 黎娜 滁州学院学报 2008/01 20 福州市大学生医疗保险现状调查研究 王方刃 医学与社会 2008/01 序号 篇名 作者 刊名 年/期 21 医疗保险:中国现状、国际潮流及改革之路 杨宇霆 保险研究 2007/06 22 我国医疗保险现状分析及对策研究 王安红 华商 2007/24 23 浅析国内医疗责任保险发展现状 黄锐 中国卫生监督杂志 2007/06 24 大学生医疗保险制度现状、问题与对策 易建明 淮北煤炭师范学院学报(哲学社会科学版) 2007/05 25 我国大学生医疗保险制度现状及改革的探讨 蔡声霞 中国校医 2007/05 26 从老年人的医疗需求现状看社会医疗保险 王灿 科技广场 2007/08 27 我国医疗责任保险发展现状 张云林 中国医院 2007/09 28 我国学生医疗保险制度改革探索——北京大学学生医疗保险现状调查报告 江南 理论界 2007/10 29 我国医疗责任保险的现状及发展展望 冯华楠 沈阳工程学院学报(社会科学版) 2007/03 30 北京某三甲医院医疗保险自费项目的现状调查与分析 曾俊群 中国医院管理 2007/06 31 美国的医疗保险制度现状及引发的思考 张群 中国卫生经济 2007/06 32 商业医疗保险在我国城镇社会保障体系中的现状及完善对策 李丁页 海南金融 2007/05 33 医疗责任保险研究现状述评 王琬 湖北社会科学 2007/06 34 我国城镇职工基本医疗保险费用结算办法现状及对策研究 周钟进 中国卫生经济 2006/12 35 牡丹江市森工系统医疗保险现状分析 谷振春 中国卫生经济 2006/10 36 浅谈《国家基本医疗保险药品目录》使用现状与改进建议 高巍然 卫生软科学 2006/06 37 高校学生医疗保险制度改革的现状和方向探析 李均 经济师 2006/12 38 太原市城市低保人群医疗保险现状研究及对策建议 芦国庆 中共太原市委党校学报 2006/S1 39 我国医疗职业责任保险的现状及展望 郜玉珍 中国护理管理 2006/10 40 北京市大学生医疗保险现状调查及政策分析 赵永生 中国青年研究 2006/09 序号 篇名 作者 刊名 年/期 41 医疗责任保险保费测算现状及建议 严敏婵 卫生经济研究 2006/08 42 高校医疗保险现状及改革 李洁 医药世界 2006/06 43 美国医疗保险制度现状、改革及给我们的启示 冯国忠 上海医药 2006/07 44 关于医疗保险定点医疗机构管理现状及对策的研究 周丽 辽宁行政学院学报 2006/08 45 某市三所医院《国家基本医疗保险药品目录》使用现状分析 高巍然 第四军医大学学报 2006/13 46 大学生医疗保障现状与医疗保险需求的调查分析 陈丽娟 中国西部科技 2006/05 47 厦门市医疗保险现状及分析 肖玉梅 卫生经济研究 2006/04 48 农村医疗保险 理想和现实还有多远——中国农村医疗保障现状及其解决方法 刘冰 小城镇建设 2006/03 49 县级医疗保险工作的现状与发展对策 李青山 当代经理人(中旬刊) 2005/04 50 灵活就业人员医疗保险现状调查分析 毛瑛 卫生经济研究 2005/12 51 日本高龄者医疗保险制度:现状、困境、对策 林宪鹏 日本研究 2005/03 52 护理人员对医疗责任保险的认知现状分析及对策 王若乔 南方护理学报 2005/11 53 医疗保险参保现状的社会效应分析 唐蜜 国际医药卫生导报 2005/21 54 青岛市医疗保险管理的现状与对策 宋丽丽 现代医药卫生 2005/20 55 浅析黑龙江农垦医疗保险现状 周海英 农场经济管理 2005/05 56 上海市企业医疗保险定点内设医疗机构现状与发展 王拥庆 上海预防医学杂志 2005/09 57 我国医疗保险制度的现状及发展策略 赵艳红 中国科技信息 2005/14 58 北京市医疗保险基金运行的现状、问题与展望 高梦滔 卫生经济研究 2005/07 59 医疗保险个人账户现状与完善探讨 刘蓉 人口与经济 2005/04 60 日本医疗保险体制的现状与改革 宋金文 日本学刊 2005/03
如果你要自己向杂志社投稿，需要等待的时间就比较长，而且如果不通过审核，你的论文就会石沉大海。这样容易耽误事，建议你可以找个论文网帮你发表，他们都和杂志社有合作，并且帮你修改论文，通过率很对期刊的选择要谨慎。我以前找学位论文网给发表了两篇论文，还不错，两个月就出刊了，你可以去试试。
1到3个月。由于上海预防医学杂志现在不是核心期刊，是省级刊物，审稿效率还是比较快的，一般1-3个月之内都会给出审稿结果，上海预防医学是上海市预防医学会主办的技术类科技期刊，1989年10月创刊，1992年6月经国家科委批准，国内外公开发行。
统计源核心，相当于普通的刊物 不属于北大核心！
有关食用槟榔致癌文献的反驳说明有关槟榔产品的食品安全问题由来已久，多年来不断引起人们的怀疑和误判。2003年曾有媒体报道：食用槟榔致癌，其原因是槟榔碱引起，且说明该信息来源于世界卫生组织。坊间也不断有槟榔产品的负面信息， 2012年两会期间，全国政协委员、致公党湖南省委副主委——胡旭晟委员向全国政协递交了《关于尽快规范槟榔行业的提案》，接到这一信息后，笔者（时任湖南皇爷食品有限公司槟榔研究所所长）出于职业的敏感，马上组织一批技术人员对这一报道（世界卫生组织的报告）做了追根溯源式的查询，查询结果表明此信息来源世界卫组织是真实的，但原文并没有科学实验或数据说明是槟榔致癌，原文是一个调研性报告，其结论是推断性的[1]。有关这方面研究的国内知名专家有凌天牖(中南大学湘雅二医院口腔科教授，主任医生，湖南省政府参事)；唐杰清(湘潭市口腔医院书记，主任医师，从事口腔临床专业30余年，主攻口腔黏膜病，曾主持《口腔黏膜下纤维性变》的临床研究)；翦新春(中南大学湘雅医院口腔科主任、博士生导师、教授) [2]。唐杰清接受《法制周报》记者采访时表示“我研究的方向主要是印度、台湾等地的鲜果与目前湖南干果的区别，蹊跷的是，从目前数据来看，印度、台湾等地的口腔癌发病率比嚼食干果的湖南地区要高。” 唐杰清介绍自己目前正在做一个关于干果槟榔与口腔疾病的调查，该项目已经坚持15年之久。三位权威专家多年的研究结论为长期咀嚼槟榔对口腔有害，还没有其它直接结论[2]。 其实早在2007年，北京大学口腔医学院张筱林医师就在国外英文版《口腔肿瘤学》杂志发表发表了一篇论文——《中国大陆咀嚼槟榔习惯与口腔癌及癌前病变的综述》[3]，文中就提到了中国大陆口腔癌患病率相对低于印度和东南亚的研究数据，并认为当时的研究成果还难以清晰准确地解释中国大陆咀嚼槟榔者中口腔癌患病率相当低的原因。 2010年8月～11月，湖南省湘潭市疾病预防控制中心、湘潭市卫生监督所、湖南省槟榔行业协会、湖南省疾病预防控制中心的一部分专家，开展了湖南省城乡居民咀嚼槟榔情况的流行病学调查，并对槟榔加工前后化学成分的变化及毒理学进行了研究，于2011年7月在《实用预防医学》杂志上发表了《湖南地区食用槟榔流行病学研究》，其中的一个重要的结论是：湘潭人咀嚼槟榔已有400余年的历史，50％的人咀嚼数量在～ g/d，口腔癌的死亡率处于全国平均水平[4]。从我们目前所了解的情况来看，世界上目前食用的槟榔主要有三种形式，一是食用鲜槟榔果，其食用方法是将七至八分成熟的鲜槟榔果（绿色）切成几瓣，再涂上白灰（一种贝壳来源的石灰浆），再包上蒌叶，如下图： 鲜槟榔果 蒌叶、贝壳粉 包装前的鲜槟榔果与蒌叶 鲜槟榔、蒌叶、贝壳粉近年来，有一种在白灰中添加食品添加剂而呈红色的红灰，其食品添加剂的主要成份为甜味剂及少量的香精，这种鲜食槟榔称之为红灰槟榔，一般也列入这一类食用槟榔中，这种食用方法主要流行于台湾、海南及东南亚等地区。这种吃法会在口腔中产生美拉德反应，使食用人的口腔发红，吃剩下的槟榔渣也是通红的。红灰具有很强的染色能力，能染红一大片地面，因此在海南、福建、广东的一些地方政府都曾出台过一些行政法规对此槟榔进行禁止。第二种是印度为主产地的槟榔咀嚼块，如下图，它也称印度槟榔，是由成熟度很高的槟榔核（即槟榔的种子，也是中药材的取用部位，中药别名花片）、蒌叶粉、烟叶及香精香料混合而成，东南亚一些国家也主要是食用这一种槟榔，世界卫生组织所说的食用槟榔咀嚼块也多指这一种槟榔。（图中的槟榔核的照片由马来西亚的亲友提供，印度槟榔的实物是2012年一位同事去印度考察槟榔产业时带回的） 成熟的槟榔果 成熟的槟榔核马来西亚的食用槟榔核 印度槟榔包装及内容物第三种是中国特有的湘潭槟榔，由七至八分成熟的鲜果经杀青、烘干后制得槟榔干果，然后经发制入味、闷香、上胶、切片、去核、点卤、凉片，再包装成成品。其食用的部位是槟榔干果的纤维外壳，实质是种子的皮，也就是种皮，槟榔核由于鲜果发育不完全，很小，在加工过程中当成废弃物处理。其槟榔鲜果的相片如右图，槟榔干果如下图。 七至八成熟的槟榔鲜果 烘干后的槟榔干果 加工过程中半成品湖南槟榔 湖南槟榔成品三种槟榔主要组份表：组成部分 鲜食槟榔 印度槟榔 湖南槟榔食用部分 七至八分成熟槟榔的全鲜果 成熟槟榔的种核 七至八分成熟槟榔烘干果的壳蒌叶 有 无 无碱石灰（贝壳粉） 有 有 有烟叶 无 有 无香精香料 无/有 有 有由上表可知，中国湖南所加工的食用槟榔里，从未添加过含有致癌作用的物质。各种报道中提到槟榔致癌作用的说法，其信息来源于世界卫生组织的研究报告，但各个报道均未具体提到是哪一份报告或附原文，更不用说科学实验或数据的说明了，证据显然不充分。综合南亚、东南亚及我国台湾等地对这一方面的研究报告，发现这些报道中检测并分析槟榔的大多数成分，主要是针对槟榔核和蒌叶，而不是槟榔壳 [3]，世界卫生组织的报告中说槟榔致癌基本上是以上述三地的文献及市场情况为基础而做出的调查统计或结论，因此，以这些报告为由来说湖南槟榔也致癌是站不住脚的，是一种偷换概念的误导。近年来的国内很多学者也发表了一些中国湖南食用槟榔研究报告[4] [5] [6] [7]，这些报告已经从正面证明了湖南槟榔的原料是无毒级的，加工过程中也没添加致癌物质，结论是湖南槟榔不是致癌食品[4]，因是用中文发表的原因，国外的研究者基本上是看不到的。从这些已经发表的文章来看，国内已有研究人员注意到了湖南槟榔与国外槟榔的不同。令笔者感到万分遗憾的是，不知道出于什么原因，那些鼓吹食用槟榔致癌的人却混淆了这一关键的环节。 笔者经过检索后找到一些相关报告，经翻译原文，世界卫生组织的报告的主要观点是：鲜食槟榔中有蒌叶，蒌叶中的主要成份含有强致癌物亚硝酸胺，因此鲜食槟榔具有强致癌作用，而印度的槟榔中含有烟草，烟草中的致癌因子之中主要是亚硝胺类，包括烟草中特殊的亚硝胺4-（甲基）-1-3-吡啶-1-丁酮（NNK）和N`-亚硝基（NNN)，因此这两种食用槟榔咀嚼块都有致癌作用[1]。该说法也被印度、东南亚、台湾等地的健康调查报告所印证。而中国湖南湘潭的槟榔没有上述两种强致癌物质，这也从一个侧面印证了唐杰清医师的困惑是正常的。附世界卫生组织报告原文摘录及中译文（从参考文献[1]中摘录）：All of the forms of tobacco discussed above induce malignant tumours in laboratory animals. Among the many carcinogens present in tobacco are nitrosamines, including the tobaccospecifi c nitrosamines 4-(methylnitrosamino)- 1-(3-pyridyl)-1-butanone(NNK) and N -nitroso nornicotine (NNN).10,11 Tobacco smoke also contains carcinogens as combustion products, such as arylamines, polycyclic aromatic hydro carbons, and volatile Many studies have investigated possible associations between polymorphisms in carcinogen-metab olising genes and tobacco-related cancers; most results are ambiguous, with the possible exception of NAT2 in bladder and breast cancers, and GSTM1 alone or in combination with CYP1A1 in lung cancer. Tobacco smoking, second-hand smoke, and smokeless tobacco were all reaffirmed as carcinogenic to human(Group 1), along with NNK and NNN. 译文：以上讨论的所有烟草形式都引发了实验室动物的恶性肿瘤。存在烟草中的诸多致癌物主要是亚硝胺类，包括烟草中特殊的亚硝胺4-（甲基）-1-3-吡啶-1-丁酮（NNK）和N`-亚硝基（NNN)。如燃烧副产物一样，烟草的烟雾中也包含致癌物，例如芳基胺，多环芳烃和挥发性有机物。许多学者也研究了致癌物代谢基因和与烟草相关的癌症之间的可能性关系；多数研究结果不确定。可能例外的是NAT2作用在膀胱和乳腺的癌症,GSTM1单独或结合CYP1A1作用在肺癌。与NNK,NNN一起，吸烟，二手烟和无烟烟草都再次被认定为人类致癌物（第一组）。Around 600 million people are estimated to chew betel quid in India and southeast Asia (prevalence of up to 80% in parts of India). Betel quid generally consists of areca nut, betel leaf, catechu, slaked lime, and often tobacco. Carcinogenic nitro samines derived from the areca nut, the primary ingredient in betel quid, are formed in the saliva of chewers. Areca nut induces oral preneoplastic disorders with a high propensity to progress to The Group 1 classification of betel quid with or without added tobacco, and of areca nut, was reaffirmed. There is now suffi cient evidence that betel quid without added tobacco causes oesophageal cancer,13 and limited evidence for liver 译文：据统计在印度和东南亚大约有6亿人在咀嚼蒌叶咀嚼物（印度某些地区流行率近80%），蒌叶咀嚼物包括槟榔果，槟榔叶，儿茶，熟石灰和通常包含的烟叶。槟榔果中可以得到致癌性亚硝胺，即蒌叶的主要成分，形成于咀嚼着的唾液中。槟榔果引起肿瘤发病前的口腔混乱，作为一种强烈的癖好，它促进癌症的发病。第一组中的分类中，含有和未含有烟草的蒌叶与槟榔果再次被确认（为致癌物）。现在有足够的证据证明未添加烟草的蒌叶咀嚼物会引起口腔癌症，有限的证据也证明会引起肝癌。据笔者所知，世界卫生组织并未到中国来调查过湖南槟榔的食用情况，笔者查阅了所能接触到的有关槟榔碱的文献包括互联网的查询检索、专业会议汇刊资料[5]、槟榔方面的种植[7]、加工方面的专著[6]等，从未发现过有关槟榔碱（槟榔壳中的活性物质）致癌的直接证据。 总的来说，世界卫生组织的报告说槟榔致癌并不是人们所理解的槟榔果本身致癌，而是说加入烟草或蒌叶的槟榔咀嚼块致癌，并且指明了致癌物质的来源是烟叶或蒌叶，而国内有关的纯槟榔干果属无毒级的研究[4]报告因语言方面的原因没能出现在世界卫生组织的报告里，因此盲目引用世界卫生组织的报告来说中国湖南的槟榔也致癌显然是犯了偷换概念的错误的，不管这是有意还是无意的。究其原因，可能是中国湖南槟榔的起源与印度、东南亚地区及中国台湾、海南的食用槟榔起源完全不同，因此其加工制作，吃用习惯与其它地方也完全不同，具有独特的湖南湘潭特色。据湘潭县志记载，湘潭食用槟榔的起源与发展，在湘潭的历史中可追溯到三百多年前。据《湘潭县志》介绍：一六五零年(顺治六年)正月，清兵在湘潭屠城九天，县城人口数万，所剩户不上二、三十，人不满百口。有一位姓程的安徽商人，得一老和尚嚼槟榔避疫之法收尸净域，从此嚼槟榔习惯也就陆续延续下来。1779年(乾隆四十四年)湘潭大疫，湘潭城内居民患臌胀病，县令白景将药用槟榔分患者嚼之，臌胀病消失，尔后原患者常嚼之，以致使未患者也随嚼之，久而成习。由此，湘潭槟榔逐步得到发展。但应特别注意的一点是：湘潭槟榔从开始至现在以食用槟榔外壳为主，从来不吃核，也不添加蒌叶或烟草。或许是由于湘潭槟榔的起源与其它地方的不同而形成了独竖一帜的食用方法。综上所述，湖南槟榔咀嚼习惯不同于世界其它地区，它只是用传统的食品工业加工方法对带壳的槟榔干果进行加工，并包装成产品，不会咀嚼槟榔核，不吞食槟榔且不含烟草、蒌叶的成份。有关的毒理学实验证明槟榔干果无毒[4]，槟榔加工过程所使用的食品调料(饴糖、明胶、香精、香料等)圴符合国家标准GB-2760所允许的范围。在写这篇文章时，笔者从电视新闻上看到国内某所谓著名的学者提出“湖南槟榔咀嚼块中含生物碱，这些生物碱通过亚硝基化作用变成亚硝酸胺，进而使槟榔也致癌”的观点，这位学者并未指出这一观点的出处，但从其常引用“世界卫生组织的报告”的言论上来猜测，极可能又是来自于所谓的“世界卫生组织的报告”，因为笔者在“世界卫生组织的报告”里找到了一个有类似观点的原文[2]，其中译文是“槟榔果中可以得到致癌性亚硝胺，即蒌叶的主要成分，形成于咀嚼着的唾液中”（参见前文中提到的原文及译文），显然，世界卫生组织的报告里指的是吃鲜果槟榔的情形，而且指出了亚硝胺的来源是蒌叶；因此把这一观点延伸到吃湖南槟榔时显然是不正确的，同时在笔者所查询到的文献中也没有找到相关的科学实验或数据能证明这一观点在吃湖南槟榔时是正确的，槟榔碱的分子结构中根本就不存在所谓亚硝胺（R2N-NO）的基团[7]；但却有一个现成的反证证明它是错误的——这就是如果吃湘潭槟榔会致癌是正确的的话，那湖南地区的民众的癌症死亡比例应该比不吃槟榔的其它地方高得多才对，然而湖南长沙、永州、等多个地方的“食用槟榔流行病学调查报告”却提示民众的癌症死亡比例并不比别的地方高，这也正是唐杰清医师的困惑之处。从逻辑上来讲，只剩下两种可能，一是湖南地区的民众身体特殊，具有抗癌作用——这显然是荒谬的，那么只剩下最后一个可能了——那就是湖南槟榔没根本就有致癌作用。因此笔者对这此做了一个推断性的结论：中国湖南食用槟榔虽然也叫“槟榔”，但与南亚、东南亚、台湾的“槟榔”的有很多的不同之处，在其所有生产加工环节中没有加入有烟草或蒌叶、蒌花等致癌的物质，所以食用湖南槟榔是相对安全的。因从正面证明这一推断是正确的工作远远超出了笔者的能力范围，盼请相关的各位专家学者给予严格的正面的证明。还有一些国内的学者，把口腔病变——口腔粘膜纤维化（OSF）与口腔癌等同起来，这同样也是错误的，据世界卫生组织及国内的研究或调查报告，在南亚、东南亚、台湾等地，吃槟榔引起的OSF的比例是左右，而在中国却高达左右[7]，造成这一现象的可能是中国的槟榔纤维壳硬，而在南亚、东南亚、台湾等地的槟榔却没有硬纤维，但在国外的吃槟榔的人群中得口腔癌的比例却比中国高，张筱林医师在他的论文[3]中提到这一现象没法解释，笔者从目前的国内外文献分析，其中的原因也可能是中国湖南的槟榔没有添加烟草及蒌叶造成的，因此尽管中国吃槟榔的人群中OSF比例较高，但由OSF进一步转成口腔癌的比例却不比南亚、东南亚、台湾等地高[1]，且一直处在正常的范围[2] [9]，这也从一个侧面证明癌症与湖南槟榔没有直接的联系。国内的某些医生，把日常工作中接触到的OSF病例绝对数量的上升与湖南槟榔对口腔的危害升级等同起来，这也是错误的。因为OSF病例绝对数量上升的同时吃湖南槟榔的人群总数也在急剧扩大，从各地调查统计报告[4] [8] [9]来看其相对比例关系并未上升，之所以会出现这样的论点，只能说明提出这些论点的人至少在统计学方面是不够专业，然后再套用世界卫生组织的报告说OSF是口腔癌的前症，就错上加错了，因为世界卫生组织的报告说OSF转化为口腔癌的比例高的前提是吃了含有烟草或蒌叶的槟榔，在中国可没这个条件，湖南多地的调查统计报告[4] [8] [9]的结论也说明两者之间并不存在直接的关联。笔者呼喻：咀嚼槟榔与人体健康的关系、市售槟榔的安全性毒理学评价以及槟榔加工过程的安全性影响等资料尽管还不尽完善，但国内现有的研究报告及健康调查报告却均指向湖南市售槟榔与致癌作用间没有直接的因果关系，更为全面资料还待进一步研究和充实。解决好这些问题，不能依赖于世界卫生组织及其报告，因为它的报告里所说的“槟榔”与中国的“槟榔”不是同一样东西。还必须依靠中国自己的学者对本国的具体情况进行充分必要的调查及研究，尽快开展食用槟榔安全性评价，制订食用槟榔安全标准，以便为槟榔种植、加工的开发利用提供法律保障。参考文献：[1] IARC Monographs on the Evaluation Carcinogenic Risks to Humans Volume 85 Betel-quid and Areca-nut Chewing and Some Areca-nut-derived Nitrosamines [D] ,2003[2] 海南省农业科学院农产品加工设计研究所槟榔产业调查组 《中国槟榔产业发展调研报告》[3] 张筱林 北京大学口腔医学院 Peter Reichart 德国柏林洪堡大学《中国大陆咀嚼槟榔习惯与口腔癌及癌前病变的综述》 此论文原著在英文《口腔肿瘤学》杂志发表 Oral Oncology (2007) 43:424–430[4] 萧福元，袁升，桂卓嘉等，湖南地区食用槟榔流行病学研究[J] 实用预防医学 2011，18（7）：1218-1222 [5] 中国热带农业科学院 万宁市政府 首届万宁槟榔文化节暨槟榔文化产业发展论坛《槟榔科技论文集》 2011年12月[6] 周文化 张海德 郑仕宏著《食用槟榔加工及其添加剂》 中南大学出版社2010年5月第1版[7] 覃伟权 范海阔 编著《槟榔》 中国农业大学出版社 2010年1月出版[8] 李民冬 《湖南长沙市嚼槟榔习惯的流行病学调查》 中南大学 2010硕士学位论文[9] 王冬梅 《湖南省永州地区城乡居民咀嚼槟榔习惯流行病学调查》中南大学 2011硕士学位论文
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实用预防医学 Practical Preventive Medicine主办： 中华预防医学会;湖南预防医学会周期： 月刊出版地：湖南省长沙市语种： 中文;开本： 大16开ISSN： 1006-3110CN： 43-1223/R邮发代号： 42-192历史沿革：现用刊名：实用预防医学创刊时间：1994该刊被以下数据库收录：CA 化学文摘(美)(2011)
刊名： 中国医学创新Medical Innovation of China主办： 中国保健协会周期： 旬刊出版地：北京市语种： 中文;开本： 大16开ISSN： 1674-4985CN： 11-5784/R邮发代号： 82-189 历史沿革：现用刊名：中国医学创新创刊时间：2008PS：该刊为国家级普通期刊，非核心期刊。因为是国家级，所以该刊算非核心期刊里面的1级期刊。
《中华预防医学杂志》创刊于1953年10月1日，创刊时名为《中华卫生杂志》，1960年与《中华医学杂志》、《医学史与保健组织》合并，改名为《人民保健》；1978年11月25日复刊时更名为《中华预防医学杂志》。
预防医学的特点预防医学工作有如下的特点：1.价值导向的超前性。2.服务对象和研究对象的整体性。3.研究方法的独特性。4.工作范围的全球性和广泛性。5.工作效率的紧迫性和时效性。6.工作过程的长期性和艰巨性。7.工作效果评价的滞后性和效益影响的深远性。预防医学是卫生事业的重要组成部分。它与临床医学、基础医学和康复医学组成现代医学科学的四大支柱。预防医学是以人群为主要研究对象，以环境一人群-健康为模式，以预防为主的观念为主导思想，运用生物医学、环境医学和社会医学等理论和方法，探讨疾病在人群中发生、发展和转归的特点，以及自然因素和社会因素对人群疾病和健康的影响规律，从而制定群体防治策略和公共卫生措施，并在实践中不断完善，以达到预防疾病、促进健康和提高生活质量为目的的学科。1）研究对象是人群而非个人；2）以环境——人群——健康为模式3）以预防为主的观念为主导思想4）运用生物医学、环境医学和社会医学的理论和方法，探讨疾病在人群中发生、发展和转归的特点，以及自然因素和社会因素对于人群疾病和健康的影响规律；5）从而制定群体防治策略和公共卫生措施，以达到预防疾病、促进健康和提高生活质量的目的医|学教育网搜集整理。预防医学和公共卫生的关系随着人类对自身、疾病和环境的不断认识，尤其是SARS和禽流感的暴发，人们都意识到公共卫生的重要和我国公共卫生体系的薄弱。关于预防医学与公共卫生之间，可以理解为：公共卫生是用来促进公众健康的措施；而预防医学是公共卫生措施的理论和实践基础。没有预防医学的理论指导，公共卫生就成了无源之水；而没有公共卫生实践，预防医学则成为空中楼阁。公共卫生的工作范围包括：通过有组织的社会活动来净化环境、控制传染病、进行健康教育、组织医护人员对疾病进行早期诊断和治疗、发展社会体制、保证每个人都享有足以维持健康的生活水平，促进身心健康。它研究的范围非常广泛，包括流行病学、环境、职业、营养、自杀、伤害等等方面。
呵呵，中华预防医学杂志是北大核心，中国预防是啥？大家都是核心而已
1到3个月。由于上海预防医学杂志现在不是核心期刊，是省级刊物，审稿效率还是比较快的，一般1-3个月之内都会给出审稿结果，上海预防医学是上海市预防医学会主办的技术类科技期刊，1989年10月创刊，1992年6月经国家科委批准，国内外公开发行。
统计源核心，相当于普通的刊物 不属于北大核心！
预防医学论坛不是核心。预防医学论坛杂志不是科技核心，预防医学论坛杂志是国家级期刊，投稿难度一般。适合医学学者发表学术论文。主要栏目有专稿、论著、调查研究、实验研究、监测、综述、应用技术、案例分析。
《中文核心期刊要目总览》中没有收录《预防医学情报杂志》，因此可以说该刊不是核心期刊。