太阳能光伏发电是当前利用新能源的主要方式之一，光伏并网发电是光伏发电的发展趋势。光伏并网发电的主要问题是提高系统中太阳能电池阵列的工作效率和整个系统的工作稳定性，实现并网发电系统输出的交流正弦电流与电网电压同频同相[1-2]。最大功率点跟踪MPPT(maximum power point tracking)是太阳能光伏发电系统中的重要技术，它能充分提高光伏阵列的整体效率。在确定的外部条件下，随着负载的变化，太阳能电池的输出功率也会变化，但始终存在一个最大功率点。当工作环境变化时，特别是日光照度和结温变化时，太阳能电池的输出特性也随之变化，且太阳能电池输出特性的变化非常复杂。目前太阳能光伏发电系统转换效率较低且价格昂贵，因此，使用最大功率点跟踪技术提高太阳能电池的利用效率，充分利用太阳能电池的转换能量，应是光伏系统研究的一个重要方向。
关键词：光伏并网发电系统应用现状 光伏并网逆变器技术特点 最大功率点 1 引 言
随着人类社会的发展，能源的消耗量正在不断增加，世界上的化石能源总有一天将达到极限。同时，由于大量燃烧矿物能源，全球的生态环境日益恶化，对人类的生存和发展构成了很大的威胁。在这样的背景下，太阳能作为一种巨量的可再生能源，引起了人们的重视，各国
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政府正在逐步推动太阳能光伏发电产业的发展[1]。而在我国，光伏系统的应用还刚刚起步，市场状况尚不明朗。针对这方面的空白，本文着重于今后发展前景广阔的光伏并网系统，通过对国内外市场和技术的调研，分析了目前光伏市场发展的瓶颈并预测了未来光伏发电的发展前景。相信作为当今发展最迅速的高新技术之一，太阳能光伏发电技术，特别是光伏并网发电技术将为今后的电力工业以及能源结构带来新的变化。
2 光伏并网系统应用现状 2.1 全球应用现状
目前，全球的光伏市场正处于稳定增长阶段。据solarbuzz llc.年度pv工业报告显示，2007年世界光伏市场比2006年增长了62%，2007年一年的安装量为2826mwp。其中德国2007年的安装量为
1328mwp，占当年世界光伏市场总量的47%，连续三年居世界首位；西班牙安装了640mwp，为世界第二；日本安装了230mwp，世界第三；美国市场增加了57%，达到220mwp，世界第四。表1和图1给出了2006年和2007年世界不同国家和地区的光伏市场份额[2]。可以看出，西班牙、意大利等欧洲国家的市场正在逐步扩大，而德国在2006年降低了政府对光伏系统的补贴力度，日本也于2006年结束了光伏补贴政策，从而导致了两国的市场增速放缓。中国市场也略有增加，但对于全球光伏市场来说影响甚微。
表1 2007年世界不同国家和地区的光伏市场及份额
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图1 2006、2007年世界主要国家和地区光伏市场份额
在国际市场中，光伏系统的应用形式主要分为离网系统和并网系统两大类，图2显示了1992年至2006年iea-pvps项目①成员国光伏系统的累计安装量。可以看到，并网系统已经毫无争议的占据了市场的主导地位，达到了90%以上，成为该领域的发展潮流。 j ka
图2 iea-pvps项目成员国光伏系统累计安装量
并网系统又分为分布式和集中式两种。分布式主要应用在城市屋顶并网、光伏建筑一体化和光伏声屏障系统等方面。这种系统占地少、安装灵活、投资门槛低。与离网系统相比，因为有电网电压支撑，可以不考虑负载特性而最大化的提供功率，且省去了蓄电池降低了系统成本。在德国、日本、美国等提供上网电价补贴的发达国家，普通居民均可投资建设并获取利润。而集中式则主要指大型光伏并网电站，因为需要大量土地，一般建于大漠中，作为大电源直接向高压电网送电。由于成本较高，一般由政府出资建设。
由于欧美、日本等发达国家均实施了相应的措施鼓励居民投资屋顶光伏系统。如德国实施了《上网电价法》，政府购电的价格达到德国火电价格的十倍左右；美国则是通过抵税政策来支持企业和个人投资光伏并网系统。因此，分布式并网系统的市场份额要远远大于集中式并网系统。在iea-pvps项目成员国中就达到了14:1。 2.2 国内应用现状
近年来，我国太阳能光伏产业发展十分迅速，光伏电池年产量已位居
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世界第一，且年增长率达到100%～300%[2][6]。而与之相对，我国的光伏市场发展相对迟缓，甚至可以说严重落后于光伏产业的发展。图3显示了自1995年以来我国光伏市场的发展情况。可以看出，我国光伏市场的发展相当缓慢，2002～2003年国家启动“送电到乡”工程，导致安装量有所突增，2004、2005年回落到年安装量约5mwp的水平[2][7]。2006年以后，由于国家大型并网工程的促进又有所回升。以2007年为例，我国当年光伏电池产量达到1088mwp，但国内只安装了20mwp，其余几乎全部用于出口。可见，我国真正的太阳能光伏市场还远没有形成。
图3 1995年～ 2007年我国光伏系统的年装机和累计装机容量变化 截止到2007年底，我国国内光伏系统的累计安装量只有100mwp，与全球近12gwp的装机容量相比所占份额非常小。其具体分配比例如图4所示，可以看到，这些装机大部分均用于农村电气化，以解决无电地区人民的生活用电问题，而并网系统仅占到了6%[2]。 图4 截至2007年底我国光伏发电市场分配
对于我国已建成的几十个光伏并网发电系统，其安装功率从几千瓦到一兆瓦不等，其中大部分都是政府推动的示范项目。由于我国电网技术等原因，这些已建成的示范项目大部分处于试验性并网状态，大多数都安装了防逆流装置，不允许光伏电力通过电力变压器向高压电网（10kv）反送电，而只允许在低压侧（380/220v）自发自用。 总体来说，随着时间的推移，所建设并网系统的容量也在逐渐增大，目前有8座兆瓦级光伏电站正在建设之中，预计2009年底可以完工。
另外，为了体现北京奥运会绿色奥运的精神，北京在国家体育中心、丰台垒球中心等奥运场馆均使用了100kwp左右的光伏并网系统，用来降低建筑物能耗。这些示范工程在促进光伏并网技术发展、降低co2排放等方面起到了很好的推动作用。但就其经济性来讲，由于当前组件价格较贵，所以还是很不划算的。以首都博物馆新馆安装的300kwp并网太阳能系统为例，总造价约2000万元人民币。而北京每天的标准日照时间为4～5个小时，如果以事业型部门电价0.6683元/度计算，一年最多节约电费：53000.6683365≈36.59万元。回收成本共需要：200036.59≈54.7年。而电池板的寿命一般只有20～30年，这显然是不划算的。又如深圳国际园林花卉博览园1mwp并网项目，总投资6600万人民币，而20年运营期内节约的电费只有1360万元[8]。因此，今后较长的时间内光伏并网发电仍需要政府政策的扶持才能发展。
3 光伏并网逆变器技术特点 3.1 主电路结构
光伏并网发电系统根据光伏电池模块组合方式，可分为如05所示的四种主要方式：中心集中式（图5a）、组串式（图5b）、模块集成式（图5c）和多组串式（图5d）[9]-[14]。 图5 光伏系统与组件的组合方式
中心集中式是将多个光伏模块进行串并联的排列组合然后接入到一个逆变器上。这种结构可以直接向光伏逆变器输入高电压和大电流，提高了转换效率。而且装置比较简单、成本低，适用于大型的高功率
1 什么是温室效应
1.1 概念的理解
温室效应，又称“花房效应”，是大气保温效应的俗称。大气能使太阳短波辐射到达地面，但地表向外放出的长波热辐射线却被大气吸收，这样就使地表与低层大气温度增高，因其作用类似于栽培农作物的温室，故名温室效应。如果大气不存在这种效应，那么地表温度将会下降约330C或更多。反之，若温室效应不断加强，全球温度也必将逐年持续升高。自工业革命以来，揉向大气中排入的二氧化碳等吸热性强的温室气体逐年增加，大气的温室效应也随之增强，已引起全球气候变暖等一系列严重问题，引起了全世界各国的关注。
1.2 “温室”的特点
温室有两个特点：温度较室外高，不散热。 生活中我们可以见到的玻璃育花房和蔬菜大棚就是典型的温室。使用玻璃或透明塑料薄膜来做温室，是让太阳光能够直接照射进温室，加热室内空气，而玻璃或透明塑料薄膜又可以不让室内的热空气向外散发，使室内的温度保持高于外界的状态，以提供有利于植物快速生长的条件。
1.3变成温室的地球
空气中含有二氧化碳，而且在过很长一段时期中，含量基本上保持恒定。这是由于大气中的二氧化碳始终处于“边增长、边消耗” 的动态平衡状态。大气中的二氧化碳有80％来自人和动、植物的呼吸，20％来自燃料的燃烧。散布在大气中的二氧化碳有75％被海洋、湖泊、河流等地面的水及空中降水吸收溶解于水中。还有5％的二氧化碳通过植物光合作用，转化为有机物质贮藏起来。这就是多年来二氧化碳占空气成分0.03%（体积分数）始终保持不变的原因。但是近几十年来，由于人口急剧增加，工业迅猛发展，呼吸产生的二氧化碳及煤炭、石油、天然气燃烧产生的二氧化碳，远远超过了过的水平。而另一方面，由于对森林乱砍乱伐，大量农田建成城市和工厂，破坏了植被，减少了将二氧化碳转化为有机物的条件。再加上地表水域逐渐缩小，降水量大大降低，减少了吸收溶解二氧化碳的条件，破坏了二氧化碳生成与转化的动态平衡，就使大气中的二氧化碳含量逐年增加。空气中二氧化碳含量的增长，就使地球气温发生了改变。二氧化碳可以防止地表热量辐射到太空中，具有调节地球气温的功能。如果没有二氧化碳，地球的年平均气温会比目前降低20 ℃。但是，二氧化碳含量过高，就会使地球仿佛捂在一口锅里，温度逐渐升高，这样，地球就变成一个“温室”。
2 温室效应的功与过
2.1 温室效应的正面作用
众所周知 ，蔬菜大棚具有让阳光进人、阻止热量外逸的功能 ，人们将此称之为 “温室效应”。在地球大气中 ，存在一些微量气体 ，如二氧化碳、水蒸气、甲烷、一氧化碳、氟里昂、四氯化碳、二氧化硫、氨、氮的氧化物、硫和碳的氟化物等 ，它们也有类似于蔬菜大棚的功能 ，即让太阳短波辐射自由通过 ，同时强烈吸收地面和空气放出的红外线长波辐射，从而造成近地层增温。我们称这些微量气体为温室气体 ，称它们的增温作用为温室效应 。有关温室效应的另一种说法是：从太阳幅射出耒的光线，越过大气层时可以穿透具有与玻璃一样效应的二氧化碳、甲烷、一氧化二氮、臭氧、氟氯碳化物等气体而抵达地球表面；然而，抵达地球表面的阳光经地表反射后，一些波长较长的光线的能量，会被二氧化碳、水蒸气等温室气体阻挡和吸收，不易散热于近地面的大气外，以致使地球上的温度会随着这些含量微小的温室气体在大气中含量的增多而增高。显而易见 ，大气中少量温室气体的存在和恰到好处的温室效应 ，对揉的生存是不可缺少的。要是没有温室气体 ，近地层的平均气温要比现在下降 33℃ ，地球会变成一个寒冷的星球。可见 ，温室效应是地球生物生存所必须的!
2.2温室效应的负面作用
近几十年来由于全球人口大量增加、工业快速发展、城市及其人口增多，火力发电量、石油用量、天然气用量和煤炭用量等大增，再加之大量森林被砍伐，有些草原由于放牧过度而产生退化，以及许多绿色植物用地被工业开发、被用于工业建设和建筑等 ，尤其是养殖业的发展，会使牛羊等牲畜消化掉草类食物后，从口中喷吐出比二氧化碳厉害得多的甲烷这种超级温室气体．正是由于揉以上种种不当的活动与行为，导致了地球大气中二氧化碳、甲烷、氟利昂、四氯化碳和二氧化硫等温室气体的增加 。很多科学家认为这是导致天灾频繁发生的重要原因，认为它会对各国的社会和经济的发展产生严重的影响，甚至还会使传染性和感染性的疾病增加。由此使得许多国家的政府和人民十分关注。许多国家在颁布的环境保护法中增加了应注意减排温室气体的条款 。较多的气象和环保方面的科技专家认为，只有全世界各国都重视减排温室气体 ，才能逐步稳定住地球大气中温室气体的含量，使地球各地的气候走上正常变化的轨道。
科学家预测,今后大气中二氧化碳每增加1倍,全球平均气温将上升1.5～4.5℃,而两极地区的气温升幅要比平均值高3倍左右。因此,气温升高不可避免地使极地冰层部分融解,引起海平面上升。海平面上升对揉社会的影响是十分严重的。如果海平面升高1 m,直接受影响的土地约5×106 km2,人口约10亿,耕地约占世界耕地总量的1/3。如果考虑到特大风暴潮和盐水侵入,沿海海拔5 m以下地区都将受到影响,这些地区的人口和粮食产量约占世界的1/2。一部分沿海城市可能要迁入内地,大部分沿海平原将发生盐渍化或沼泽化,不适于粮食生产。同时,对江河中下游地带也将造成灾害。当海水入侵后,会造成江水水位抬高,泥沙淤积加速,洪水威胁加剧,使江河下游的环境急剧恶化。温室效应和全球气候变暖已经引起了世界各国的普遍关注,目前正在推进制订国际气候变化公约,减少二氧化碳的排放已经成为大势所趋。
受到温室效应和周期性潮涨的双重影响，西太平洋岛国图瓦卢的大部分地方，即将被海水淹没，包括首都的机场及部分住宅和办公室。由于温室效应会导致南北极冰雪融化，水平线上升，直接威胁图瓦卢，所以该国在国际环保会议上一向十分敢言。前总理佩鲁曾声称图瓦卢是“地球暖化的第一个受害者”。
2.3 温室效应的严重危害
由环境污染引起的温室效应是指地球表面变热的现象。 它会带来下列几种严重恶果：
�8�4 地球上的病虫害增加；
�8�4 海平面上升；
�8�4 气候反常，海洋风暴增多；
�8�4 土地干旱，沙漠化面积增大。
科学家预测：如果地球表面温度的升高按现在的速度继续发展，到2050年，全球温度将上升2—4摄氏度，南北极地冰山将大幅度融化，导致海平面大大上升，一些岛屿国家和沿海城市将可能淹于水中，其中包括几个著名的国际大城市，如纽约、东京和悉尼等。
2.4温室效应可使史前致命病毒威胁揉
美国科学家近发出警告，由于全球气温上升令北极冰层溶化，被冰封十几万年的史前致命病毒可能会重见天，导致全球陷入疫症恐慌，揉生命受到严重威胁。
纽约锡拉丘兹大学的科学家在最新一期《科学家杂志》中指出，早前他们发现一种植物病毒TOMV，由于该病毒在大气中广泛扩散，推断在北极冰层也有其踪迹。于是研究员从格陵兰抽取 4块年龄由 500至14万年的冰块，结果在冰层中发现TOMV病毒。研究员指该病毒表层被坚固的蛋白质包围，因此可在逆境生存。
这项新发现令研究员相信，一系列的流行性感冒、小儿麻痹症和天花等疫症病毒可能藏在冰块深处，目前揉对这些原始病毒没有抵抗能力，当全球气温上升令冰层溶化时，这些埋藏在冰层千年或更长的病毒便可能会复活，形成疫症。科学家表示，虽然他们不知道这些病毒的生存希望，或者其再次适应地面环境的机会，但肯定不能抹煞病毒卷土重来的可能性。
3揉活动对自然大气温室效应的影响
揉活动对自然大气温室效应的影响可分为两种情况：一是改变自然大气中各种温室气体的含量，二是改变大气温室效应的自然因子。 随着揉工业活动的发展，大气中的微量气体 CO2 、CH4 及 N O2等含量一直在升高。研究古代气候的资料表明，CO2 和 CH4 含量的变化与温度长期呈现高度的正相关关系，还表明它们曾作为温室效应因子影响了全球古冰河时期的气候变化。理论研究和模式模拟证实，大气 CO2 和 CH4含量增加能增强 自然界大气的温室效应，引起全球平均气温升高。 温室效应变化是地面热量平衡移动的结果，任何能造成平衡移动的因素都会造成地面温度的变化。揉的活动通过改变下垫面对太阳辐射的反射率及水热特性，影响地面的热平衡，从而导致自然界大气温室效应的变化。
植被从两个方面影响自然大气的温室效应，与裸地相比，反射率较低，增加了下垫面对太阳短波辐射的吸收，下垫面热平衡向增温方向移动；另一方面，植被径叶存蓄大气降水，植被的枯枝落叶也能存留雨水，从而增加了蒸发及蒸腾的水分供给量，下垫面蒸散量增加，导致了热量的损耗，使得下垫面热量平衡向降温方向移动。两者综合作用，其结果是绿色植物在夏季具有明显的降温作用，在冬季则不太明显。所以，大面积的植被被破坏，如砍伐森林、草场退化、土地裸露等都可以造成自然大气温室效应的变化。灌溉是农耕活动的重要组成部分，经过灌溉的土地，土壤湿润，热容量增加，蒸发到空气中的水汽也大大增多，蒸发吸收了热能，会导致地面和地层空气降温。降温效果在于旱区特别突出，经灌溉的土地平均气温比半沙漠区低 5~C。大规模的灌溉甚至能使区域范围内的气候发生某些改变。 土地利用方式和变化也可改变下垫面水热平衡，对局域气候产生影响，如水库的湖泊效应，城市的热岛效应，沙漠垦区的绿洲效应等。在大气层里微量气体的浓度变化方面表现明显的有CO2、CH4 和NO2等，其中以CO2 及 CH4 浓度的变化最为明显。CH4 和 NO2等浓度较低，影响极小，CO2 含量的变化就成了影响大气温室效应变化的主要因素。
4温室气体效应与气候发生突变的可能性
美国主流的科学界近几年一直坚持认为，现在就断言气候将发生突变为时尚早，如果气候突变难以避免的话 ，也只能在几十年后发生。他们说，理论上，在全球气候变暖的情况下，世界上有些地区气温会上升但有些地区会下降。在变暖以后的地球，中高纬度地区增加的雨水再加上融化的冰河，会为海洋注入新的水流。这会影响一些像墨西哥暖流这样从热带地区传送热量到北部的洋流，使北美和欧洲反而相对会变冷。当然，即使这一切真的发生，也要经过十几年甚至几十年的时间，因为海洋传递热量要比大气慢得多。
从简单地剪切致病基因，到开发出不再传播疾病的工程动物，基因编辑技术已经释放出巨大的潜力。随着研究的深入，科学界还发现，除了编辑具有遗传讯息的DNA片段，编辑RNA可以在不改变基因组的情况下，帮助调整基因表达方式，此外，RNA的寿命是相对短暂的，这也意味着它的变化是可以逆转的，从而避免基因工程中的巨大风险。
2017年10月，来自Broad研究所的张锋研究团队在《自然》期刊上发表了题为“RNA targeting with CRISPR-Cas13”的文章，首次将CRISPR-Cas13系统公之于众，证实了CRISPR-Cas13可以靶向哺乳动物细胞中的RNA。仅仅时隔三周，又一篇名为“RNA editing with CRISPR-Cas13”的力作发表于《科学》期刊。在该研究中，张锋研究团队再次展示了这一RNA编辑系统，能有效地对RNA中的腺嘌呤进行编辑。
在CRISPR出现之前，RNAi是调节基因表达的理想方法。但是Cas13a酶一大优势在于更强的特异性，而且这种本身来自细菌的系统对哺乳动物细胞来说，并不是内源性的，因此不太可能干扰细胞中天然的转录。相反，RNAi利用内源性机制进行基因敲除，对本身的影响较大。但CRISPR-Cas13系统还有一个重要的问题，Cas13a酶本质上是一种相对较大的蛋白质，因此很难被包装到靶组织中，这也可能成为RNA编辑技术临床应用的一大障碍。
2018年3月16日，一项发表在《细胞》期刊的重磅成果为RNA编辑技术带来一大步飞跃，来自美国Salk研究所的科学家利用全新的CRISPR家族酶扩展了RNA编辑能力，并将这个新系统命名为“CasRx”。
CasRx（品红色）在人类细胞核中靶向RNA（灰色），Salk研究所
“生物工程师就像自然界的侦探一样，在DNA模式中寻找线索来帮助解决遗传疾病。CRISPR彻底改变了基因工程，我们希望将编辑工具从DNA扩展到RNA。”研究领导者Patrick Hsu博士表示，“RNA信息是许多生物过程的关键介质。在许多疾病中，这些RNA信息失去了平衡，因此直接靶向RNA的技术将成为DNA编辑的重要补充。”
除了高效性且无明显脱靶效应，新系统的一个关键特征是其依赖于一种比以前研究中物理尺寸更小的酶。 这对RNA编辑技术至关重要，这使得该编辑工具能够更容易被包装到病毒载体，并进入细胞进行RNA编辑。来自东京大学的科学家Hiroshi Nishimasu并未参与这项研究，他表示：“在这项研究中，研究人员发现了一种较Cas13d更加‘紧凑’的酶CasRx。从基础研究到治疗应用，我认为CasRx将成为非常有用的工具。”
此外，在这项研究中，研究人员还展示了利用这种新型RNA编辑系统来纠正RNA过程的能力。他们将CasRx包装到病毒载体中，并将其递送到利用额颞叶痴呆（FTD）患者干细胞中培养的神经细胞，最终使tau蛋白水平恢复到健康水平上，有效率达到80%。
Patrick Hsu博士最后说道：“基因编辑技术通过对DNA的切割带来基因序列的改变。在经过基因编辑的细胞中，其效果是永久的。虽然基因编辑技术能够很好地将基因完全关闭，但对调节基因的表达上并不那么优秀。展望未来，这一最新工具将在RNA生物学研究中发挥重要作用，并有望在未来凭借该技术对RNA相关疾病进行治疗。”
该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默。
3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默，证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性，通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向Pscsk9的sgRNA到小鼠肝脏，有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。
同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。
近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比，Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比，Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。
此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低Pten的质粒、尾静脉注射敲低Pcsk9的AAV8病毒、眼部注射敲低Vegfa的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到Pten基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调，Pcsk9下调造成血清胆固醇下调；Vegfa下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。
2020年3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向 Pten 基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了 Pten 的高效沉默， 证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性， 通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向 Pscsk9 的sgRNA到小鼠肝脏， 有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平 。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。
同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也 探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低 Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积**，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。
近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比， Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％ ，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比， Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的 ，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。
此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性 。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低 Pten 的质粒、尾静脉注射敲低 Pcsk9 的AAV8病毒、眼部注射敲低 Vegfa 的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到 Pten 基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调， Pcsk9 下调造成血清胆固醇下调； Vegfa 下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。
图1 CasRx介导的 Pten 体内体外的下调（ Protein & Cell ）
A.质粒示意图；B.N2a细胞中 Pten 的下调；C.Western检测PTEN及AKT的表达； D.CasRx与shRNA脱靶比较；E.尾静脉注射质粒示意图；F.G.H.免疫荧光，qPCR，western分别检测 Pten 及p-AKT的表达
图2 血清胆固醇的调节以及 Pcsk9 的可逆调控（ Protein & Cell ）
A.针对 Pcsk9 的AAV8病毒注射示意图；B.肝组织中 Pcsk9 的表达量；C.血清 PCSK9 的表达量；D.血清胆固醇水平；E.F.血清ALT和AST的测定；G.可逆调节注射示意图； H. Pcsk9 的动态调控。
图3 AAV介导CasRx减少了AMD小鼠模型中CNV的面积（National Science Review）
A.小鼠和人序列比较以及sgRNA示意图；B.C.在293T和N2a细胞中敲低 Vegfa ；D.VEGFA蛋白的表达；E.AAV病毒质粒示意图；F.实验流程图；G.CasRx的mRNA表达水平；H.I.激光烧伤之前或之后7天的 Vegfa mRNA水平；J.CNV诱导3天后的VEGFA蛋白水平；K.激光烧伤7天后，用PBS或AAV-CasRx- Vegfa 注射的代表性CNV图像；L.M.CNV面积统计。
2020 年 4 月 8 日， Cell 期刊在线发表了题为 《Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice》 的研究论文，该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室 杨辉 研究组完成。
该项研究通过运用最新开发的 RNA 靶向 CRISPR 系统 CasRx 特异性地在视网膜穆勒胶质细胞中敲低 Ptbp1 基因的表达，首次在成体中实现了视神经节细胞的再生，并且恢复了永久性视力损伤模型小鼠的视力。同时，该研究还证明了这项技术可以非常高效且特异地将纹状体内的星形胶质细胞转分化成多巴胺神经元，并且基本消除了帕金森疾病的症状。该研究将为未来众多神经退行性疾病的治疗提供一个新的途径。
人类的神经系统包含成百上千种不同类型的神经元细胞。在成熟的神经系统中，神经元一般不会再生，一旦死亡，就是永久性的。神经元的死亡会导致不同的神经退行性疾病，常见的有阿尔兹海默症和帕金森症。此类疾病的病因尚不明确且没有根治的方法，因此对人类的健康造成巨大威胁。据统计，目前全球大约有 1 亿多的人患有神经退行性疾病，而且随着老龄化的加剧，神经退行性疾病患者数量也将逐渐增多。
在常见的神经性疾病中，视神经节细胞死亡导致的永久性失明和多巴胺神经元死亡导致的帕金森疾病是尤为特殊的两类，它们都是由于特殊类型的神经元死亡导致。我们之所以能看到外界绚烂多彩的世界，是因为我们的眼睛和大脑中存在一套完整的视觉通路，而连接眼睛和大脑的神经元就是视神经节细胞。
作为眼睛和大脑的唯一一座桥梁，视神经节细胞对外界的不良刺激非常敏感。研究发现很多眼疾都可以导致视神经节细胞的死亡，急性的如缺血性视网膜病，慢性的如青光眼。视神经节细胞一旦死亡就会导致永久性失明。据统计，仅青光眼致盲的人数在全球就超过一千万人。
帕金森疾病是一种常见的老年神经退行性疾病。它的发生是由于脑内黑质区域中一种叫做多巴胺神经元的死亡，从而导致黑质多巴胺神经元不能通过黑质-纹状体通路将多巴胺运输到大脑的另一个区域纹状体。目前，全球有将近一千万人患有此病，我国尤为严重，占了大约一半的病人。 如何在成体中再生出以上两种特异类型的神经元，一直是全世界众多科学家努力的方向。
该研究中，研究人员首先在体外细胞系中筛选了高效抑制 Ptbp1 表达的 gRNA，设计了特异性标记穆勒胶质细胞和在穆勒胶质细胞中表达 CasRx 的系统。所有元件以双质粒系统的形式被包装在 AAV 中并且通过视网膜下注射，特异性地在成年小鼠的穆勒胶质细胞中下调 Ptbp1 基因的表达。
大约一个月后，研究人员在视网膜视神经节细胞层发现了由穆勒胶质细胞转分化而来的视神经节细胞，并且转分化而来的视神经节细胞可以像正常的细胞那样对光刺激产生相应的电信号。
研究人员进一步发现，转分化而来的视神经节细胞可以通过视神经和大脑中正确的脑区建立功能性的联系，并且将视觉信号传输到大脑。在视神经节细胞损伤的小鼠模型中，研究人员发现转分化的视神经细胞可以让永久性视力损伤的小鼠重新建立对光的敏感性。
为进一步发掘 Ptbp1 介导的胶质细胞向神经元转分化的治疗潜能，研究人员证明了该策略还能特异性地将纹状体中的星形胶质细胞非常高效的转分化为多巴胺神经元，并且证明了转分化而来的多巴胺神经元能够展现出和黑质中多巴胺神经元相似的特性。
在行为学测试中，研究人员发现这些转分化而来的多巴胺神经元可以弥补黑质中缺失的多巴胺神经元的功能，从而将帕金森模型小鼠的运动障碍逆转到接近正常小鼠的水平。
需要指出的是，虽然科学家们在实验室里取得了重要进展，但是要将研究成果真正应用于人类疾病的治疗，还有很多工作要做：人类的视神经节细胞能否再生？帕金森患者是否能通过该方法被治愈？这些问题有待全世界的科研工作者共同努力去寻找答案。
（上）CasRx 通过靶向的降解 Ptbp1 mRNA 从而实现 Ptbp1 基因表达的下调。
（中）视网膜下注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将视网膜穆勒胶质细胞转分化为视神经节细胞，转分化而来视神经节细胞可以和正确的脑区建立功能性的联系，并且提高永久性视力损伤模型小鼠的视力。
（下）在纹状体中注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将星形胶质细胞转分化为多巴胺神经元，从而基本消除了帕金森疾病模型小鼠的运动症状。
RNA-editing Cas13 enzymes have taken the CRISPR world by storm. Like RNA interference, these enzymes can knock down RNA without altering the genome , but Cas13s have higher on-target specificity. New work from Konermann et al. and Yan et al. describes new Cas13d enzymes that average only 2.8 kb in size and are easy to package in low-capacity vectors! These small, but mighty type VI-D enzymes are the latest tools in the transcriptome engineering toolbox.
Microbial CRISPR diversity is impressive, and researchers are just beginning to tap the wealth of CRISPR possibilities. To identify Cas13d, both groups used very general bioinformatic screens that looked for a CRISPR repeat array near a putative effector nuclease. The Cas13d proteins they identified have little sequence similarity to previously identified Cas13a-c orthologs, but they do include HEPN nuclease domains characteristic of the Cas13 superfamily. Yan et al. proceeded to study orthologs from Eubacterium siraeum (EsCas13d) and Ruminococcus sp. (RspCas13d), while Konermann et al. characterized orthologs from “Anaerobic digester metagenome” (AdmCas13d) and Ruminococcus flavefaciens (nicknamed CasRx), as well as EsCas13d.
Like other Cas13 enzymes, the Cas13d orthologs described in these papers can independently process their own CRISPR arrays into guide RNAs. crRNA cleavage is retained in dCas13d and is thus HEPN-independent. These enzymes also do not require a protospacer flanking sequence, so you can target virtually any RNA sequence ! In bacteria, Cas13d-mediated cleavage promotes collateral cleavage of other RNAs. As with other Cas13s, this collateral cleavage does not occur when Cas13d is expressed in a mammalian system.
Since Cas13d is functionally similar to previously discovered Cas13 enzymes - what makes these orthologs so special? The first property is size - Cas13d enzymes have a median length of ~930aa - making them 17-26% smaller than other Cas13s and a whopping 33% smaller than Cas9! Their small size makes then easy to package in low-capacity vectors like AAV, a popular vector due to its low immunogenicity. But these studies also identified other advantages, including Cas13d-specific regulatory proteins and high targeting efficiency, both of which are described below.
The majority of Type VI-D loci contain accessory proteins with WYL domains (named for the three conserved amino acids in the domain). Yan et al. from Arbor Biotechnologies found that RspCas13d accessory protein RspWYL1 increases both targeted and collateral RNA degradation by RspCas13d. RspWYL1 also increased EsCas13d activity, indicating that WYL domain-containing proteins may be broader regulators of Cas13d activity. This property makes WYL proteins an intriguing counterpart to anti-CRISPR proteins that negatively modulate the activity of Cas enzymes, some of which are also functional in multiple species (read Arbor Biotechnologies' press release about their Cas13d deposit here ).
Not all Cas13d proteins are functional in mammalian cells, but Konermann et al. saw great results with CasRx and AdmCas13d fused to a nuclear localization signal (NLS). In a HEK293 mCherry reporter assay, CasRx and AdmCas13d produced 92% and 87% mCherry protein knockdown measured by flow cytometry, respectively. Cas13d CRISPR array processing is robust, with CasRx and either an unprocessed or processed gRNA array (22 nt spacer with 30 nt direct repeat) mediating potent knockdown. Multiplexing from the CRISPR array yielded >90% knockdown by CasRx for each of four targets, including two mRNAs and two nuclear long non-coding RNAs.
One interesting twist to Cas13d enzymes is their cleavage pattern: EsCas13d produced very similar cleavage products even when guides were tiled across a target RNA, indicating that this enzyme does not cleave at a predictable distance from the targeted region. Konermann et al. show that EsCas13d favors cleavage at uracils, but a more detailed exploration of this cleavage pattern is necessary.
Konermann et al. compared CasRx to multiple RNA regulating methods: small hairpin RNA interference, dCas9-mediated transcriptional inhibition (CRISPRi), and Cas13a/Cas13b RNA knockdown. CasRx was the clear winner with median knockdown of 96% compared to 65% for shRNA, 53% for CRISPRi, and 66-80% for other Cas13a and Cas13b effectors. Like previously characterized Cas13 enzymes, CasRx also displays very high on-target efficiency; where shRNA treatment produced 500-900 significant off-targets, CasRx displayed zero. Unlike Cas9, for which efficiency varies widely across guide RNAs, each guide tested with CasRx yielded >80% knockdown. It seems that CasRx may make it possible to target essentially any RNA in a cell.
Since catalytically dead dCasRx maintains its RNA-binding properties, Konermann et al. tested its ability to manipulate RNA species through exon skipping. Previous CRISPR exon-skipping approaches used two guide RNAs to remove a given exon from the genome, and showed success in models of muscular dystrophy . In this case, Konermann et al. targeted MAPT , the gene encoding dementia-associated tau, delivering dCasRx and a 3-spacer array targeting the MAPT exon 10 splice acceptor and two putative splice enhancers. After AAV-mediated delivery to iPS-derived cortical neurons, dCasRx-mediated exon skipping improved the ratio of pathogenic to non-pathogenic tau by nearly 50%, showing proof-of-concept for pre-clinical and clinical applications of dCasRx.
The identification of Type VI Cas13d enzymes is another win for bioinformatic data mining. As we continue to harness the natural diversity of CRISPR systems, only time will tell how large the genome and transcriptome engineering toolbox will be. It is, however, certain that the impact of CRISPR scientific sharing will continue to grow, and we at Addgene appreciate our depositors for making their tools available to the broader community.
References
Konermann, Silvana, et al. “Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.” Cell (2018) pii: S0092-8674(18)30207-1. PubMed PMID: 29551272
Yan, Winston X., et al. “Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein.” Mol Cell. (2018) pii: S1097-2765(18)30173-4. PubMed PMID: 29551514
\1. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors
\2. CRISPR genetic editing takes another big step forward, targeting RNA
\3. How Editing RNA—Not DNA—Could Cure Disease in the Future
[ https://www.obiosh.com/kyfw/zl/aav/209.html](
