荧光探针毕业论文

分子生物技术在微生物降解环境污染物中的应用 [摘要〕介绍了与环境微生物关键降解酶基因的筛选、克隆及应用相关的分r生物技术，包括聚合酶链式反应技术、基因重组技术、荧光原位杂交技术和生物信息学等技术，并对这些技术在污染物降解基因检测、筛选和克隆方面的应用进行了阐述与探讨、 [关键词]分子生物技术;微生物;基因;环境污染物;降解随着现代j:\地技术的发展，多环芳烃、含氯有机物和硝基苯类化合物等人工合成井难以降解的污染物大量排放，造成世界范围内的环境污染和生态破坏，严重地威胁人类和其他生物的正常生存和发展。利用微生物修复技术对受污染的水体及土壤进行处理，凸显了其重要的意义和可行性。研究人员发现并筛选到一些微生物，它们不仅对环境有较高的适应性、对污染物有较高的耐受性，而且对污染物有较强的降解效率和专一性。然而环境中存在的大量微生物中仅有少于1%可通过传统的培养方法进行培养、分离和纯化，绝大多数细菌需要非常严格的营养条件川。因此，为了对修复环境有所贡献却难以培养的微生物进行更全面了解，也为了筛选到更多有利于降解环境污染物的微生物菌种及其关键酶基因，分子生物技术和手段逐渐被广泛应用到环境可降解污染物及降解机理方面的研究中。本文对近年来发展起来的聚合酶链式反应 (PCR)技术、基因重组技术、荧光原位杂交(FISH) 技术和生物信息学等多种分子生物技术进行了介绍，并总结了它们在污染物降解基因检测、筛选和克隆方面的应用。 1与环境污染物降解相关的分子生物技术 1.1PCR及其相关技术 PCR是一种利用脱氧核糖核酸(DNA)半保留复制原理，在体外扩增位于两段已知序列之间的 DNA区段从而得到大量拷贝的分子生物技术。根据其模板、引物来源或扩增条件的不同，PcR技术可分为以下几种:(l)反转录pCR(RT一PeR)技术，将mRNA反转录为cDNA后再对其进行PCR 扩增，可用来构建cDNA文库，分析不同生长时期的mRNA表达状况和相关性以及mRNA的定量测定等;(2)巢式PCR技术，在扩增大片段目的DNA 时，先用非特意性引物扩增再用特意性引物对第一次扩增产物进行第二次扩增，以获得可供分析的 DNA;(3)竞争PCR技术，是一种定量PCR，向PCR 反应体系中加人人工构建的带有突变的竞争模板，通过控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度，对目的模板作定量研究;(4)实时荧光定量PCR技术，在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，该法已广泛用于基因表达研究、转基因研究等方面;(5)扩增的rDNA限制酶切分析技术，根据原核生物rDNA序列的保守性，将扩增的rDNA片段进行酶切，通过酶切图谱来分析菌间的多样性;(6)RNA随机引导PCR技术，基于任意寡核昔酸引物与RNA之间可能的配对，在低严谨度条件下经聚合酶催化使链延伸，将细胞总 RNA或InRNA作为反转录反应的模板，此技术结合单链构象多态性，用非变性胶分辨大小相同而构象不同的片段，可用于诊断遗传突变及分析污染条件下序列的多态性;(7)随机扩增多态DNA (RAPD)技术，是一种基于PCR检测PCR引物结合位点序列改变的方法，通常以10bp的寡核昔酸序列为引物，对基因组DNA随机扩增，电泳分离染色扩‘增产物，再分析多态性。 1.2FISH技术 FISH技术利用荧光标记的探针在细胞内与特异的互补核酸序列杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号。荧光探针比放射性探针更安全，具有较好的分辨力，不需要额外的检测步骤。近年来，由于FISH技术具有灵敏、便捷等优点，迅速发展完善成为研究环境微生物的有力工具。此外，可用不同激发和散射波长的荧光染料标记探针，在一步反应中同时检测几个靶序列。该技术主要包括试样固定、预处理、预杂交、探针和试样变性、杂交、漂洗去除未结合的探针、检测杂交信号等步骤。由于 165rRNA具有遗传稳定性，因此成为FISH技术检测最常用的靶序列。 1.3基因重组技术基因重组技术是从供体生物的基因组中通过酶切扩增等手段获取目的基因，与载体连接形成重组DNA分子，再导入到受体细胞中，让外源基因得以表达。在已经分离出的许多菌株中，与降解能力有关的基因多在质粒体上。由于质粒很容易在细菌的繁殖过程中遗失，对细菌降解能力的长期稳定非常不利，可将其与污染物降解有关的酶基因重组到大肠杆菌等微生物中进行表达，以此构建的各种生物降解特性增强的重组菌可用于污染环境的治理修复或发酵某些废弃物。 1.4生物信息学 20世纪后期，生物学的迅猛发展，从数量上和质量上极大地丰富了基因组数据库、蛋白质数据库、酶数据库和文献数据库等许多生物科学的数据资源。已有多个国家和国际科研组织建立了生物信息数据库，如欧洲分子生物学实验室(Eur叩ean MolecularBiologyLaboratory)核酸序列数据库和美国国家生物技术情报中心(Nationaleente:fo:Bio- technologyInformation，NCBI)基因序列数据库等。科学家利用计算机及生物信息分析软件分析这些数据资源，确定大分子序列、结构、表达模式和生化途径与生物数据之间的关系，区分生物个体间遗传差异，揭示DNA多样性。例如，基本局部比对搜索工具(BasieLoealAlignmentSearehTool，BLAST)，是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似性比较的分析工具。它基于Altschul等的方法「2〕，在序列数据库中对查询序列进行同源性比对工作。 BLAST程序可对一条或多条、任何数量、任何形式的序列在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对，甚至将有缺口的比对序列也考虑在内，利用比较结果中的得分对序列进行相似性说明。基因的序列分析可揭示出生物物种之间的关系，在污染治理研究中可用于生物基因组特殊区域或特异基因的测序。 2分子生物技术在环境污染物降解中的应用 2.1土壤试样总DNA的提取用适当方法直接从土壤中提取DNA并纯化，是从分子生物学角度对土壤微生物进行研究的前提条件，而后可进行酶切、PCR扩增、核酸分子杂交等分子生物学技术操作。从土壤中提取微生物 DNA主要分为汽接法和间接法}’{。直接法是在 ogram等的方法基础卜发展起来的，其主要包括2 个步骤:(l)原位细胞裂解;(2)DNA提取和纯化。直接法提取的DNA超过细菌总DNA的60%且省力，但提取的DNA常常有折断、腐殖酸污染、甚至提取物中还夹杂有未知的胞外DNA和真核生物的 DNA。最先报道间接法的是Faegri等[‘〕，其主要包括4个步骤:(l)分散土壤;(2)分离细胞与土壤; (3)细胞裂解;(4)DNA纯化。间接法提取DNA 产量低且费力，但纯度较高、DNA损伤小，提取的大片段DNA可用来构建cos而d和细菌人工染色体文库等。 2.2采用PCR及相关技术扩增分析DNA片段可降解污染物的微生物必然能产生分解代谢该污染物的酶。selvaratnam等L’l用编码苯酚单加氧酶dmpN摹因的RT一PCR技术来检测序列间歇式活性污泥反应器‘{一，降解酚的假单胞菌。检测结果表明，RT一PCR技术不仅能检测微生物降解酚的能力，还能测量dmpN基因的转录水平，从而确定假单胞菌特殊的分解活性，发现了在转录水平下，酚浓度与通气时间之问存在正相关关系。将PCR技术和变性梯度凝胶电泳(DGGE)结合起来，在变性条件适当的情况下能分辨一个碱基对，分辨率较高。染色后的凝胶用成像系统进行分析，可在一定程度l几反应试样的复杂性。条带的多少能反应试样「一 }1微生物组成的差异，条带的亮度能反应试样中微生物的多少。基于以上优点，日前该技术在微生物群落结构的分析和动态研究方面得到了厂‘泛应用。DGGE可通过分析PCR扩增的基因点突变来探索微生物的复杂性。徐玉泉等[“〕从某废水中分离出一株能以苯酚为惟一碳源的菌株 PHEA一2，使用PCR一DGGE技术对该菌165 rDNA进行分析，发现该菌与醋酸钙不动杆菌同源。 M盯sh等r了)利用PcR一DGGE技术获得了活性污泥中真核微生物的种群变化情况。王峰等下8〕采用 PCR一DGGE技术对城市污水化学生物絮凝处理中活性污泥和生物膜微生物种群结构进行了分析，结果表明活性污泥培养前后微生物种群结构发生r 很大改变。 RAPD技术也是一种应用比较广泛的以多态性引物来扩增某些片段的技术。RAPD技术可用于检测含有混合微生物种群的各种微生物反应器中微生物的多样性。用RAPD技术分析检测实验室规模的油脂淤泥培养料中的细菌菌群发现，用油脂淤泥改良过的培养料比未改良的更适于不同的微生物种群生长[9j。vainio等t’。〕从516种孤立的菌落中提取出165rDNA，经PCR扩增后进行测序，检测活性污泥中微生物种群的结构。这些组合技术的应用显著增强r对微生物的检测和鉴定能力，为理论研究工艺优化及提高生物处理效率提供了条件。 2.3基因重组基因工程技术应用于环境保护起始于20世纪 80年代。其基本原理是通过基因分离和重组技术，将目的基因片段，比如可编码降解某种污染物的酶，转移到受体生物细胞中并表达，使受体生物具有该目的基因表达显现的特殊性状，从而达到治理污染的目的。找到特定污染的抗性基因，利用基因重组技术转基因后也可获得其他抗性植株以及筛选到可转化污染物的植物，还可开发超量积累植物进行污染土壤的生物修复。罗如新等L”〕用放射性同位素标记tfdc基因片段作探针，Southemblot杂交定位Ll菌株的邻苯二酚1，2一双加氧酶基因位于Pstl的I片段和BamH I的M、N片段，回收并将其直接克隆至表达载体 pKT230卜，获得的重组子能转化不具开环酶活性的甲胺磷降解菌P2，得到高于天然宿主21倍的邻苯二酚1，2一双加氧酶。stingley等{”〕通过构建基因文库和重组质粒等基因工程方法证实了NidAB 双加氧酶是降解菲的关键酶类，并首次鉴定出此基因通过磷苯二甲酸实现降解功能。chae等‘”}发现不能降解苯酚的su如lobusso扣taricu、98/2菌株中的儿茶酚2，3一双加氧酶基因与能降解苯酚的 sulfolo右u，，o如taricu、咫有[6J源区，分析得知它们是山共同祖先进化而来。把儿茶酚2，3一双加氧酶基因克隆到大肠杆菌中表达，可获得有较高降解活性的双加氧酶。重金属污染是环境污染的重要方面之一。随着分子生物学技术的发展，越来越多的修复性蛋白基因正被从植物、微生物和动物中陆续分离出来，如汞离子还原酶基因、有机汞裂解酶基因、汞转运蛋自基因、金属硫蛋白基因、植物络合素合成酶基因、铁离子还原酶基因和锌转运蛋白基因L’‘〕。这些基因通过基因工程的改造，重组到合适的受休细胞中表达相应的蛋白质和酶，达到治理难以降解的有毒有害污染物的目的。sorsa等〔”〕把MTS插人 LamB序列的153位点，在E.eoli中表达MTs，解决 r细胞内MTs对金属离子有限的吸附能力。综L 所述，基因重组技术具有快速、高效的特性，已逐渐成为环境生物技术的研究热点。 2.4FISH技术 FISH技术利用核糖体内长度适中(约1500bp)、高度保守的165:RNA序列作为理想的基因分类靶序列，其中使用的165:RNA寡核普酸探针一般是进行了荧光标记的20bp左右特异性核昔酸片段，利用该报告分子(如生物素、地高辛)与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测系统对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 FISH技术能提供处理过程中微生物的数量、空间分布和原位生理学等信息。硝化细菌是一类生理上非常特殊的化能自氧菌，传统的研究方法要经过富集、分离、分类和鉴定步骤，耗时长。HSH技术的引人解决了上述困难。 FlsH技术还被广泛用于活性污泥系统、硝化流化床反应器和膜生物反应器等废水处理系统}’61。基因工程微生物越来越多地被用于农业害虫控制和环境污染的生物修复，对人类健康和环境的影响引起广泛关注。1994年出现了一种新的标记系统:绿色荧光蛋白(GFP)，由于GFP基因表达产物对细胞没有毒害作用，且由GFP产生的荧光标记检测卜分方便、简单。在某些被污染的环境中可分离出降解该污染物的细菌，通过基因重组等手段使用GFP分子标记，可更容易的分离检测被标记的细胞叫。 Bastes等[’8]进行了苯酚降解菌染色体GFP基因标记实验。通过PCR和Southemblot分析，证明 GFP基因已成功整合到宿主细胞的染色体中。对标记菌与野生型的降解能力比较结果证明，GFP分子标记的插人并不影响细胞的苯酚降解能力。用G即标记Pseudomonasputida，研究活性淤泥中细菌存活情况{’9飞。Pseudomonasputida被转到活性淤泥2min后，观察到细胞在淤泥絮凝物间自由游动;培养3d后，发现荧光细胞减少，大部分已被合并到淤泥絮凝物中，以防止细菌被原生动物捕食。用oFP标记石.eozi和Serraliamarceseern，考察菌株附到絮凝物卜的过程{’()j。使用表面荧光显微镜能将带有GFP标记的细胞从活性污泥中区分开，井进行观察和记数。而聚焦激光扫描显微镜 (cLsM)可使GFP标记细菌产生三维轮廓，结合表面荧光显微镜和CLSM观察GFP标记细胞，结果表明，细胞表面疏水性在细菌附到絮凝物的过程中起重要作用，两种细菌附在絮凝物上的模式有很大不同，通过这种方法可更好地理解细菌赫附机理，有助于提高废水处理效果。 3结语分子生物技术的应用使研究人员可从微观的角度更细致深人地了解微生物对污染物降解的具体生理生化机制，在分子水平 _ _ [揭示生物体吸收、迁移、积累有害物质最终被毒害，及适应、抗性等生态问题，从而筛选到更多有利用价值的微生物。随着越来越多微生物全部基因序列的解码，对各种细菌体内可降解基因的分布和表达会有更深人的了解，有关技术的发展和成熟必将对污染物的降解过程有一个整体的、生态水平上的认识。参考文献 l李凤，刘世贵 . 分子生物学技术在环境微生物研究中的应用 . 世界科技研究与发展，2003，25(4):88一92 2AltsehulSF，GishW，MillerW，etal.Basieloealalign- mentsearehtool . 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