当初乙肝疫苗的设计就是为预防用的，为了增加其免疫原性，添加了佐剂氢氧化铝，氢氧化铝能增强体液免疫，即增强特异性抗体的产生；但它对特异性细胞免疫有一定的抑制作用，所以，有不提倡用于乙型肝炎一说。
长期以来，乙肝疫苗未用于治疗，倒不是担心它有抑制细胞免疫作用，而是对它治疗作用认识不足。当时，很多人包括我自己都这样想，乙肝病人血液中的表面抗原已经够多了，这样多的乙肝表面抗原都不能刺激体液免疫产生相应抗体，再注射一点点表面抗原(乙肝疫苗)又能起什么作用呢？近年来，随着免疫学研究的发展，人们发现，较大剂量的乙肝疫苗确可打破免疫耐受而起到消除HBV-DNA及表面抗原的作用。现拿我手头的一篇材料(Immunology.1999,96:98-108)，作者们应用转基因小鼠进行试验，共43只，用乙肝疫苗治疗1年，结果，治疗前树突状细胞功能良好者23例，治后HBsAg、HBeAg均阴转，HBV-DNA下降，而19例治疗前树突状细胞功能不好的，均无效。众所周知，转基因小鼠是典型的乙肝病毒免疫耐受者，应用乙肝疫苗1年结果：23/43有效、19/43无效，而且其疗效与治疗前树突状细胞的功能密切相关。至于为什么转基因小鼠血液中大量乙肝表面抗原引不起免疫反应，而注射乙肝疫苗就有反应？目前还没有确切的解释，有可能是血中虽有不少的HBsAg，但局部(皮下和肌肉)并不太多，不能有效地刺激大量存在于皮下的抗原递呈细胞——树突状细胞。注射乙肝疫苗后，局部的浓度明显增高了，因此可以有效刺激树突状细胞诱导特异性免疫反应。类似的动物实验材料还有，应用于人体的也有一些报告，总的看来，也有一定疗效，但不如动物实验那么好，是因为剂量偏小，还是佐剂(氢氧化铝)不好？还是有其他原因，均尚待研究。
乙肝疫苗不必三年打一次
专家小传：苏崇鳌，卫生部疾病控制中心研究员。多年从事预防医学事业，曾任中国预防医学科学院疾病控制处处长，现任中国肝炎防治基金会秘书长、卫生部肝炎防治专家咨询委员会委员。
我国乙型肝炎(以下简称“乙肝”)病毒携带者超过1.3亿，由于目前没有清除乙肝病毒的有效手段，所以我国要想摘掉“乙肝大国”的帽子，接种乙肝疫苗是惟一可行的方法。尽管新生儿早已推广接种乙肝疫苗，但是疫苗的有效性如何？成年人打一次疫苗，保护作用又能维持多长呢？记者为此采访了中国肝炎防治基金会秘书长苏崇鳌教授。
打疫苗1个月后要查抗体
苏教授指出，我国卫生部从1992年元月即已开始将乙肝疫苗免疫接种纳入儿童计划免疫管理，按照接种计划，新生儿在出生时、出生后第1个月、第6个月分别注射乙肝疫苗5微克，不是所有人在接种后都会产生抗体，因此在出生后第8个月应及时检测血液里有没有抗体，如果没有产生抗体或者水平不高，则需要及时追加5微克，刺激免疫系统产生相应的抗体。
成人打疫苗，剂量比儿童大一倍
苏教授同时指出，接触乙肝病毒携带者的成人也需要接种疫苗。此前国家只要求新生儿接种疫苗，是因为担心疫苗资源有限，无法满足所有人的需要。通过基因工程技术，我国目前每年可以生产乙肝疫苗约8000万份，不仅可以满足1600万新生儿的需要，也可为需要接种的成人提供足够多的疫苗。
成人乙肝疫苗接种疗程与儿童相似，只是剂量要加大到10微克，如果没有产生抗体，还可以加大剂量至20微克，绝大多数人在加大剂量后都可以产生抗体。
针对不少人认为乙肝疫苗保护作用会逐渐减弱的担心，苏教授指出，疾病控制中心不久前完成了一项针对数万名乙肝疫苗接种者的调查，结果表明，上述健康人在接种疫苗15年后无一例成为乙肝病毒携带者。研究同时表明，在新生儿期接种疫苗15年后，有40%的人仍有乙肝抗体。
没有乙肝抗体不代表没有免疫力
苏教授认为，理论上讲，乙肝疫苗接种后其保护作用几乎可以维持一生。人体对乙肝病毒的免疫力可以分为两部分，即细胞免疫和体液免疫。抗体仅反映了体液免疫的水平，而细胞免疫也很重要。目前临床上尚未常规检测细胞免疫，主要是由于检测费用非常昂贵。并不能认为，只有抗体能反映免疫力，更不能说检测不到乙肝抗体，人体就没有对乙肝病毒的免疫力。
目前有人认为乙肝疫苗最好3年接种一次。苏教授认为，这没有必要。尽管乙肝疫苗已经列入我国的新生儿计划免疫，但是卫生部现在还没有规定，儿童长到几岁后，要再次接种疫苗。有的专家认为7岁接种是安全的，有的认为延后到12岁亦可。苏教授个人认为，小孩长到10岁再接种疫苗比较合适。对于成人，也可以在首次接种10年后再次接种。尽管专家的观点不尽相同，但无论如何，每3年接种一次疫苗实在没有必要。 当然，如果打了也没有副作用。
一、基因疫苗的诞生
自1796年英国医生琴娜(Jener)首次采用牛痘苗以来,疫苗已在世界范围内被广泛应用,200多年来各种疫苗已经帮助人类战胜了包括天花在内的多种传染病.然而,现有的疫苗主要有两种：第一种疫苗是传统疫苗，即弱毒活苗和灭活苗，如鸡新城疫弱毒苗，猪瘟灭活苗，它是直接将无毒或减毒的病原体作为疫苗接种到人或动物体内，刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，从而预防疾病的发生；第二种疫苗是基因工程苗，它是通过基因工程，先分离得到具有强烈免疫原性但无毒性的抗原蛋白的编码基因，然后导入表达载体中，再在宿主细胞表达出重组抗原蛋白，经分离纯化后的重组抗原蛋白作为疫苗接种如重组乙肝疫苗。但它存在一些不可忽视的缺陷如:灭活疫苗难以诱发细胞免疫,需多次免疫注射;亚单位疫苗免疫原性差;减毒活疫茵存在毒性回升的危险等问题.因此,现在对一些传染病仍缺乏相应的安全有效的疫苗. 第三代疫苗基因疫苗的问世,为解决这些难题带来了希望.
基因疫苗（genetic vaccine）又称核酸疫苗(nucleic acid vaccine)或DNA疫苗，是在基因治疗（genetic therapy）技术的基础上发展而来的。基因治疗是从20世纪80年代发展起来用于预防和治疗疾病的最具革命性的生物医学医疗技术，其原理是将人或动物的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的。1990年Wolff JA等在进行基因治疗试验时，以裸DNA注射作对照，结果意外发现裸DNA可被骨骼肌细胞吸收并表达出外源性蛋白。1992年Tang 、 DC等首次证明经基因免疫产生的外源性蛋白质——人生长激素可刺激小鼠免疫系统产生特异性抗体，而且加强免疫后抗体效价增加，从而宣告基因疫苗的诞生。（注：1）
概括起来，基因疫苗就是指将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的载体上，然后直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，该抗原蛋白可直接诱导机体产生免疫应答。抗原基因在一定时限内的持续表达，不断刺激机体免疫系统产生应答反应，从而达到预防疾病的目的。
二、核酸免疫的作用机理
目前对核酸免疫作用机理的认识主要还仅限于理论推测，且多数资料来自基因治疗试验，二者在作用机理上很相似。在基因免疫中，含病原体抗原基因的核酸疫苗被导入宿主细胞，被周围的组织细胞、APC细胞或其它炎性细胞摄取，并在细胞内表达。表达产物作为抗原可能的呈递途径是：肌细胞直接摄入或经T小管和细胞样内陷摄取进入，在外源基因启动子作用下使外源基因表达，使产物在胞内水解酶的作用下分解成长短不一的多肽，其中的一部分被hsp70运到内质网，经网膜上的TAP分子转入膜内与主要组织相容性复合物（MHC）I类结合，最终在细胞膜表面被CDS十细胞识别；另一部分短肽进入溶酶体，与（MHC）Ⅱ分子结合，运到细胞表面被 CD4＋细胞识别。这些多肽含有不同的抗原表位，它们将诱导细胞毒性T淋巴前体、B细胞和特异性辅助T细胞，产生细胞免疫和体液免疫。同时，基因表达可以通过细胞分泌和分裂的方式进入组织细胞间隙，以天然折叠方式被B淋巴细胞识别。核酸免疫后，还可以使肌细胞和抗原递呈细胞被感染，从而使CD4＋和CD8＋细胞亚群活化，产生特异的免疫应答。 CorrM等（1996）的研究表明，从转染DNA得肌肉组织释放出的抗原被APC摄入，运送到管状淋巴结中，在B淋巴细胞和T淋巴细胞表达， I类MHC限制的CTL应答可能主要以这种方式产生。以前曾认为该过程需要内源抗原的表达，但现在的研究表明，只要有外源抗原的存在，也能有效地引起I类MHC限制的CTL应答。
三、基因疫苗质粒载体的构建
获得准确的抗原编码基因并将它插入到合适的载体DNA上，是发展基因疫苗的主要工作。
1、编码抗原蛋白基因的分离
制备DNA疫苗首先要获得编码抗原的基因，一般选择编码病原体表面糖蛋白的基因。抗原蛋白产生后可在宿主体内正确糖基化，从而诱导对病原体的免疫应答反应；对于易变异的病原体，最好选择各种变型都具有的核心蛋白保守的DNA序列，这样可对各种变异的病原体产生免疫应答反应，避免因病原体变异产生的免疫逃避问题。
2 目的基因质粒的载体构建
基因疫苗大多采用质粒作载体。一般说来，基因疫苗质粒载体至少包括5个主要的部件：（1）细菌复制子，以便质粒DNA在细菌体内复制扩增，得到大量的拷贝，但不能在宿主细胞（真核细胞）中复制；（2）原核生物选择性标记基因，如抗生素抗性基因，以筛选含有质粒DNA的阳性细菌克隆（菌株）；（3）真核生物的启动子、增强子、终止子、内含子等转录调控元件；（4）编码抗原蛋白的目的基因序列；（5）多聚核苷酸信号序列，以保证mRNA翻译时适时终止。另外，基因疫苗质粒载体通常含有一段未甲基化的CpG序列，其具有刺激Th1细胞的免疫活性。
四、严重创伤后全身性炎症反应综合征及免疫调节治疗
严重创伤后机体免疫功能表现为双向性改变。一方面表现为以吞噬功能和白细胞介素-2（IL- 2）等产生降低为代表的免疫受抑状态；另一方面表现出以全身性炎症反应综合征为特征的过 度炎症反应。正是这二方面共同作用构成了创伤后机体免疫功能紊乱，诱发多器官功能不全综合症（Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS）。下面就全身性炎症反应综合征和免疫调节治疗作一综述。
要的话可以给你PPT
第二章 基因工程制药
第一节 概述
第二节 基因工程药物生产过程
第三节 目的基因的获得
第四节 基因表达
第五节 基因工程菌的生长代谢特点
第六节 基因工程菌的稳定性
第七节 基因工程菌的中试
第八节 基因工程菌的培养
第九节 高密度发酵
第十节 基因工程药物的分离纯化
第十一节 变性蛋白的复性
第十二节 基因工程药物的质量控制
第十三节 基因工程菌药物的制造实例
第一节 概述
基因工程在制药中作用
基因工程药物的主要类别
基因工程生产药物的优点
国内外基因工程药物发展简述
与国外先进水平的差距
基因工程药物的主要类别
1.激素：胰岛素，生长激素
2.免疫性蛋白：单克隆抗体，疫苗
3.细胞因子：干扰素，白细胞介素
4.酶类：尿激酶，超氧化歧化酶
基因工程生产药物的优点
1.收获量大，更有效服务社会。
2.生产效率更高
3.进一步改良药理活性，例：蛋白质工程
4.有利于获得新药：筛选新型化合物
5..？
基因工程 (genetic engineering)：
有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。
稀少珍贵的蛋白质药物
1982年，美国食品与药物管理局批准了首例基因工程产品—人胰岛素投放市场——它标志了基因工程产品正式进入到商业化阶段。
人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、a-干扰素、纤维素酶、抗血友病因子、红细胞生成素、尿激酶原、白细胞介素-2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等
畜牧业中的应用
动物疫苗、生长激素等
例：从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA
种植业中的应用
用携带外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生质体，使外源DNA与植物染色体DNA整合，通过原生质体的培养分化成愈伤组织，最后发育成具有新性状的完整植株—转基因植物
种植业中的应用
抗化学除草剂基因
转基因西红柿
固氮酶基因
人类DNA
……
环境保护等等
第二+三节
重组DNA技术
1 重组DNA技术是基因工程的核心技术
2 获得需要的目的基因（外源基因）
3 构建重组质粒和基因克隆
4 转化受体细胞和转化子的筛选
5 转化子的分析——Southern杂交
重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。
重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。
1 重组DNA技术是基因工程的核心技术
重组DNA操作一般步骤：
（1）获得目的基因；
（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；
（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；
（4）对转化子筛选和鉴定；
（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。
（1）构建基因文库，然后从中调用目的基因；
（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段；
（3）聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因片段
（4）对旧基因的改造
（5）化学合成（短）基因
2 获得目的基因基本方法
细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建
细胞内总DNA的提取分离程序
基因文库的构建
将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。
反转录人工合成互补DNA
构建基因文库获取目的基因存在的问题—
费时费事
内含子序列
反转录人工合成互补DNA方法的优势——
获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因
聚合酶链式反应（PCR）
PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。
加入4种物质：
（1）作为模板的DNA序列；
（2）与被分离的目的基因两条链 各自5’端序列相互补的 DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；
（3）TaqDNA聚合酶；
（4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。
聚合酶链式反应（PCR）
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合
延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链
聚合酶链式反应（PCR）
每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍
30轮循环可获得—— 230（1.07×109)个基因片段
获得目的基因基本方法（续）
4.改造旧基因——蛋白质工程
5.化学合成（短）基因
基因重组和克隆操作最重要的工具是限制性内切酶、载体和宿主菌。
微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后，才能实现进一步的重组、转化和表达等操作。
3 构建重组质粒和基因克隆
限制性内切酶
限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀
Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年诺贝尔奖。
限制性内切酶
已经发现和鉴定了200多种
EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段
粘性末端
T4连接酶
载体
载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，目前最常用的载体包括细菌质粒、l噬菌体、cosmid质粒等。
质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。
a．该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。
b．进入宿主细菌细胞后，pUC18在每个细胞中可复制形成大约500个拷贝。
c．在pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种限制性酶切位点的序列，即多克隆位点
细菌质粒pUC18
pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG和X-gal，X-gal便会被半乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。
在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆
d．利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒
e．pUC18还携带了氨卞青霉素抗性基因，可筛选重组质粒。
lactose(4-D-glucose--galactopyranoside) and allolactose
以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆
将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：
a．获得目的基因和质粒载体；
b．形成重组质粒；
c．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；
d．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；
e．筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。
一般克隆基因的检查和鉴定方法
琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：
磷酸基团带负电荷
酶解片段向阳极移动
电场驱动力和凝胶阻力
——不同迁移率
分子量标准参照物
酶切和电泳方法
32P标记的DNA分子探针
杂交
放射自显影法
DNA杂交直接鉴定
基因克隆获得大量目的基因后，就要使其在合适的宿主细胞中表达，产生需要的基因表达产物或使宿主生物具备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳定遗传。这一过程就是遗传转化。
若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对转化的大肠杆菌进行培养使目的基因大量表达和积累。对表达产物分离纯化便可获得想要的产品。
通过DNA体外重组技术构建的重组质粒还可以直接用以转化蓝藻等原核生物或其他一些原生生物
4 转化受体细胞和转化子的筛选
遗传转化常用的方法
载体法转化——农杆菌介导法
基因的直接转移
（1）高压电脉冲电激穿孔
（2）基因枪法
（3）微注射法
纪念发明者Edward Southern
（1）提取总DNA
（2）酶解
（3）电泳
（4）转移到滤膜
（5）变性解链
（6）DNA探针及杂交
（7）洗脱
（8）放射自显影
（9）比较分析
5 转化子的分析——Southern杂交
Southern杂交分析示例
A. DNA体外重组实验
B. 抗生素筛选转化子细胞
C. 培养突变株细胞
D. Southern杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中
1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA体外重组，一举打开了基因工程学大门。
第四节 基因表达
宿主细胞的选择
大肠杆菌中的基因表达
酵母中的基因表达
动物细胞中的基因表达
一、表达宿主菌
宿主细胞的必备条件：7要点
基因表达宿主菌可分为2大类别
常见的宿主菌
1. 原核细胞：3种
2. 真菌：2种
以上各宿主的特点是什么？
二、大肠杆菌中的外源基因表达
1. 真核基因在大肠杆菌表达载体的6个必备性质
2. 2个表达载体——pBV220 & pET system
3. 影响目的基因表达的5大因素
4. 真核基因在大肠杆菌的3种表达形式
E.coli 表达载体的6个必备性质
1.独立的复制子
2.多克隆位点
3.强启动子
4.强终止子
5.阻遏子
6.Shine-Delgarno sequence & AUG
影响目的基因在E.coli表达的5大因素
1.基因的剂量
2.表达效率
3.表达产物的稳定性:
a 转录的强度，b 翻译效率（核糖体结合，SD序列，condon bias）
4.宿主E.coli的代谢负荷
5.工程菌的培养条件
真核基因在 E.coli 3种表达形式
1.融合蛋白
2.分泌型表达
3.普通表达
三、外源基因在酿酒酵母中的表达
1.载体：
4大类，YEp, YRp, YCp, YIp
克隆载体与穿梭载体
表达载体：普通表达载体和精确表达载体。
2.影响目的基因在酵母表达的因素
1.外源基因的剂量
2.外源基因的表达效率
①启动子的来源
②终止子的有效性
③分泌信号的效率
3.外源蛋白质的糖基化
4.宿主菌株的影响
第五节 基因工程菌株的生长代谢
菌体生长与能量的关系
关键词：供氧/能量/副产物/菌体生长
菌体生长与前提供应的关系
关键词：前提物/
基因工程菌株的不稳定性
菌株的稳定性与质粒的稳定性
提高质粒稳定性的6种方法
第六节 基因工程菌株的不稳定性
第七节 基因工程菌株中试
中试的目的
中试的流程
第八节 基因工程菌株的培养
1. 基因工程菌株的培养（发酵）方式
基因工程菌株的发酵工艺的七要素
基因工程菌株的发酵设备
第九节 高密度发酵
高密度：概念与作用
影响高密度发酵的因素
如何达到高密度发酵
建立分离纯化工艺的必要性
分离纯化的基本步骤
分离纯化的技术
1. 如何选择合适的分离纯化工艺
2. 细胞破碎和固液分离
3. 目标产物的分离纯化
选择分离纯化工艺的依据
1. 根据产物的表达形式
2. 根据分离单元之间的衔接
3. 根据分离纯化工艺的基本要求
第十节 基因工程药物的分离纯化
第十一节 变性蛋白的复性
包含体及其形成原因
包含体的分解和溶解
包含体复性的方法
原材料的质量控制
培养过程中的质量控制
纯化工艺过程中的质量控制
目标产品的质量控制
1.产品的鉴别
2.纯度分析
3.生物活性测定
4.稳定性
5.产品的一致性
产品的保存
第十二节 基因工程药物的质量控制
干扰素---人的IFNα2b的制造
人粒细胞集落刺激因子
人白细胞介素-2
第十三节 基因工程药物制造实例
