高中生研究性学习论文
课题：我们身边的水
摘要：本文是我们五位同学综合实践活动的成果，阐述了水的组成、性质，对我们生活中的水进行了分类和比较，在此基础上阐述了它们的各自用途。最后分析了长江流域和古运河流域镇江段水质污染状况及其原因，并初步提出治理构想。
关键词：水，身边的水，分类，用途，水质污染
水（H2O）是由氢、氧两种元素组成的无机物，在常温常压下为无色无味的透明液体。水是最常见的物质之一，是包括人类在内所有生命生存的重要资源，也是生物体最重要的组成部分。水在生命演化中起到了重要的作用。
1水的性质
1.1物理性质 水在常温常压下为无色无味的透明液体。在20℃时，水的热导率为0.006 J/s�6�1cm�6�1K，冰的热导率为0.023 J/s�6�1cm�6�1K，在雪的密度为0.1×103 kg/m3时，雪的热导率为0.00029 J/s�6�1cm�6�1K。水的密度在3.98℃时最大，为1×103kg/m3，温度高于3.98℃时，水的密度随温度升高而减小 ，在0～3.98℃时，水不服从热胀冷缩的规律，密度随温度的升高而增加。水在0℃时，密度为0.99987×103 kg/m3，冰在0℃时，密度为0.9167×103 kg/m3。水是良好的溶剂，大部分无机化合物和少部分有机化合物可溶于水。
1.2化学性质
1.2.1水的热稳定性。水的热稳定性很强，水蒸气加热到2000K以上，也只有极少量分解为氢气和氧气，但水在通电的条件下会分解为氢气和氧气。
2H2O 2H2↑ + O2↑
1.2.2水与金属反应。很多活泼的金属能与水反应，如钠、钾、铁等。
2Na + 2H2O = H2 ↑+ 2NaOH
3Fe + 4H2O Fe3O4 + 4H2
1.2.3水与非金属反应。少部分非金属能与水反应，如氟气、氯气、碳等。
Cl2 +H2O HCl + HClO
1.2.4水与一些金属氧化物和非金属氧化物能与水反应。如氧化钠、氧化钙、二氧化碳、二氧化硫等。
Na2O + H2O = 2NaOH
SO2 + H2O H2SO3
1.2.5与其它物质反应。
NH3 + H2O NH3.H2O
CaC2 + H2O → Ca(OH)2 + C2H2↑
2水的分类及其应用
2.1普通水、重水、超重水
氢元素有三种核素，分别为普通氢（核中1个质子，又叫氕）、重氢（核中有1个质子，1个中子，又叫氘）、超重氢（核中1个质子，2个中子，又叫氚），它们分别与氧结合形成普通水、重水和超重水。普通水的分子式为H2O。重水又叫氧化氘或氘水，分子式是D2O。重水是无色、无臭、无味的液体，但它的一些物理性质跟普通水稍有差异。例如，重水的密度是1.1044g/cm3（25℃），而普通水是0.99701g/cm3（25℃）。这是重水得名的由来。重水的熔点是3.81℃，沸点是101.42℃。盐类在重水里的溶解度比在普通水里小。例如，在25℃，100g普通水中能溶解35.92gNaCl，而100g重水只能溶解30.56gNaCl。许多物质跟重水发生反应，反应比普通水慢。重水对生物有不利影响。植物种子浸在重水里不能发芽，鱼类在重水中会很快死亡。一般的普通水中含重水约0.015％。电解水时，由于普通氢气（H2）比重氢（D2）放出快6倍，所以电解水的残留液中重水被富集。目前生产重水的方法有电解法、精馏法和化学交换法。重水的主要用途是在反应堆中作慢化剂（又叫减速剂）和冷却剂。重水分解时产生的氘是重要的热核燃料。在化学和生物学中，重水用作示踪物质来研究反应机理等。 超重水的化学分子式为T2O，每个重水分子由两个氚原子和一个氧原子构成。超重水在天然水中极其稀少，其比例不到十亿分之一。超重水的制取成本比重水还要高上万倍。
2.2生活中的水
2.2.1自来水 天然水经过过滤、沉淀、消毒以后的水，主要成分是水，其次有一些离子如Ca2+、Mg2+、Cl-等等。虽然自来水经过处理后，但还有微量的细菌如大肠杆菌，另外还有一些其他的溶质，因此自来水不能直接饮用。自来水的密度大于纯水的密度，没有固定的沸点。自来水在加热沸腾后可以饮用，可直接作为工业用水。
2.2.2矿泉水 矿泉水是从地下深处自然涌出或经人工揭露、未受污染的地下矿水。矿泉水含有对人体有益的多种矿物质和微量元素，如锂、锶、硒、锌、溴、钼等，生理功能强，对人体有一定的保健作用。在通常情况下，矿泉水的化学成分、流量、水温等动态在天然波动范围内相对稳定。
2.2.3纯净水 纯净水是以江河湖水、自来水等为水源，采用蒸馏法、电渗析法、离子交换法、反渗透法等处理工艺制成的。就是经过复杂深层的净化程序达到无菌纯净。纯净水是把水中各种元素最大限度的去除，只保留水分子，在去除有害物质的同时，也去除了有益的物质，因此不能长期饮用纯净水，要和矿泉水搭配喝
2.2.4磁化水 磁化水是使水经过高科技超导磁体的磁化，使水分子结构发生变化而得到的一种水。水磁化后，其物理化学性质发生了很大变化，主要表现为电导率增大，PH值升高，密度减小，挥发性加快，溶解氧（DO）升高，难溶物质在其中的溶解度增大等。在大多数磁场下得到磁化水表面张力增大、沸点降低；在极少数磁场下，表面张力下降、沸点升高。磁化后的水的冰点变化不大。由于磁化水具有不同于普通水的结构和性质，使它在生产和生活中有很多用途。在医疗上，它对人的高血压、糖尿病、血稠、肾结石等疾病都有一定的刺激和疗效。饮用磁化水对消除运动疲劳也具有一定的作用。在工业上使用磁化水具有抑垢防垢、灭尘、提高混凝土的强度等用途。在农业上用磁化水对农作物进行灌溉，可以激活各种生物酶，增强酶的生物活性，促进叶绿素的形成，提高光合作用，从而促进作物的生长发育，提高作物的产量和质量。用磁化水养鱼，使鱼类的生长和抗病抗寒能力得到加强。
2.2.5超水 将普通水在密闭容器中加热蒸发为水蒸汽，并使水蒸汽在石英毛细管（内径在nm数量级）中凝结，这样得到的水叫超水，有人不科学地称之为纳米水。经过处理得到的超水缔合结构发生了很大变化，形成一种链状六角环结构的聚合物，其颗粒直径达到nm数量级。由于超水结构的特殊性，决定了它具有不同于普通水的一些性质：①其密度为普通水密度的1.4倍（ρ超=1.4ρ普）；②其粘滞系数是普通水粘滞系数的15倍（η超=15η普），挥发性低；③超水的冰点为-100℃，在700℃时仍保持其特性。加热到900~1000℃时变为普通的水，并且在-100~700℃内无论加热、冷却还是长期存放，都不会改变其特性。超水活性高，能更容易地进入其它物质的分子之间，某些与普通水不相容的物质，如燃料油，能与超水很好相溶，水进入到油分子之间，改变了分子之间的相互作用，使分子结构更松散。按一定比例配成含有超水的燃料油，燃点低且燃烧充分，一方面可以提高燃烧率和机械效率，另一方面可以减少大气污染，具有巨大的经济效益和良好的社会效益。用超水做溶剂，可以制成在低温下仍保持液态的溶液，也可以根据其挥发性低及粘滞系数大的特点，制成抗挥发和抗渗透的溶液，在工业上大有用处。
2.2.6中水 中水就是将人们在生活和生产中用过的优质杂排水（不含粪便和厨房排水）、杂排水（不含粪便污水）以及生活污（废）水，经集流再生处理后，达到一定的水质标准，可在一定范围内重复使用的非饮用的杂用水，其水质介于上水（清洁水）和下水（污水）之间。对于“中水”有多种解释，污水工程方面称为“再生水”，工厂方面称为“循环水”或“回用水”，有的人又称之为“复新水”，一般以水质作为区分标志。经过处理所得到的中水水质必满足如下条件：（1）满足卫生要求：其指标主要有大肠菌群数、细菌总数、余氯量、悬浮物、COD、BOD5等；（2）满足人们感观要求，无不快感觉，其衡量指标有浊度、色度、臭味等；（3）满足设备构造方面的要求，即水质不易引起设备、管道的严重腐蚀和结垢，其衡量指标有PH值、硬度、蒸发残渣、溶解性物质等。处理后的出水一般用来冲洗厕所、喷洒道路、绿化、洗车、作为冷却水的补充水等。
2.3硬水与软水
2.3.1软水 含钙离子、镁离子较少或不含钙离子、镁离子的水，一般硬度低于8度的水为软水。
2.3.2硬水 含钙离子、镁离子较多的水，一般硬度高于8度的水为硬水。硬水会影响洗涤剂的效果，硬水加热会有较多的水垢。 工业上在使用硬水之前一般要进行软化。
2.4淡水与咸水
2.4.1淡水 含较少盐份或不含盐份的水，一般作为民用水或工业用水。
2.4.2咸水 含有较多盐份的水，如北方盐湖水，部分地下水和海水都是咸水。
修改:
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我给你提供一些大肠杆菌的资料,比较乱,自己去整理.
三凉食品这个术语没有听说过,如果可以解释一下,或许我会知道.
大肠杆菌O157: H7实验诊断研究进展
大肠杆菌O157: H7感染临床表现
出血性肠炎：鲜血样便，腹部痉挛性疼痛，低热或不发热。
溶血性尿毒综合征（HUS）：主要发生在儿童，常出现在腹泻后数天或1-2周。病死率一般在10%，各别可高达50%。
血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：主要发生在成年人，尤其老年人。病人主要表现为发热、血小板减少、溶血性贫血、肾功能异常等症状，病情发展迅速，病死率高，有时可出现70%的病人死亡。
大肠杆菌O157: H7传染源和传播途经
大肠杆菌O157: H7基本上是一种食源性病原菌，可通过食用大肠杆菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等感染,也可通过人与人、人与动物密切接触传播。
在实验室，大肠杆菌O157: H7可以感染小鼠、鸡、兔、猪、牛等动物。
大肠杆菌O157: H7的感染已成为世界性的问题
我国情况也不容乐观
一、细菌培养与鉴定
1．分离培养
早期培养对确定病原有重要意义。
培养的对象首先是急性血性腹泻患者，其次是HUS、TTP等住院病人，再其次是高危接触者。
培养基：
山梨醇麦康凯琼脂、胰胨大豆琼脂
改良的伊红美兰 、改良的SD-39（MSD）琼脂
添加了头孢克肟 和 亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）
添加了头孢克肟和鼠李糖（0.5%)的山梨醇麦康凯琼脂（CR-SMAC）
“科玛嘉”大肠杆菌O157: H7显色培养基
四溴荧光亚甲基兰琼脂
H7抗血清—山梨醇发酵培养基
增菌液：
含10mg/L 新生霉素的EB肉汤或肠道增菌液
含10mg/L 新生霉素或10mg/L盐酸-吖啶黄的胰蛋白胨大豆肉汤
新生霉素MEC肉汤
月桂基胰蛋白胨肉汤
加入下例任何一种抑制剂均可增加培养基的选择性
头孢克肟 0.05mg/L 亚碲酸钾2.5mg/L
新生霉素10mg/L 万古霉素40mg/L
2．免疫磁珠分离法
免疫磁珠分离法是将特异性抗体吸附于一种能被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样品中的大肠杆菌O157: H7富集起来。
方法:1.增菌;2.取样品1ml加大肠杆菌O157: H7免疫磁珠20ul;3.轻轻混合10分钟;4.将试管插入磁架上;5.吸取上清;6.加PBS,重复3-5过程;7.取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨醇麦康凯琼脂(C-头孢克肟,T-亚碲酸钾)等选择性培养基。37℃培养6-24小时，挑取可疑菌落进行鉴定。
Chapman等 共检测大便标本690份, 免疫磁珠分离法检出25 。用免疫磁珠分离法分离的l2株大肠杆菌O157: H7中,直接培养阳性仅5株。
Wright等将接种大肠杆菌O157: H7的碎牛肉标本置加有万古霉素和头孢克肟的缓冲蛋白胨水培养,然后直接或用大肠杆菌O157抗体包被的磁珠分离细菌后,接种于CT-SMAC,结果直接次培养检出量为200cfu/g,而免疫磁珠分离法仅需 2cfu/g 。
Chapman等先用EC肉汤增菌,然后用免疫磁珠分离法富集牛粪便大肠杆菌O157: H7菌株,再用选择性培养基分离，并与CR-SMAC和CT-MAC直接培养作比较。用前者检测接种12株不同大肠杆菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。
Cubbon等用免疫磁分离法（IMS）检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157: H7。在一起经牛奶传播的大肠杆菌O157: H7爆发中,用IMS、粪便培养和多聚酶链反应(PCR)检测Vero毒素基因的携带,用三种方法对粪便大肠杆菌O157: H7的分离率作比较结果,在受检的142份粪便标本中,直接培养和IMS均阳性20 份,另13份仅IMS阳性。因此,IMS提高了大肠杆菌O157: H7感染病例的检出率,与PCR符合率高。
目前，污染的肉、家畜，甚至饮用水均面临大肠杆菌O157: H7的卫生威胁。检测食品和水源中肠道病原体使用传统的培养法,结果不理想。IMS和其它检测的研究表明,对快速检测食品和环境标本似乎前景良好,Yu检等以IMS结合电化学发光检测法(ECL)检测食品和污染物中的大肠杆菌。结果显示,在原缓冲液检出大肠肠菌的范固为100－1000 cfu/lm,在食品检出的范围为1000－2000cfu/lm ，检测时间十分快,一般不到1小时。菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。在监测牛群的4个月间,从牛采集1024份直肠标本,其中检出大肠杆菌O157: H784份（8.2%）84份中有23份（27.4%）由直接培养和IMS分离。23份中15份由两种培养基、5份仅由CT-SMAC、3份仅由CR－SMAC分离,其余61份(72.6%)仅IMS分离。用含吐温－20 的PBS洗涤磁珠可减少其它微生物与磁珠的非特异性结合。用无关的抗体包被磁,则大肠杆菌O157: H7不结合。IMS具有快速、操作简单、特异性高,在流行病学调查中有价值。
3．生化反应
目前许多国家使用的O157和 H7特异性抗体与极少数细菌具有不同程度交叉反应。因此用生化试验确定为大肠杆菌是必须的。
典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下：
动力试验（+） 葡萄糖（+） 麦芽糖（+）甘露醇（+） 蔗糖（－/+） 硫化氢（－） 尿素（－） 靛基质（+） 甲基红（+） V-P试验（－）枸橼酸盐（－）苯丙氨酸脱羧酶（－）赖氨酸脱羧酶（+/－）鸟氨酸脱羧酶（ +/ －）氧化酶（－）氰化钾（－）
与O157有鉴别意义的生化反应见表1。
MUG即4-甲基伞形化内酯-β-葡萄糖醛酸苷。大多数大肠杆菌具有葡萄糖醛酸酶,可水解MUG产生荧光, 但O157: H7中大多数菌株则不水解MUG。Thompson等建立了一种快速MUG试验,取 MUG试剂0.5ml置试管中,以无菌棉签挑取待检菌纯培养物混匀于其中,44.5℃置20min,暗室内高强度光源下观察结果,产生蓝色荧光者为阳性。
二．血清学检测
1．玻片凝集试验
2. 胶体金免疫技术
3. ELISA
4．免疫荧光技术
5．胶乳凝集
6. 间接血凝分析(IEHA)
7. 全自动抗原抗体检测系统
8. 免疫印记法
1．玻片凝集试验
玻片凝集试验是鉴定O抗原最经典的方法,实验中如果凝集反应不明确，但根据临床表现和生化反应等菌株高度可疑时,可100℃加热菌液30min再行玻片凝集试验。这样可去除K抗原的影响。为排除交叉反应引起的凝集造成假阳性,应继而做试管凝集反应,所测得的效价不应低于诊断血清原标定效价的一半。鉴定H抗原也应同时做玻片和试管凝集试验,并应先对待检菌做动力试验,在动力活泼时取培养物做H抗原鉴定。
2. 胶体金免疫技术
胶体金免疫技术特点是以胶体金作为标记物进行的抗原抗体反应。这一技术最初用于免疫电镜技术。至今，在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的一种简便、快速的血清学检验方法。
胶体金的制备多采用还原法，氯金酸是主要还原材料。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。
胶体金免疫层析试验时以硝酸纤维膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一样。
中国预防医学科学院微生物研究所利用胶体金技术、双抗体夹心法和显色反应等特点，研制了大肠杆菌O157: H7病原体快检金卡，通用于定性检测粪便、食品、水等样品中的O157: H7大肠杆菌。显色程度与样品中细菌含量成正比，最低测菌量为少于100个菌细胞，主要特点是敏感性高，可用于待检样品初筛，阳性样品可进行细菌分离，减少工作量。
3. ELISA
大肠杆菌O157: H7的常用检测方法是粪便培养后作细菌分离,然后用生物化学和免疫学方法鉴定,一般需72 小时。
Dylla等用一种快速ELISA直接检测粪便中大肠杆菌O157: H7,并与标准培养方法加以对照。结果显示,ELISA检测183份粪便标本,检出大肠杆菌O157: H7 9份。常规培养法阴性176份,而ELISA阴性174份。总特异性为98.9%。该法与其它非O157: H7大肠杆菌无交叉反应,是一种准确、敏感、特异、易观察结果的筛选方法，尤其适用于中、小实验室及大量粪便标本的流行病学调查。
Padhye等用单克隆抗体进行直接ELISA反应检测O157: H7,除O26 ：H11外，未发现与沙门氏菌、结肠炎耶氏森菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯民菌等有交叉反应。单克隆抗体用于检测大肠杆菌O157: H7有明显特异性，可作为一种免疫试剂用于临床和食物标本的快速检测。Clark 等近一步对单克隆抗体的研究发现,此种单克隆抗体识别的物质是LPS,这种LPS抗原决定簇用全细胞ELISA同样可以在其它血清型大肠杆菌和产生或不产生Vero毒素的大肠杆菌中检测到, 而且易受到胆盐、吖啶黄和温度的影响,但可以通过结合免疫捕获的修饰方案来提高ELISA的特异性。
4．免疫荧光技术
DEFT 与Ab-DEFT：
直接荧光技术（DEFT）与抗体定位荧光技术(Ab－DEFT)的主要特点是,显微镜下直接计数样品菌细胞。由于无需培养或分离过程,因此检测非常快速。DEFT的基本原理为:对样品进行过滤,用荧光染料(如吖啶橙)对留在滤膜上的菌细胞染色后,用荧光显微镜观察计数。但由于荧光染料的非特异染色,不但被检菌被染色,本底杂菌也可染色,从而影响了结果的精确性。Ab-DEFT则克服了这一缺点,过滤后的菌细胞与荧光标记的特异抗体作用,然后用荧光显微镜观察计数。
固相荧光毛细管免疫分析
此方法高度敏感，具有快速、试剂用量少、易于操作等优点。Czajlu等用热杀死的O157: H7菌包被玻璃毛细管作固形支持物。
样品中加入结合了生物素的O157: H7多克隆抗体,作用一段时间,然后将此样品/抗体混合物与标记了Cy5 (一种荧光花青染料)的亲和素加入到毛细管,孵育2min,冲洗、吹干,由激光传感器系统发射650nm波长激发光激发花青染料,之后用光学传感器系统测定荧光发射密度。
直接免疫荧光抗体染色
Park等对粪便样品进行离心后,用免疫荧光抗体对粪便涂片进行标记,可检测到所有培养法证实的菌株,检测时间<2h。
5．胶乳凝集
该方法是以胶乳颗粒作载体,以O157: H7特异性抗体致敏,制成特异的胶乳试剂,将标本乳化于玻片或有色烧盘上，滴加胶乳试剂,呈明显凝集而对照胶乳不凝集时即为阳性。
6．间接血凝分析(IEHA)
该法多用于对LPS、可溶性本体抗原、未加热抗原的抗体检测,对检测H抗原的抗体效果不佳。Morooka等检测了溶血性尿毒综合征(HUS)病人血清LPS抗体,虽然甲醛化羊红细胞(SRBC)有低水平非特异性吸附,但不影响该方法作为一种有效、快速（<3h）的诊断方法。因为感染病人血清的滴度明显高于非特异性吸附。
7. 全自动抗原抗体检测系统
VIDAS是一种全自动抗原抗体检测系统。可直接从感染性疾病患者标本中检测细菌、病毒、弓形虫、衣原体和螺旋体等微生物的抗原、抗体或毒素。
基本原理：采用酶联免疫（夹心法）原理，并在底物中掺入荧光物质，最终产生荧光产物4-甲基-7-羟刀豆素，荧光强弱与标本中被测物浓度相关，经扫描样本读数与标准比较计算出标准值，并根据阴性和阳性临界值判定结果。
8.免疫印记法
目的是检测大肠杆菌O157: H7感染者血清中的O157脂多糖和溶血素特异性 抗体。基本原理是将提纯的脂多糖或溶血素用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，通过转移电泳转移到硝酸纤维膜上，然后用抗原抗体进行免疫检测。包括SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移电泳、免疫检测三部分。
特点是具有比较高的特异性和敏感性 。
免疫检测
将封闭好的硝酸纤维素膜按梳子齿的宽度剪成每一个泳道一条，依次编号。
1) 每条加入1毫升用PBS稀释的病人血清，室温震荡2小时，同时设阳性对照和阴性对照；
2) 用2.5毫升／条PBST震荡洗涤3次，每次5分钟；
3) 加入用1毫升用PBS稀释的II抗，室温震荡1小时；
4) 用2.5毫升／条PBST震荡洗涤2次，每次5分钟，再用PBS洗涤一次；
5) 将膜放入12毫升显色液中显色，室温震荡15-30分钟，至阳性对照出现满意的蓝紫色 ；
6) 将膜放入蒸馏水中终止显色反应，照相；
7) 当显色的条带和溶血素的分子量或0157脂多糖的条谱一致时，结果判断为阳性。
二．分子生物学检测
分子生物学的出现，为更快诊断微生物提供了许多分子学工具。 这一新的研究是用基因型而不是表型因子来鉴定特异性病原体。因此其特异性更好。加之 操作程序自动化使得DNA分析在实验室应用中已成为常规操作。自动化DNA提取仪，聚合酶链式反应仪(PCR仪)，DNA序列分析仪，脉冲凝胶电泳仪(用于分离DNA大片段，如完整的染色体) 在疾病诊断中都是很有用的。
1．DNA探针
探针(probe)标记：放射性核素 、非放射性物质标记 。
探针的来源 ：①克隆的基因组DNA探针；②cDNA探针；⑧RNA探针；④寡核苷酸探针。
标本处理：根据标本来源和量的不同而处理不同 。
杂交方法：斑点杂交 、southern印迹 、原位杂交 、Northern印迹 等。
杂交信号检测 ： (1)测量放射性核素射线脉冲数 (2)放射自显影 (3)显色法 (4)发光法。
O157: H7特异噬菌体上的sltⅠ、Ⅱ基因、大质粒溶血素基因及染色体上eae基因等都已制成了可杂交检测的特异探针。Beutin等曾用VT1(750bp,)、VT2(850bp)、溶血素(3.4kb)等探针进行流行病学调查。Thomas等用地高辛标记的VT2B亚单位基因、VT2C基因探针检测不同噬菌体型O157: H7菌。Huck等筛选了O157: H7大质粒上限制性片段,发展了一种2.0kb的Sma I片段探针,认为此探针对O157: H7血清型最为特异,可与所有O157: H7试验菌杂交。
2. PCR技术
聚合酶链式反应技术（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。具有特异性强、敏感性高、快速、简便、可扩增RNA或cDNA、对起始材料质量要求低等优点。
PCR技术扩增体系的基本成分
引物: PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应充分考虑引物特异性。引物长度一般为15-30个碱基,G+C含量为40- 60%,浓度0.1-1umol/L 。
TaqDNA聚合酶：浓度为1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异DNA扩增 。
模板DNA：应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制备方法有加热法、冻溶法、超声波粉碎法、碱变性法、SDS裂解法等多种。
4×dNTPs ： dNTP储存液pH应为7.0，在反应体系中，4种dNTP的浓度应相同，每种dNTP的浓度以50-200 umol/L为宜。
缓冲液及其他成份：PCR反应体系中，一般采用Tris-HCl缓冲液。适宜的Mg2+浓度为高于dNTP总浓度0.2-2.5 mmol/L。
PCR技术循环参数
PCR扩增是由变性、退火和延伸三个步骤反复循环而实现的。确定正确的循环参数是PCR成功的保证。
循环参数
1．变性温度和时间
模板DNA和PCR产物的变性不完全，是PCR反应失败最常见的一个原因,在变性步骤，使温度达到双链DNA完全分离的变性条件是95 ℃ ，30s。对GC含量高的靶DNA序列，宜用较高的变性温度。在解链温度下，DNA的变性仅需几秒。但是，使反应管内达到解链温度需要一定的时间。原则上变性步骤应高温、短时，即要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。
循环参数
2．引物退火
引物退火的温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应体系中的浓度 。对GC含量约50％，长20个碱基的典型寡核苷酸引物而言，最佳的退火温度为55 ℃ 。在温度较高的条件下退火，可提高PCR的特异性。
循环参数
3．引物延伸 ：引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地加到引物的3’一OH末端，引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。如用TaqDNA聚合酶，一般取70-75 ℃ ，常用72 ℃ 。 延伸步骤的时间则取决于目标序列的长度、浓度和延伸温度。目标序列越长、浓度越低、延伸温度越低，则所需的延伸时间越长；反之，目标序列越短、浓度越高、延伸温度越高，所需的延伸时间则越短 一般而言，每1000个碱基的序列，延伸时间1分钟便足够了。对于扩增100—300个碱基的短序列片段，可省去延伸温度这一步骤，而采用快速简便的变性、退火双温循环。这是因为TaqDNA聚合酶即使在退火温度下仍保持很强的活性，而延伸过程可在退火温度转变为变性温度的过程中完成。
循环参数
扩增产物长度 100bp 500bp 1000bp 2000bp
94℃变性时间（秒） 30 30 60 60
55℃复性时间（秒） 30 30 60 60
72℃延伸时间（秒） 30 38 120 180
一般作25-30个循环即可，进行最后一次循环时间、延伸时间增加5分钟。
PCR扩增产物的检测方法
PCR反应混合物经过循环扩增后，所需做的工作就是检测反应液中是否存在预期扩增产物及产物的特异性。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法。包括凝胶电泳、高压液相色谱、核酸探针杂交、探针捕获酶免疫分析、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析。
PCR技术类型
免疫PCR技术 原位PCR技术 不对称PCR技术
巢式PCR技术 反向PCR技术 逆转录PCR技术
复合PCR技术 彩色PCR技术 抗原捕获PCR技术
增敏PCR技术 酶标PCR技术 二温式PCR技术
锚定PCR技术 定量PCR技术 毛细管PCR技术
多重PCR技术 巢式或套式PCR技术
PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用
(1)简单PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段为基础设计了一对引物,扩增产物为633bp的DNA片段。其退火温度为60℃－63℃, 应用煮沸法与基因释放法,大肠杆菌O157: H7检出限分别为25与38CFU/ml,检测时间为3h。
Thomas等用PCR扩增了slt基因片段。引物：
正链5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3',
反链5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’
其PCR产物由凝胶电泳测定,检测时间为ld 。
徐建国等根据O157: H7 特有的hlyA、B基因序列设计了PCR引物,产物为338bp。
PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用
（2）多重PCR:由于鉴定O157: H7血清型不能仅仅依靠简单PCR,近年来国外学者对多重PCR方法在大肠杆菌O157: H7的诊断价值方面进行了研究。Meng等同时扩增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其长度分别为633、210、484bp。此引物设计可有效区别O157: H7血清型与O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一个单一反应中同时扩增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa质粒保守序列,其产物分别为1087、227、224、166bp。严笠选用针对大肠杆菌O157: H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157: H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果复合PCR方法较单一PCR方法具有较高的特异性，12株O157: H7取得了稳定、可靠的阳性结果。能迅速、有效地与其它致病性大肠杆菌及沙门氏菌、志贺菌相鉴别。
PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用
（3）原位PCR:kurokawa等不用培养过程,直接用原位PCR技术结合落射显微镜,在单细胞水平快速检测O157: H7 。
4.23SrRNA在大肠杆菌O157: H7分型、检测中的应用
传统的细菌分类方法主要依赖于细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等特征。随着现代分子生物学理论和技术的迅速发展，微生物检测进入了基因时代，以核糖体核糖核酸序列为基础的分类方法为微生物的鉴别提供了新的分子生物学方法。如16srRNA、 23srRNA、 16-23srRNA区间序列分析等等，它完全不同于传统方法，具有快速、简便、敏感和特异等优点。
23SrRNA基因特征：
原核生物的核糖体有三种大小（分别为23S、16S、 5S）的rRNA。目前已知23SrRNA基因全长序列的菌种数目已达250种。长度大约为3000pb。对许多细菌的23SrRNA基因序列分析发现，其序列的可变性比16SrRNA基因要明显，特别是亲源关系近的种系。利用这些可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分类鉴定。同时对已知23SrRNA基因序列分析也发现，在最初的520pb中有6个保守区域（5-10区域），并发现，这6个保守区域中6区段和10区段最保守，该序列在14个菌种中完全一致。
应用：
检测临床感染性疾病的病原菌 首先，将两条引物设计在保守区，成为通用引物，而在变异区中选择序列作为特异性探针，先用通用引物作PCR扩增，可筛选出含有病原菌的样本，再用特异性探针与扩增产物进行杂交，对目的细菌作出鉴定，达到诊断病原体及分型的目的。
鉴定特定细菌种属 目前认为，已发现的23SrRNA基因的IVSs具有种属特异性，可利用IVSs（插入序列）进行PCR扩增达到对某一种属细菌的诊断。
在流行病学方面的应用利用可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分析。为流行病提供依据。
除以上介绍的各方法外,常用的有效检测方法还有脉冲场电泳、随机扩增多态性DNA指纹分析、细胞毒试验等,在此不一一赘述。
大肠杆菌O157: H7的检验程序
样品 增菌6小时 磁珠浓缩
可疑菌落 山梨醇麦康凯琼脂
G染色 生化反应 血清学 毒力基因
大肠杆菌O157: H7实验室诊断依据
有下列情况之一具有实验室确诊意义：
1) 从腹泻病患者的粪便标本中分离出大肠杆菌O157: H7 ；
2) 经PCR或DNA杂交试验证实具有溶血素基因 及志贺样毒素基因；
3) 腹泻病患者恢复期血清抗O157LPS IgG抗体呈4倍升高；
4) 具有血性便的腹泻患者的急性期血清或恢复期血清，蛋白印记试验证实含有和O157LPS、EHEC溶血素或志贺毒素的特异性抗体．
小结
自从O157: H7被认识以来,对其基因的研究越来越细,已经探明了许多结构与功能基因,对其病因学、病理学及临床治疗方面均有很大促进作用。由于引起感染所需的O157: H7剂量很低,有必要发展一些灵敏度高的方法,用于快速有效地检测。另外,现已发现存在许多变异株,单用一种方法来检测往往是不够的。如发酵山梨醇的变异株用SMAC即不能检测到;由于许多非EHEC(EPEC、霍乱弧菌、志贺菌等)也可产生SLT,故单纯检测SLT也会产生假阳性结果。因此对一个样品的检测需结合使用多种方法才能获得准确的结果。
第三章 大肠菌群测定
一、大肠菌群检验
(一)检验方法
(二)培养基
(三)检验时应注意事
二、大肠菌群的卫生学意义
大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。
在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国内常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。
大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。
一、大肠茵群检验
(一)检验方法
1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。
2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。
3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时
食品安全问题绐终是广大消费者所关心的根本问题,人工合成食品添加剂的使用直接影响食品的安全性,也直接关系到消费者的身体健康.为指导消费,让消费者了解国内市场上销售的部分食品中含有人工合成甜味剂(糖清钠,甜蜜素)和防腐剂(苯甲酸钠,山梨酸钾)等食品添加剂的使用情况,正确认识食品添加剂,正确选择和食用含食品添加剂的食品,中国消费者协会在北京市场上购买了果冻,八宝粥,饮料,蜜饯,糖果,口香糖,无糖食品,酱莱等8大类,103个样品,委托中国进出口商品检验技术研究所,依照国家标准对样本进行测试,具体检测项目为糖精钠,甜蜜素等两种人工合成甜味剂,苯甲酸钠,山梨酸钾等两种防腐剂,以及食品的细菌总数,大肠菌群,金黄色葡萄球菌等卫生指标.这是中国消费者协会继200,2001年之后第三次对食品添加剂使用情况进行广泛测试.
本次测试结果显示,糖精钠,甜蜜素,苯甲酸钠,山梨酸钾这四种食品添加剂被广泛使用,103种样本,有87个含有甜味剂或防腐剂.但样本的细菌总数,大肠菌群,金黄色葡萄球菌等卫生指标情况较好.只有4个样本的细菌总数超标,其他样本没有发现存在微生物方面的问题.
本次测试发现,样本中食品添加剂的使用主要存在以下几方面问题:
1>甜味剂超范围,超限量使用问题依然严重
我国GB2760《食品添加剂使用卫生标准》中规定了食品添加剂的使用范围和使用限量,在标准中没有提及的食品种类,表示国家尚未批准在该类食品中使用某种添加剂.通过对此次测试结果的分析，几类食品样本中近50%的样本存在甜味剂和防腐剂超范围,超限量使用的情况.果脯蜜饯类20个样本中有17个样本存在超限量使用甜味剂现象,其中有14个样本糖精钠使用超标,占果脯蜜饯样本的70%;9个酱莱样本中有4个样本的甜味剂超标;44个饮料类样本中有7个样本甜味剂超标,均为甜蜜素超限量使用;果冻,糖果,口香糖和八宝粥样本中未发现超量使用的问题,但八宝粥中存在甜味剂超范围使用现象.具体情况如下:
蜜饯类食品中,有70%的样本糖精钠测试结果高于国家规定的使用限量,糖精钠最高含量超出允许限量12倍之多.有40%的蜜饯样本甜蜜素测试结果高于国家规定使用限量,检测出的最高含量是国家允许添加量的6.5倍.
酱莱类食品有1/3的样本糖精钠含量超出国家标准限量值.有1个样本的甜蜜素含量高达1581.14MG/KG,是国家使用限量值的2.5倍.酱莱中还有2个样本的苯甲酸钠含量高于限量值,其中1个样本的苯甲酸钠量达到2686.99MG/KG,超出国家允许限量4倍多.
在国家标准中八宝粥没有被允许使用糖精钠这一甜味剂.但测试的7个八宝粥样本中,都检测含有少量的糖精钠成分.
2>使用甜味剂或防腐剂没有明确标注或标注错误
国家标准GB7718《食品标签通用标准》中规定:食品添加剂应使用GB2760规定的产品名称和种类名称,甜味剂,防腐剂,着色剂应标明具体名称.本次检测出含有甜味剂或防腐剂的样本,发现部分样本没有按照国家标准的规定作出明确标注,同时还发现有些产品作了错误标注,如检测出含有苯甲酸钠,但标签标注却是山梨酸钾.标签标注问题较多的样本集中在蜜饯类和酱莱类食品.全部103个样本中,使用了防腐剂或甜味剂而没有标注或标注错误的共计67样次.
20个蜜饯样本中均检出含有糖精钠,有19个样本没有标注,只有1个样本进行了标注.11个样本没有标注含有的防腐剂苯甲酸钠,另有3个样本标注的防腐剂与实际检测完全不符,检测含有"苯甲酸钠",标签却标注为"山梨酸钾".
9个酱莱样本都没有标注出所含有的糖精钠,2个样本没有标注含有的甜蜜精,7个样本没有标注防腐剂或者防腐剂标注不全,如含有两种防腐剂只标注出一种.
44个饮料类样本中,有20.5%的样本没有明确标出其含有的甜味剂或防腐剂.
3>无糖食品中同样含有甜味剂
本次测试的样本中有14个是无糖食品.无糖食品是指不含蔗糖和淀粉糖.但必须含有糖醇等一类食糖替代品,我国提倡使用对健康有益的糖醇和低聚糖等食糖替代品,但无糖食品尚无国家标准或行业标准可循,各生产企业均按照企业标准进行生产.测试结果发现有5个产品中存在糖精钠,2个样本含有甜蜜素,3个样本同时含有糖精钠和甜蜜素,糖精钠含量最高达4019.61MG/KG,同时甜蜜素的含量为3882.78MG/KG.鉴于无糖食品的受用者一般为糖尿病者等特殊人群,那么,产品的宣传说明对消费者的指导意义更为重要,但有的产品包装上对无糖食品的宣传和介绍违反国家相关规定,宣传其具有降糖疗效.《广告法》规定:"食品,洒类,化妆品广告内容必须符合卫生许可的事项,并不得使用医疗用语或者易与药品混淆的用语."因此,消费者在选择和食用无糖食品时,不但要仔细阅读配料表,了解该产品添加何种甜味剂作为糖类替代品,还要认识到无糖食品只是一种食品,绝不能替代药物的治疗作用,更不能相信无糖食品有关降糖功效等医疗用语的宣传.
4>有些食品儿童不宜吃
果冻,饮料,蜜饯,糖果等都是儿童非常喜爱的食品,这次测试样本中果冻的质量普遍较好,其次是饮料样本中的果汁饮料和乳酸菌饮料,但蜜饯类食品样本中普遍存在问题,添加剂使用过量,该标注的添加剂没有标注等,儿童不宜食用这类食品.
食品中过量的添加剂会对儿童的生长发育和身心健康造成不利影响,儿童尤其是婴幼儿的免疫系统发育尚不成熟,肝脏的解毒能力较弱,极容易对食品中的添加剂产生过敏反应.目前世界一些发达国家对于儿童食品的安全问题相当关注,都在不断完善有关法规制度来保障儿童的健康安全.
联合国粮农组织及世界卫生组织(FAO/WHO)所属的食品添加剂专家委员会(JECFA)规定了食品添加剂的日许量(ADI值).ADI值的定义为:依据人体体重,终身摄入一种食品添加剂而无显著健康危害的每日允许摄入量的估计值,它是国内外评价食品添加剂安全性的首要和最终依据.糖精钠,甜蜜素,苯甲酸钠,山梨酸钾这四种食品添加剂的ADI值分别为5MG/KG,11MG/KG,5MG/KG,25MG/KG(单位MG/KG为每天每公斤体重允许摄入的毫克数).这一数值对于生产加工安全放心的儿童食品具有重要的参考价值.
5>糖精钠在食品中使用依然普遍
糖精钠属于非营养型人工合成甜味剂,其稀溶液的甜度是蔗糖的300~500倍,后味微苦,与蔗糖相同甜度的重量所产生的热量不能蔗糖产生热量的2%,在食品中的应用相当广泛.
因为20世纪70年代有人发现糖精钠含量达到5%~7.5%时,用来喂养的动物的膀胱癌发病率与糖精钠的摄入量明显相关,所以美国食品药物管理局曾提出禁止使用糖精钠.但也有学者认为上述实验与实际饮食中的摄入量有极大的差异,而且流行病学研究并未发现糖精钠的使用与膀胱癌的关联.联合国食品法典委员会规定了糖精钠的使用限量,同时对其使用范围加以限制.我国有关部门也曾为关于糖精钠等高倍甜味剂的生产使用下发通知,要求生产企业严格按照国家标准在规定范围内限量使用.
本次测试的103个样本中,有57个样本含有糖精钠,占受检样本量的55.3%,其中19个样本的糖精钠含量超过国家标准限量值,其余38个样本中的糖精钠国家尚未批准使用.
通过本次对一百余种食品中甜味剂和防腐剂的测试,我们发现人工合成食品添加剂的使用情况不容乐观,因此,特向广大消费者提示:
1.蜜饯类食品大量使用甜味剂,普遍使用防腐剂,而且多数没有在标签中明确标注所使用的添加剂,问题较多,质量不稳定.消费者应适量,适度食用蜜饯食品,尤其是话梅,陈皮类蜜饯,其甜味剂含量较高.特别是儿童,孕妇等人群不宜食用蜜饯类食品.
2.在我国,果汁(味)饮料国家规定其防腐剂的限量高于含气的碳酸饮料,这样可能会导致果汁(味)饮料中防腐剂的含量比碳酸饮料要高,儿童饮用果汁(味)饮料要适量.
3.对于无糖食品等特殊食品,消费者购买时要仔细查看其标签中的内容,尤其是配料表,不要相信其宣传的疗效功能,因为食品不是药品,这种宣传本身就是违法宣传.
4.建议家长给孩子购买零食时应谨慎选择,现市场上销售的儿童食品中,大部分含有食品添加剂,有些食品中食品添加剂使用超范围,超限量,这样的食品儿童经常食用对健康非常不利.有些油炸食品,膨化食品,也是造成肥胖儿的原因之一.
5.消费者购买食品时应选择品牌信誉度较高的产品,并尽量到正规超市,商场购买,以保证所选食品的安全性,保证自身健康.
我国对于食品添加剂的使用范围,使用限量经及如何标注等都在相关标准中作出了规定,但从企业得到的反馈情况看,企业对食品添加剂的使用范围及使用限量理解比较透彻,而对于标签标注问题,认为只要不超过限量值,标注与否并不重要.还有些企业对标签标准理解不透彻,认为只要不是企业作为配料主动添加的添加剂,可不标注.因此,中消协呼吁企业按标准逐步规范产品的标签标注,诚信生产经营,维护消费者知情权;呼吁国家有关主管部门应加大国家标准的宣贯力度,加强监督和检查,更好的维护广大消费者的权益,推动我国食品行业健康发展.
