如何利用脂质体研究膜蛋白与atp酶为例
研究论文：该研究以特征明确的AcrB为原型，提出了一种方便的工作流程，用于对嵌入脂质体中的膜蛋白进行冷冻-EM结构分析。结合优化的蛋白脂质体分离，冷冻样品制备和有效的颗粒选择策略，以3.9的分辨率获得了嵌入脂质体中的AcrB的三维（3D）重建。该研究方法可广泛应用于具有独特可溶域的膜蛋白的冷冻EM分析，为功能受跨膜电化学梯度或膜曲率影响的整体或外围膜蛋白的冷冻EM分析奠定了基础。
生物膜包围着拓扑隔离的隔室，包括细胞和细胞器，并为各种完整的和外围的膜蛋白（MP）提供了栖息地。这些物理屏障使生命必需的电化学梯度得以生成和维持，这是由于离子和化学物质在整个不可渗透膜上的不对称分布所致。各种生理过程都取决于这些梯度，例如由质子梯度（质子动力）驱动的三磷酸腺苷（ATP）合成和依赖跨膜电场存在的动作电位。因此，许多膜蛋白，例如电压门控离子通道（VGIC）以及一级和二级活性转运蛋白，都依赖于跨膜电化学梯度来执行其生物学功能。
约30％的编码基因编码的膜蛋白（MPs）在众多生理过程中起着至关重要的作用。膜蛋白是超过FDA批准药物一半的靶标药物。需要在近乎生理条件下对功能性膜蛋白进行高分辨率的结构研究，以提供深入的机理理解并促进药物发现。随着单粒子冷冻显微镜（cryo-EM）的分辨率革命，分离的膜蛋白的结构阐明已取得了快速进展。下一个挑战是保留电化学梯度和膜曲率，以便对膜蛋白进行全面的结构阐明，而膜蛋白的生物学功能依赖于这些化学和物理特性。
2020年7月17日，颜宁团队在PNAS 在线发表题为“Cryo-EM analysis of a membrane protein embedded in the liposome”的研究论文，该研究以特征明确的AcrB为原型，提出了一种方便的工作流程，用于对嵌入脂质体中的膜蛋白进行冷冻-EM结构分析。结合优化的蛋白脂质体分离，冷冻样品制备和有效的颗粒选择策略，以3.9的分辨率获得了嵌入脂质体中的AcrB的三维（3D）重建。该研究方法可广泛应用于具有独特可溶域的膜蛋白的冷冻EM分析，为功能受跨膜电化学梯度或膜曲率影响的整体或外围膜蛋白的冷冻EM分析奠定了基础。
生物膜包围着拓扑隔离的隔室，包括细胞和细胞器，并为各种完整的和外围的膜蛋白（MP）提供了栖息地。这些物理屏障使生命必需的电化学梯度得以生成和维持，这是由于离子和化学物质在整个不可渗透膜上的不对称分布所致。各种生理过程都取决于这些梯度，例如由质子梯度（质子动力）驱动的三磷酸腺苷（ATP）合成和依赖跨膜电场存在的动作电位。因此，许多膜蛋白，例如电压门控离子通道（VGIC）以及一级和二级活性转运蛋白，都依赖于跨膜电化学梯度来执行其生物学功能。
除了驻留在膜的内部或表面之外，膜蛋白与膜之间的相互作用也对细胞寿命产生了深远的影响。例如，许多外周膜蛋白定义了细胞器形成的膜轮廓。FoF1 ATP合酶的二聚化在塑造线粒体cristate中起着重要作用。机械敏感通道通过部分由膜变形施加的机械力控制。
当X射线晶体学是确定结构的主要方法时，解析膜蛋白的结构曾经极具挑战性。必须从破裂的膜中纯化出高度均质的膜蛋白，并用精心选择的去污剂取代以结晶。自2013年以来，冷冻电子显微镜（cryo-EM）单颗粒分析（SPA）已成为膜蛋白高分辨率结构解析的主流手段。已应用多种试剂将膜蛋白溶解为单个颗粒以进行分析。除了去污剂微团外，两亲，纳米圆盘和苯乙烯-马来酸脂质颗粒（SMALP）封闭的带有天然膜的纳米圆盘也已用于成功的膜蛋白冷冻-EM结构分析 。
尽管取得了这些进步，但所有上述膜蛋白分离方法都破坏了膜的拓扑结构，即使在SMALP环绕的带有天然膜片的纳米盘的情况下，也消除了任何现有的电化学梯度和膜曲率。为了保留这些重要特性，使用电子冷冻断层扫描（cryo-ET）的原位结构分析可能是最终的解决方案。然而，当前的技术障碍阻止了使用cryo-ET的高分辨率原位结构测定。另一种替代策略是研究嵌入脂质体中膜蛋白的结构，该结构已广泛用于膜蛋白的功能分析。
尽管使用蛋白脂质体进行了广泛的功能表征，但仅有有限的尝试将这种系统用于膜蛋白的结构阐明。在过去的十年中，已经开发了诸如随机球形约束（RSC）之类的方法来研究具有改进SPA策略的蛋白脂质体系统。但是，要在两个报告中执行精确的角度分配或信号减法，目标蛋白脂质体必须是接近完美的球体，这是很难获得的前提条件。两种方法都还需要对原始图像进行额外的预处理步骤。
为了将cryo-EM用于嵌入或附着在脂质体上的膜蛋白的结构分析，有必要为膜蛋白掺入，冷冻样品制备和cryo-EM数据处理开发高度可重复且方便的工作流程。为此，研究人员选择了来自大肠杆菌的经过充分研究的耐多药转运蛋白AcrB作为方法开发的原型。质子梯度驱动的AcrB是一种三聚体，分子量约为350 kDa。它是即使在低纯度和低浓度下也最易于结晶的膜蛋白之一。因此，AcrB的结构是在早期确定的。到目前为止，在蛋白质数据库（PDB）中使用X射线晶体学和单颗粒冷冻EM方法测定的AcrB结构超过100种，为结构验证提供了极好的参考。
在这项研究中，报告了一种工作流程，该流程具有优化的脂质体分离，低温样品制备，深层二维（2D）分类，用于数据处理。使用该研究的简化方法，获得了3.9分辨率的蛋白脂质体中AcrB的重建。该工作流程可轻松推广到蛋白脂质体中膜蛋白的结构测定中，并为使用蛋白脂质体系统在受控的电化学势或膜曲率存在下膜蛋白的结构分析奠定基础。
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顾学裘于50年代初立志从事药物制剂的研究。当时，中国的药物制剂研究和生产都十分落后，大量制剂依靠进口。顾学裘深感自己作为药剂学教授应为振兴和发展中国的药物制剂贡献所长，作出努力。当年的科研工作条件差、困难多，他发动和组织药剂教研室的教师，在简陋条件下进行生物制剂、乳剂和制剂辅料等多项研究。1955年，发表了《白及胶质的提取及其性能的研究》和《白及胶作为片剂赋形剂的研究》两篇研究论文，已被国内外许多研究、生产单位所引用。60年代，他在十分困难的条件下，仍坚持开展长效制剂和前体药物制剂的研究。他首创性地研制了长效维生素B12和长效普鲁卡因等新制剂。普鲁卡因长效制剂，国外是用普鲁卡因盐基制成的桃仁油溶液，而他设计研制的新制剂包括速效和长效两部分配制的水液，用药后既可迅速发挥止痛作用，又可维持较长时间的药效。1963年，他结合自己的研究实践，编写出版了《长效制剂综述》 （人民卫生出版社）。他在长效制剂和前体药物制剂的研究领域，当时处于国内领先的地位。70年代，他主要从事药物制剂新剂型的研究，包括静脉乳剂、微型胶囊、脂质体、磁性微球剂等。1978年，由他组建和领导的制剂研究室就是以新剂型为研究方向的。他看到癌症日益严重地威胁人类生命，就及时把工作重点转向抗癌药物新剂型的研究。在80年代的10年间，他领导研究室开展广泛协作，进行了卓有成效的研究工作，创制了抗癌药物“导弹”式载体——多相脂质体系列品种10余个，其中油酸多相脂质体（139）、复方唐松草新碱多相脂质体（139－2）、氟脲嘧啶多相脂质体（139－3）、环磷酰胺多相脂质体（139－7）等，已有多家药厂生产或准备生产。药理和临床研究结果表明，抗癌药物多相脂质体具有淋巴系统定向性，可以提高疗效，降低毒副作用。现在他的研究成果已经取得了较大的社会效益和经济效益。脂质体是70年代出现的一种新型药物载体，许多国家都在进行脂质体作为抗癌药物“导弹”的研究。但是由于脂质体对药物的包封量不足和加热灭菌不稳定等问题得不到解决，所以长期停留在实验室研究阶段。顾学裘首创的多相脂质体，突破了上述难关，使这一新型药物载体从实验室研究推进到工业生产和临床应用的阶段，并且由于他在组方和工艺上的革新，可使工业生产大大简化工艺过程。在1984年召开的成果鉴定会上，来自各地的专家对抗癌药物新剂型——多相脂质体的研究成果给予高度评价。鉴定书称“多相脂质体是在国外脂质体基础上创造的新剂型，设计思想科学，技术方法先进，解决了国内外脂质体研究中存在包封率较低和不能热压灭菌的两大技术关键问题，使脂质体从长期停滞在实验室研究进入到临床医疗和工业生产，有关键性的突破”。顾学裘在这10年多的抗癌药物新剂型研究中，先后发表了105篇论文；编写了60多万字的《中国多相脂质体研究》（即将由中国医药科技出版社出版）及《抗癌药物新剂型学术研究论文集》（中文本1册，英文本2册）；有32篇论文在七次国际学术会议上作了交流。1990年2月下旬，79岁高龄的顾学裘，亲自赴美国参加佛罗里达大学主持召开的国际脂质体学术讨论会，并作了《在抗癌化疗方面多相脂质体的研究》的学术报告，介绍了中国10多年来在“多相脂质体”的研究、生产和作为抗癌化疗药物“导弹”式载体用于临床的情况，博得了同行专家们的赞赏和重视。现在，年已八旬的顾学裘，仍以“老骥伏枥，志在千里”的精神，坚持奋进在攻克癌症的科研岗位上。他除了继续进行抗癌药物新剂型的研究工作外，还计划和主持编写《中药抗癌抗衰老研究进展》、《防癌抗癌纵横谈》、《汉日英拉药学词汇》、《科学的养生观》和《群芳谱》（药草花卉摄影图谱）等多部著作，决心为祖国医药事业奉献晚年余热。
