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广东省第二批“千百十人才工程”省级重点教师，第二届广东省高等学校教学名师。教育部生物教学指导委员会生物技术分会委员（2006-2010），中国植物生理学会生长物质专业委员会主任委员，广东省植物生长调节剂协会理事长，广东省植物学会副理事长。长期从事植物生长物质的基础理论，以及植物细胞工程的研究和教学工作。2006年以来，承担本科生和硕士研究生“植物生长物质”、“植物生长发育的化学控制”、“植物生理学实验”、“细胞生物学进展”等课程的教学任务，主持国家级精品课程“植物生理学”建设。在“细胞生物学”、“植物学”和“微生物与生物化学制药”专业招收研究生。主持国家自然科学基金面上项目、广东省自然科学基金项目、广东省科学计划项目、广东省教育厅自然科学重点项目等，研究内容有：1.脱落酸调节花生抗旱性分子机理研究；2.植物组织培养外植体褐变发生的细胞分子生物学研究；3.葛根素形成相关基因克隆和代谢调控研究。研究结果发表在《Plant Growth Regulation》、《植物学报》、《植物生理学报》、《园艺学报》、《作物学报》、《核农学报》等国内外权威刊物上，共发表论文五十多篇。和潘瑞炽教授合编的《植物生长发育的化学调控》和《植物组织培养》在广东省高等教育出版社出版。
基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又称为重组DNA技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。例如,要获得人类基因组中的某个基因，我们就需要借助基因克隆技术，进行目的基因的分离、克隆和扩增。因此，接下来，我就从基因克隆工具和具体的实验流程两方面进行介绍。
（ 1 ）限制性内切酶
首先介绍的是限制性核酸内切酶，它是细菌的“限制-修饰系统”防御机制的重要一员。限制修饰系统(Restriction-Modification System, R-M system )，即限制酶和甲基化酶系统（图1） [1]。研究者将能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖的酶称为 限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease，RE，简称限制性内切酶或限制酶）。而宿主细菌的DNA通过甲基化酶的甲基化后，DNA的酶切位点被保护起来，不会被限制酶切割。
根据限制性内切酶的结构，识别位点，切割位点等特性可以将RE分成四类（表1）[2]，基因克隆中常用的是II型限制性内切酶。不过像IV型内切酶这种可以识别修饰化DNA，可以用于表观遗传学的研究。
II型限制性内切酶是目前发现的最多的一类内切酶，根据其识别位点与切割位点的特性又可以分成不同的亚型[3]，例如我们常见的识别回文序列的内切酶， Eco R I，属于Type IIP类型，这种酶的切割位点在识别位点内部；而像现在在CRISPR/Cas9相关基因克隆中用到的 Bpi I等酶，则属于Type IIS型，它的切割位点离识别位点有几个到几十个碱基的距离。
既然是限制性内切酶，那么酶切DNA后就会留下不同的末端类型，这其中就包括粘性末端和平末端（图3）。所谓的粘性末端，就是酶切后有5’端或者3’端有突出碱基的末端类型，因此又分为5’ Overhang end，例如 Hin d III，和3’ Overhang end， 例如 Pst I两种。那些酶切后没有突出碱基的就属于平末端类型， 例如 Eco R V。
DNA碱基之间靠5’, 3’ 磷酸二酯键连接，限制性内切酶切割DNA后，出现的是5’-P 和3’-OH（图4）。
另外，根据限制性内切酶的功能，其又有同裂酶、异裂酶、同尾酶、可变酶和修饰敏感内切酶等类型（图5）。其中，同裂酶(isoschizomer)，又称异源同工酶，即从不同原核生物中分离出来的不同的Ⅱ型酶，有相同的识别特点和切割位点，例如 Age I和 Bsh T I。异裂酶则是指可以识别相同的核苷酸序列，但会在不同的位点切割 DNA，例如 Sma I和 Xma I。同尾酶(isocaudarmer)指不同来源的酶其识别和切割序列有一定的相关性，作用后能产生相同的粘性末端，例如 Age I和 Xma I，这一类的酶酶切后的产物可以进行连接，在基因克隆中有着重要的用途。可变酶则指所识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过6个碱基对，例如 Bst E II识别序列为：GGTNACC，其中N为一可变碱基，可以是A/T/C/G四种中的任何一个；而 Bst N I 的识别序列为CCWGG，其中的W则表示A或者T。修饰敏感内切酶是对DNA修饰（例如甲基化修饰）敏感的限制性内切酶，例如 Bcl I对甲基化的识别位点不能切割，但无甲基化的则可以进行切割； Dpn I则刚好相反，有甲基化才能切割。
限制性内切酶有那么多种，到底选择那种进行呢？
首先，我们需要进行酶切位点分析，可以使用在线（ Sequence Manipulation Suite 和 analyze-sequence, Addgene ）或者本地版（SnapGene）的分析工具进行序列分析。然后结合同裂酶、异裂酶、同尾酶、可变酶特性进行RE选择，并且同时要考虑所选限制性内切酶对修饰敏感性。另外，根据试剂使用中使用的酶的数量，我们将酶切反应可以分为单酶切、双酶切和分步酶切。 单酶切 ：同一个体系进行一种酶切反应； 双酶切 ：同一个体系进行两种酶的酶切反应（针对反应条件一致的限制性内切酶）； 分步酶切 ：样品进行完第一个酶切反应后进行纯化，再进行第二个酶切反应（针对反应条件不一样的限制性内切酶）。明确了以上信息后，我们就可以进行酶切反应了。一个酶切反应涉及样品类型，缓冲液，酶量以及反应温度和反应时间等。这些都可以参考限制性内切酶的产品使用说明进行操作。
（ 2 ） DNA 连接酶
限制性内切酶负责将DNA切开，DNA连接酶则是用来重新连接DNA的工具。DNA连接酶是一类催化双链DNA中相邻碱基的5’磷酸和3’羟基间磷酸二酯键形成的酶（图6）。因为是双链，所以一般要求连接位点不能出现碱基错配。不过实际应用中，DNA连接酶也会将有少量错配的DNA进行连接。DNA连接酶主要有两种：T4 DNA连接酶（平末端和粘性末端均可连接），大肠杆菌DNA连接酶（只能连接粘性末端）。
（ 3 ） DNA 聚合酶
之前我们介绍过PCR聚合酶链式反应，其中使用的就是DNA聚合酶。实际上，DNA聚合酶长具备三种酶活性（图7）：用于新链DNA合成的DNA聚合酶活性，用于错误参入碱基校正的3’-5’核酸外切酶活性，还有5’-3’ 核酸外切酶活性，在DNA复制中用于去除RNA 引物。借助这一活性，可以进行Nick translation，用于标记核苷酸参入等。但并不是每一种DNA聚合酶都这三种酶活性，NEB官网提供了一系列DNA聚合酶及其具备的功能活性（ DNA Polymerase Selection Chart-NEB ）。
根据所使用的DNA聚合酶类型不同，PCR产物的末端有3’-A粘性末端和平末端两种类型。其中Taq DNA polymerase因为缺乏3’-5’ exonuclease活性，其PCR的保真度低，且PCR产物的3’端多一个粘性末端A；而 高保真DNA polymerase保留3’-5’ exonuclease活性，有很高的校正活性，其PCR产物为平末端。
（ 4 ）无缝克隆技术
除了上面介绍的用于传统基因克隆中国的相关工具外，研究者开发了新型的基于插入片段和线性化载体的末端进行同源重组的基因克隆技术，即无缝克隆技术（Seamless Cloning），主要包括Gibson Assembly[4]和Getway Clone两种。这里我们重点介绍其中的Gibson Assembly。
Gibson Assembly技术包含了DNA 5' 外切酶(5' Exonuclease)、DNA聚合酶(DNA Polymerase)和DNA连接酶(DNA Ligase)活性的重组酶(assembly enzyme)，通过同源重组的方法可以将一个或多个DNA片段按照预定方向、快速、高效和精确地插入到线性化载体中，并且最终构建的克隆没有任何额外的碱基序列，因此被称作“无缝克隆”。如图9中Gibson Assembly所示，红色和绿色2个片段为需要连接的双链DNA片段，它们末端有相同的15-25个重叠序列（黑色），首先在50℃条件下，T5 exonuclease核酸外切酶降解5’端的一些碱基，形成3’端突出的单链，3’端单链互补退火；然后Phusion高保真聚合酶补上两条单链之间的缺口；最后Taq DNA ligase将相邻的单链切口连接补齐形成完整的DNA双链（图6）。
在Gibson Assembly基础上，研究者开发了TEDA[5]，仅添加T5 exonuclease核酸外切酶同样可以实现重组克隆，它与借助细胞体内的DNA修复机制进行缺损DNA的修复（图6）。
（ 5 ）工具载体
接下来我们介绍基因克隆中常用的工具载体。按照功能分，载体分为克隆载体和表达载体（表2）。其中克隆载体含有能在原核细胞中复制的元件，用来克隆和扩增基因；表达载体除了具备克隆载体的基本元件外，还具有转录/翻译所必须的DNA顺式元件。以下，我们将以SnapGene或addgene分析的载体结构图进行相关功能元件的说明。
以pUC19为例，说明克隆载体中的功能元件（图10）。
复制起始位点（ Origin of replication ， ORI ）： ORI是一段DNA序列，质粒复制的起始位置。DNA解螺旋酶可以作用于这段序列，然后DNA的双链被分开，复制随即开始。质粒必须是能够复制的，否则随着细菌的生长，质粒的数量将会被迅速稀释。 筛选标记，主要指抗生素抗性基因。 在含有抗生素的培养基中培养细菌，能够生长的就是含有目的质粒，因为，不含质粒的细菌已经被“杀死”了，原核中常用的抗性筛选基因有Amp和Kan。 Lac Z ：β-半乳糖苷酶基因，也是一种筛选标记，用于蓝白斑筛选。 多克隆位点（ multiple cloning site, MCS ）， 这是一段短DNA片段，包括多个限制性酶切的单一位点，便于外源基因的插入。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
以pcDNA3.1为例，说明表达载体中的功能元件（图11）。
表达载体pcDNA3.1除了有克隆载体相关元件，如复制起始位点Ori，原核筛选标记Amp外，还有一些其他的功能元件，如表3所示。
表达载体主要用于表达蛋白或者RNA，例如现在基因编辑中常用的一个表达载体PX458（图12），可以同时表达Cas9蛋白和sgRNA。因此上面也会携带一些其他的功能元件（表4）。
上面介绍的pcDNA3.1和PX458均是瞬时表达载体并不能在人类等细胞中进行复制，随着细胞的分裂，单个细胞中的质粒不断的被稀释，因此这些载体只能起到瞬时表达的效果。而慢病毒表达载体则可以介导表达元件整合到人类细胞的基因组中，这些表达元件可以随着基因组DNA的复制而复制，因此可以实现稳定表达。
我们常用的慢病毒载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，将其进行收集和浓缩后可直接感染宿主细胞或者动物模型，将外源基因有效地整合到宿主的染色体上，从而达到外源基因的持久性表达。我们以pGreenPuro为例说明慢病毒表达载体中一些关键的功能元件（图13，表5）。
（6）感受态细胞
感受态细胞是采用理化方法诱导过的细胞，它可以吸收周围环境中的DNA分子。实验室中我们常使用 E. coli 进行感受态细胞的制备，主要包括克隆用的感受态细胞和表达用的感受态细胞（图14）。
如果仅仅是进行质粒扩增，我们一般使用克隆感受态细胞。如果要进行原核蛋白质表达，我们则选择表达感受态细胞。并且感受态细胞的基因型也有很多类，是通过不同基因的缺失形成的，因而使细胞具有不同的特性，以满足不同的需要。例如，进行克隆载体和瞬转表达载体的扩增，常选用 E. coli DH5α，TOP10菌株；而慢病毒载体则一般选择低重组率的 E. coli Stbl3菌株。而对于非甲基化载体的扩增，则需要选择 E. c oli dam-/dcm- 等甲基化酶缺失的菌株。
2. 基因克隆流程
前面了解了基因克隆使用的相关工具酶和载体，接下来，我们介绍基因克隆的实验流程。细分的话，包括以下10个步骤（表6）。
下面我们以lncRNA PVT1的克隆和表达，分别采用T/A克隆，传统酶切-酶连克隆和无缝克隆进行示例。
(1) T/A克隆
T/A克隆是把PCR片段与一个具有3’-T突出的载体DNA连接起来的方法（图15）。使用该方法进行基因克隆时不需要考虑酶切位点问题，但需要选择Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，其产物的3’端才会多一个突出的A；此外，T/A克隆选用商业化的T载体，其为线性化的载体，在3’端有一个突出的T；并且基因片段连入T载体是没有方向性的，正反都有可能。
我们首先从NCBI上获取PVT1（human）的基因序列信息（ https :// ），然后使用SnapGene等进行PCR引物设计（图16）。以PVT1全长序列（1081nt）为模板，设计的引物正向引物的5’端与PVT1序列的5’端相同，反向引物的5’端与PVT1序列的3’端互补。然后使用Taq DNA 聚合酶，以细胞的cDNA为模板进行PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳或割胶回收目的大小片段（图17）。
胶回收的基因片段与商业化的T载体（pMD-18T）连接，形成重组DNA载体pMD18-PVT1（图18），经转化（图19）和菌落PCR（图20）后筛选到候选阳性克隆，再使用Sanger测序（图21）进行插入序列的鉴定，获得阳性克隆。
（2） 传统酶切 - 酶连克隆
传统酶切-酶连克隆主要是采用相同的限制性内切酶（或者同尾酶）分别酶切载体和基因片段，然后使用DNA连接酶进行连接，转化。以下，我们同样以PVT1为例，将其使用传统方法克隆至pcDNA3.1表达载体上。
我们在获得PVT1的基因全长序列后，需要首先进行酶切位点分析，例如使用SnapGene进行常用6碱基识别位点的限制性内切酶位点分析（图22）。同时，我们分析pcDNA3.1中MCS中可用的酶切位点，我们排除PVT1有的限制性内切酶并排除同尾酶（避免载体的自连），即可得到可用的限制性内切酶。在这里我们选择 Nhe I和 Eco R I（图23）。
接下来，我们以PVT1的全长序列为模板设计克隆引物（SnapGene设计的引物序列与T/A克隆中一样），不过我们还要在引物的5’端添加选择好的限制性内切酶的酶切位点以及相应的保护碱基（图24）。同样使用Taq DNA 聚合酶或者其他高保真DNA聚合酶，以细胞的cDNA为模板进行PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳或割胶回收目的大小片段。
回收的PVT1 PCR产物和pcDNA3.1载体均使用 Nhe I和 Eco R I进行双酶切，其中PVT1由于酶切后的序列为一个约1000bp的片段和一个约5bp的片段，无需进行割胶回收，直接使用PCR产物纯化柱进行酶切产物纯化即可（图25）。而pcDNA3.1的酶切由于可能存在未完全切开的质粒（在后续转化中会形成大量的假阳性克隆），需要进行琼脂糖凝胶电泳，割取线性化的载体片段进行胶回收（图25）。然后将PVT1和pcDNA3.1酶切片段使用DNA连接酶进行连接，转化。同样，使用菌落PCR和Sanger测序进行阳性克隆子pcDNA3.1-PVT1的筛选（图26）。
（3） 无缝克隆
无缝克隆的一个重要优势是不需要考虑待克隆片段中的酶切位点情况，因此直接选择相应的酶切位点将载体线性化后，根据载体的线性化末端进行同源引物的设计，PCR扩增目的基因并纯化后直接进行重组连接和转化（图27）。以下，我们同样以PVT1克隆至pcDNA3.1载体为例进行说明。
获得PVT1和pcDNA3.1的全长序列后可以使用SnapGene，CE Design（Vazyme）和In-Fusion Clone（Takara）等在线或本地软件进行同源臂引物的设计。
使用同源臂引物，以细胞cDNA为模板，使用高保真DNA聚合酶为模板进行PCR，胶回收相应片段。pcDNA3.1载体使用 Nhe I和 EcoR I进行双酶切后，割胶回收载体片段。然后添加无缝克隆试剂进行重组连接，转化后进行阳性克隆的筛选与鉴定。
而实际上，无缝克隆还有另外一个重要的优势：可以同时进行多片段的重组克隆，而这对于传统酶切-酶连克隆是一个很大的挑战。基于传统克隆技术可能需要克隆一个片段后，再在特定位置选择酶切位点，插入第二个片段，依次推进，这样不仅实验周期长，并且会在每个片段之间引入了额外的酶切位点碱基序列，可能影响到基因的完整性。不过可以通过融合PCR的方式，设计末端重叠的引物进行各个克隆片段的融合，但长的基因片段的PCR扩增本身也存在着失败率提高的问题（表8）。
总结
本部分我们主要介绍了基因克隆中使用的工具酶和载体，并以PVT1的克隆和表达载体的构建为例，分别介绍了T/A克隆、传统酶切-酶连克隆和无缝克隆技术的实验流程。
参考文献
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基因克隆(gene cloning)
是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。"分"是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；"切"是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；"连"是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；"转"是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；"选"则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因工程技术的两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达，而分子水平上的操作即是体外重组的过程，实际上是利用工具酶对DNA分子进行"外科手术"。
编辑本段基因克隆-基因
基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同的性状的根本原因，即所谓"种瓜得瓜，种豆得豆"，"一母生九子，九子各不同"。基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到表达。
编辑本段基因克隆-基因克隆技术
基因克隆技术包括了一系列技术，它大约建立于70年代初期。美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于1972年把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。 一般来说，基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。因此基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工程等。 采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程叫基因克隆。
编辑本段克隆过程概述
DNA的克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此DNA克隆又称分子克隆，基因操作或重组DNA技术。DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等等。 一 目的DNA片段的获得 DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA分子。由于基因组DNA较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA 或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因。 二 载体的选择 基因工程的载体应具有一些基本的性质：1）在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，这样才能使外源重组的DNA片段得以扩增。2）分子量尽可能小，以利于在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源DNA片段。同时在实验操作中也不易被机械剪切而破坏。 3）载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标记基因），以赋予宿主细胞的不同表型特征（如对抗生素的抗性）。4）载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。若载体上的单一酶切位点是位于检测表型的标记基因之内可造成插入失活效应，则更有利于重组子的筛选。 DNA克隆常用的载体有：质粒载体（plasmid），噬菌体载体（phage），柯斯质粒载体（cosimid），单链DNA噬菌体载体（ssDNA phage ），噬粒载体（phagemid）及酵母人工染色体（YAC）等。从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体，表达载体，测序载体，穿梭载体等。 三 体外重组 体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有粘性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的粘性末端，粘性末端彼此退火，通过T4 DNA连接酶的作用便可形成重组体，此为粘末端连接。当目的DNA片断为平端，可以直接与带有平端载体相连，此为平末端连接，但连接效率比粘端相连差些。有时为了不同的克隆目的，如将平端DNA分子插入到带有粘末端的表达载体实现表达时，则要将平端DNA分子通过一些修饰，如同聚物加尾，加衔接物或人工接头，PCR法引入酶切位点等，可以获得相应的粘末端，然后进行连接，此为修饰粘末端连接。各种连接策略间的关系总结如下： 四 导入受体细胞 载体DNA分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此可以在原核细胞如大肠杆菌中复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增，最终获得大量同一的重组DNA分子。 将外源重组DNA分子导入原核宿主细胞的方法有转化（transformation），转染（transfection），转导（transduction）。重组质粒通过转化技术可以导入到宿主细胞中，同样重组噬菌体DNA可以通过转染技术导入。转染效率不高，因此将重组噬菌体 DNA或柯斯质粒体外包装成有浸染性的噬菌体颗粒，借助这些噬菌体颗粒将重组DNA分子导入到宿主细胞转导技术，这种转导技术的导入效率要比转染的导入效率高。 五 重组子的筛选 从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。目前发展起来的成熟筛选方法如下： （一）插入失活法 外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。目前常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法。 （二）PCR筛选和限制酶酶切法 提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。 （三）核酸分子杂交法 制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段,或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。 （四）免疫学筛选法 获得目的基因表达的蛋白抗体，就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。这些抗体即可是从生物本身纯化出目的基因表达蛋白抗体，也可从目的基因部分ORF片段克隆在表达载体中获得表达蛋白的抗体。 上述方法获得的阳性克隆最后要进行测序分析，以最终确认目的基因。
