目 录
摘 要 I
Abstract II
1 绪 论 1
1.1 课题背景 1
1.2 生物脱硫的研究进展 3
1.3 微生物脱硫的代谢机理 4
1.4 表面活性剂 6
1.5 生物脱硫技术的发展前景 7
1.6 本论文的研究内容 7
2 实验部分 9
2.1 实验材料 9
2.1.1 菌株 9
2.1.2 主要试剂 9
2.1.3 培养基 10
2.2 实验仪器 10
2.3 菌种制备 10
2.4 菌液浓度及菌株生长曲线测定 11
2.5 分析方法 11
2.5.1 含硫杂环化合物及其代谢产物鉴定（GC-MS） 11
2.5.2 含硫杂环化合物及其产物浓度测定（GC） 11
3 实验结果与讨论 13
3.1 DBT代谢途径分析 13
3.2 表面活性剂对ZD-19脱硫活性的影响 18
3.3 不同SL的加入量对ZD-19脱硫活性的影响 19
第4章 总结与展望 20
4.1 实验总结 20
4.2 研究展望 20
参考文献 21
致 谢 23
附 录 24
1. 菌液浓度标准曲线 24
2. GC测定含硫杂环化合物和产物浓度标准曲线 24
3. ZD-19降解DBT不同反应时间的底物和产物变化趋势 26
1 绪 论
1.1 课题背景
随着全球工业化进程的迅猛发展，矿物燃料的需求量与日剧增。我们日常所用的燃料油中的硫主要来自所加工的原油。各类原油中含有不同浓度的含硫化合物，据对78种原油的总硫分析，含硫总量为0.03-7.89%[1]。
原油中的硫醇大部分是低分子量，在石油的炼制过程中易被除去，200℃以上沸点的石油产品中几乎很少存在。硫醚等脂肪族硫化物是沸点200℃以上石油产品如柴油中硫化物的主要成分，芳香族硫化物在较重的馏分中含量较低。虽然噻吩在原油中很少见，但噻吩的衍生物很多，苯噻吩、二苯噻吩、萘噻吩是高硫原油的重要组成。而且这些含硫化合物在原油加工过程中不同程度地分布于各馏分油中[2]。在流化床催化裂化（Fluidcatalytic cracke, FCC）汽油中，噻吩和各种取代噻吩是主要的含硫化合物，其中苯并噻吩（Benzothiophene，BTH）占30%。催化柴油馏分中的含硫化合物主要是BTH和二苯并噻吩（Dibenzothiophene，DBT）及各种烷基取代物[3]。
矿物燃料燃烧后产生的SO2是形成酸雾、酸雨等环境污染的重要因素。随着燃料油（汽油、柴油）用量的不断增加，能源危机的逐步加剧，高硫化石燃料的开采成为必然，由此造成的环境污染也日趋严重。目前欧美等发达国家对汽、柴油的硫含量都进行了严格的限制,我国规划汽油质量到2010年与国际标准接轨,如何有效地脱除油品中硫化物是保证国内炼油行业与欧美等发达国家相比具有竞争力的基础[4]。降低大气中的SO2排放量的最有效的办法就是减少燃料中的硫含量，针对高品质清洁燃料油的需求，迫切需要开发燃烧前深度脱硫技术。
多年来的持续开发使得低硫化石燃料越来越少，原油中的硫含量预计将从1985年的0.9%上升到2010年的1.4%。同时，世界范围的硫排放标准的日益严格，迫使炼油厂每年都将投入巨大的财力用来生产加工符合要求的低硫石油产品。为满足2005年的燃料规范，欧盟炼油业投资90亿美元。美国为满足柴油含硫50 μg/g的要求，炼油厂尚需花费50亿美元，若要达到15 μg/g的要求，至少需要增加一倍的投资[5]。因此，研究开发高效、低成本的燃料脱硫技术将成为今后几十年石油加工工业所面临的迫切问题。
我国是发展中国家，也是石油生产和燃料消耗的世界大国之一。严峻的环境形势，促使我国实施可持续发展战略，大力推行清洁生产技术。我国已颁布一系列环保法规，提出2003年1月1日起，将柴油硫含量从2000 μg/g降至300 μg/g，十六烷值从现在的40提高到53。将汽油硫含量从0.15%降至0.10%，其中三个主要城市实行汽油硫含量0.08%标准[6]。因此，研究开发高效、低成本的燃料脱硫技术，将对我国的环境保护和可持续发展战略产生积极而深远的影响。
目前油品的精制脱硫工艺和技术主要有以下几种[7]。1、催化脱硫工艺。它是一种传统的工业脱硫方法，是在金属催化剂的作用下，对石油进行高温高压下的加氢脱硫处理，将有机硫化合物转变为H2S，再进一步还原为单质硫；2、氧化脱硫醇，它主要是为了脱去石油中的硫醇类；3、吸附脱硫，它是利用固体吸附剂将有机硫化物从油品中分离出来；4、萃取—氧化法脱硫，用乙腈作萃取溶剂，将油中的二苯并噻吩萃取到乙腈相，乙腈相中加入光敏剂，使二苯并噻吩发生光氧化反应，生成极性化合物，与油相分离；5、膜分离技术，这一技术主要用于处理轻馏分到中等馏分的汽油。这种简单的膜分离系统将进料的汽油馏分分割成两段产品物流，一股物流的体积流量相当与进料的70－85%，其中的硫含量低于 30 μg/g，另一股较小的流量则集中了绝大部分含硫化合物，需要作进一步处理；6、生物脱硫技术（biodesulfurization, BDS），是在温和的条件下，利用适宜的细菌或酶代谢过程催化特定的脱硫反应，释放出硫而将烃类保存下来的过程。纵观以上提到得脱硫方法生物脱硫技术是最具发展前景的技术，它更加环保，更加具有工业利用前景。
同时，生物催化脱硫技术是在温和的条件下，利用适宜的细菌或酶代谢过程选择性催化的脱硫反应，释放出硫而将烃类保存下来的过程。细菌的生存是以硫而不是碳为能源。在生化反应过程中，细菌或酶可以再生或自身补充。生物脱硫是21世纪很有发展前途的脱硫技术之一。该项技术的研究进展已引起国内外的广泛关注。国外一些著名的研究和开发机构，如美国的能源生物系统公司、橡树岭国家实验室，以及日本的石油能源中心等，自90年代初期以来已投入数千万美元将BDS作为关键的高新技术来研究和开发，美国政府也在最近的几年里从政策和资金上对该项技术的研究和开发给予了大力支持[8]。我国的一些研究机构（如中科院过程工程研究所）也对生物脱硫技术极为关注，但与国际水平相比仍有很大的差距。
由于自然界中细菌的存在，炼油厂的废水和焦油污染的土壤里的硫化物的一部分在自然条件下会发生生物降解，这为油品的生物脱硫提供了理论基础和事实依据。自然界中代谢有机硫化合物的细菌不是很多，生物脱硫技术主要利用筛选的特效菌种对油品中含硫化合物有很高的降解能力的特点，使油品中的有机硫化合物变成水溶性的产物，从而进一步从油品中分离出来[9]。
1.2 生物脱硫的研究进展
发展工业化的微生物催化脱硫技术大致可分为以下几个方面：脱硫微生物的分离、脱硫机理的研究(代谢途径的阐明、代谢过程中所涉及的酶及基因的分离纯化和鉴定)、基因重组技术对脱硫微生物
的改进(活性、稳定性、生长特性等)、生物脱硫工艺过程开发(生物催化剂的生产、固定化、反应条件的优化、工艺过程的设计及反应器的选择等)和工业化生产等。
20世纪30年代，人们开始设想用微生物除去化合物中的硫，由于相关技术的缺乏，研究的内容被局限在从自然界筛选脱硫的微生物上, Maliyantz曾报道用硫还原菌脱除了原油中的硫。20世纪50年代Stawinski公布了第一份石油生物脱硫的专利，后来的几十年中，由于相关技术的缺乏，研究的内容被局限在自然筛选能有效脱硫的微生物上，这期间陆续发表了许多专利，但都没有工业应用。20世纪70年代，BDS技术的研究进入第二次高潮，研究者们开始研究BDS代谢机理，发现当时所选的微生物不适合商业化应用，因为微生物会破坏杂环硫化物的碳骨架，将其变成水溶性产物从燃料中脱除，损失了燃料的燃烧值。20世纪80年代，生物技术的飞跃发展，给BDS技术研究带来了新的生机。人们把生物脱硫的研究重点放在以石油中含量多的含硫杂环有机化合物二苯并噻吩(DBT)为模式化合物的微生物降解研究领域，阐明了BDS代谢机理。20世纪90年代，基因工程技术的发展将简单的寻找脱硫微生物的工作提高到利用DNA重组技术克隆高效、专一脱硫的微生物，或通过有效的分离技术纯化高活性脱硫酶。遗传学家利用分子生物学技术，分离和表达了基因脱硫活性的特定酶的编码基因，通过对脱硫微生物进行质粒接合和转化，获得了转化子突变株，再通过常规培养，生产出了工业规模的生物催化剂，从而使BDS技术有了突破性进展。PetroStar炼油公司与EBC及其他公司联合，预计2002-2005年在阿拉斯加州建成5000 b/d的柴油生物脱硫生产示范装置[10]。
目前，许多政府、公司、大学等机构已投身于生物脱硫这个浪潮中。其中规模较大的有EBC、日本石油能源中心、Tsukuba大学、Totori大学、美国天然气技术研究所、美国Oak Ridge国家实验室、美国Brookhaven国家实验室。此外，加拿大、韩国、德国、意大利、西班牙、中国及其它国家的研究机构也在致力于这方面的研究。但到目前为止，生物脱硫还没有进入工业化生产，走在生物脱硫最前沿的仍是EBC[11]。
从发表的文献看，一些脱硫微生物的应用、脱硫机理和途径、脱硫动力学及工艺条件的研究、各种微生物脱硫基因的鉴定和分离技术的应用在近十年的文献报道中占据了主导地位。
1.3 微生物脱硫的代谢机理
燃料油中的无机硫化合物，以及部分有机硫化合物可以通过催化加氢脱硫除去。而噻吩类硫化合物，尤其是DBT，一直是加氢脱硫的一个难题。这种化合物十分稳定，在高温高压下也难以被催化加氢。而且DBT与其衍生物广泛存在于石油的有机硫组份中，占了燃料油中有机硫的重要部分。因此在燃料油生物脱硫中，DBT及其衍生物作为典型的难脱除有机物的代表，常被用作模型化合物来研究。
酶脱硫途径主要有两种，一种是还原途径，另一种是氧化途径。还原过程与HDS过程很相似，在还原菌种的作用下，脱除有机硫化合物中的硫，生成硫化氢气体，此过程由于没有氧的存在，可以防止烃类物质的氧化，减少油品热值的损失。但还原菌种脱硫率不高，并且很难降解芳香族含硫化合物，特别是DBT及其衍生物。因此，常常采用氧化法脱硫路线。在氧化路线中，有机硫被转变为硫酸盐。其脱硫路线分为两种途径，一种是碳代谢的Kadama途径，另一种是硫代谢的4S途径。三种路径如图1.1所示。
图1.1 DBT生物脱硫的三种途径
（a）Kadama路线，（b）4S途径，（c）还原路径
Kadama路线如图1-1(a)所示[12]。这一路线是在从土壤中分离出的假单胞菌(如Pseudomonas)，拜叶林克氏菌(Beijerinckia)及不动杆菌(Acinerobacter)和根瘤菌(Rhizobium)的混合培养中发现的。Kodama代谢路径是在非硫选择性生物催化剂的作用下，剪断苯环上的C-C键，将DBT代谢成可溶入水的3-羟基苯并噻吩-2-甲醛。由于整个含硫化合物转入水相，油中含硫百分比并没有减低多少，反而降低了有价值烃的热值，工业化应用价值小。若油中含硫化合物以DBT计算，则其质量约为硫原子的5.3倍，即硫质量分数为0.2%的油品脱硫后收率约损失1.0%。
4S氧化路径是一种硫选择性氧化过程，在生物催化剂的作用下，选择性的剪断含硫化合物中的C-S键，将有机化合物中的硫原子氧化成无机硫化合物转入水相，含硫化合物脱去硫原子后仍留在油相中，不损失油的热值。脱硫过程中，有四种酶（DszA、DszB、DszC、DszD）参与反应，DBT首先在DszC酶催化作用下氧化为DBT亚砜（DBTO），DBTO在同种酶的作用下氧化为DBT砜（DBTO2），DBTO2又在DszA酶的催化作用下氧化成羟苯基磺酸盐（HPBS），最后在DszB酶的作用下脱去硫，得到2-羟基联苯（2-HBP）和硫酸盐[13]，具体过程如图1.2所示。DszA和DszC酶的催化作用需要在NADPH-FMN氧化还原辅酶的共作用下才能完成，并通过DszD酶来活化和提高催化活性[14]。DszA酶的催化反应速率比DszC酶要快5～10倍，最后一步DszB酶的催化反应最慢，是该脱硫过程的限速步骤[15]。普遍认为这种脱硫方式最具有工业化应用价值。
图1.2 DBT脱硫的“4S途径”
1.4 表面活性剂
表面活性剂分子缔合形成胶束的最低浓度即为临界胶束浓度(critical micell concentration, CMC)。当其浓度高于CMC值时，表面活性剂的排列成球状、棒状、束状、层状或板状等结构。生物脱硫反应在油、水界面进行，在有机反应体系中，生物降解存在的关键问题是不溶或微溶于水的有机物分子在油、水两相间的传
质速率太低。表面活性剂具有乳化和增加油、水界面面积的作用，有助于提高生物脱硫效率[16]。
大豆卵磷脂是从大豆中提取的精华物质，也是人体需要的脂类成分之一。大豆卵磷脂是人体细胞的基本构成成份，对细胞的正常代谢及生命过程具有决定作用。大豆卵磷脂作为一种天然的亲水亲油两性表面活性剂，具有优良的乳化、分散、润湿、增容、起泡、脱模和抗氧化等作用。Wei .C.I和Sen..A.C曾经做过类似物的毒理实验发现大豆卵磷脂是无毒的[17]。
1.5 生物脱硫技术的发展前景
尽管生物脱硫技术具有诱人的工业应用前景，但BDS 技术总体上还是处于研究开发阶段，目前仍然面临许多挑战，为该技术的迅速发展设置了屏障。实现工业化之前仍有许多问题需要解决，存在的问题主要有两个方面：一是生物催化剂的发展，如细菌对含硫杂环芳烃的代谢机理还不
十分清楚；生物催化剂性能仍有待于提高，包括催化剂的活性、选择性和寿命[18]等；菌种的选择，生物催化剂的生产和再生等问题。二是BDS技术的工艺和工程问题，包括新型生物反应器的设计、分离技术(油、水和生物催化剂的分离)、副产品的处理以及如何提高产品的质量[19]等。生物脱硫技术取得商业成功的两个关键是找到最合适的方法使生物技术与现存的精炼技术和石油化学工业的技术整合起来，并继续研究使此技术取得快速进展。生物脱硫技术是具有特殊要求和压力的镍精炼技术与石油化学工业规划完全结合发展起来的。当然, 现在提倡BDS 技术, 并不是否定了或放弃以前的HDS工艺, 根据具体情况也可采用加氢脱硫-生物脱硫工艺联合[20], 以求达到更好的脱硫效果，实现新的突破。
我国石油炼制行业普遍面临深度脱硫的问题，生物脱硫虽然刚刚起步，但在菌种筛选和基因改良方面已有良好的开端。国内生物技术在石油化工领域的应用有一定的基础，应该通过联合攻关，有计划、有步骤的实现产业化。生物脱硫由于其固有的优势，在国内外有着广泛的应用前景，尤其是随着国内进口高硫原油比例不断上升，以及国内含硫排放标准的国际化进程，生物脱硫及其相应的辅助脱硫途径必将占据重要地位。
1.6 本论文的研究内容
由于加氢脱硫(HDS)难以除去DBT及其衍生物，而DBT广泛存在于化石燃料中，所以生物脱硫(BDS)多以DBT作为模式化合物来进行研究。目前己经筛选到不少可以专一脱硫的菌株，并且已经阐述清楚其脱硫途径，即专一性作用于DBT的硫，打开C-S键，生成2-HBP。这种途径保持DBT的芳香结构不变，从中脱硫而又最少量氧化碳骨架，因此热值下降小，在微生物脱有机硫方面具有广阔的应用前景。因为该途径反应的四个中间产物名称均由S开头(sulphoxide/ sulphone/ sulphonate/ sulphate)，故称为4S途径[21]。
影响微生物脱硫效率的一个关键因素是细胞对DBT类有机硫的吸收能力。它与细胞和有机相之间的接触情况或烃类在液相中的可溶性有关[22]。Setti L 等发现[23]，菌体对有机相的亲和性增强时，DBT 的降解速率也增加，这表明DBT吸附发生在有机相与水相的界面。如果在生物脱硫过程加入合适的表面活性剂就可以提高含硫有机物从油相到水相的传质效率，进而提高脱硫效率，有关此方面的研究国内外都很少。
现实验研究主要从以下几点着手：
4． 利用实验室现有脱硫菌种Mycobacterium sp.ZD-19对DBT降解产物和中间产物的GC-MS分析，考察微生物在水相中脱硫的特性，与文献报道作比较分析，确定微生物的4S脱硫的途径，及新的产物甲氧基化途径。
5． 选择适当的表面活性剂，考察活性剂的加入对微生物脱硫的影响。
2 实验部分
2.1 实验材料
2.1.1 菌株
ZD-19，实验室自行分离得到，经16S rDNA鉴定属于分枝杆菌属（Mycobacterium sp.）。
2.1.2 主要试剂
二苯并噻吩（Dibenzothiophene，DBT），纯度99%，购自Acros，溶于乙醇，配制成50 mmol/L作为贮备液。
2-羟基联苯（2-Hydroxybiphenyl, 2-HBP），纯度99+%，购自Acros，溶于乙醇，配成50 mmol/L作为贮备液。
β－环糊精（beta cyclodextrin, β-CD），化学纯，购自中国医药（集团）上海化学试剂公司，溶于乙醇，配成10 g/L作为贮备液。
大豆卵磷脂（Soya Lecithin, SL），化学纯，购自上海伯奥生物科技有限公司，溶于乙醇，配成10 g/L作为贮备液4oC保藏。
吐温-80（Tween-80），化学纯，购自浙江省温州清明化工有限公司，溶于乙醇，配成10 g/L作为贮备液。
正十六烷（n-Hexadecane），分析纯，购自天津市化学试剂研究所。
0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）：称取0.5304 g KH2PO4，和1.3908 g K2HPO4•3H2O溶于100 ml去离子水中。高温蒸汽灭菌后备用。
0.85%生理盐水：称取0.85 g NaCl，溶于100 ml去离子水中，灭菌备用。
50%甘油：丙三醇和等体积去离子水混合。
水洗琼脂：取一定量琼脂粉，在适量蒸馏水中浸泡数天，每天换水，已除去无机盐和其他可溶性有机物，然后用无水乙醇浸泡过夜，过滤后自然晾干，备用。
2.1.3 培养基
基础无机盐培养基BSM（Basal Salts Medium）配方：K2HPO4•3H2O 5.0 g，NaH2PO4•2H2O 2.0 g，NH4Cl 2.0 g，MgCl2•6H2O 0.2 g，微量元素1 ml，甘油4 g，蒸馏水1000 ml。高温蒸汽灭菌备用。
微量元素混合液组成（ml）：CuCl2•2H2O 0.1 mg，CoCl2•6H2O 0.4 mg，ZnCl2 0.2 mg，CaCl2 20 mg，H3BO3 0.05 mg，NaMoO4•2H2O 0.2 mg ，FeCl3•6H2O 4 mg，AlCl3•6H2O 0.1 mg，MnCl2•4 H2O 0.8 mg。
液体选择培养基BSDM：灭菌后的BSM中加0.2 mmol/L DBT-乙醇溶液作为唯一硫源。
固体选择培养基BSDM平板和斜面：液体选择培养基加1.5-2%水洗琼脂，高温蒸汽灭菌后倒平板或搁置斜面。
2.2 实验仪器
9790A型气相色谱仪，浙江温岭福立分析仪器有限公司；
可见分光光度仪，上海校光技术有限公司；
超净工作台，苏净集团安泰公司；
THZ－C型恒温振荡器，江苏太仓市实验设备厂；
LD5-2A型低速离心机，北京医用离心机厂；
YXQ.SG41.280手提式压力蒸汽灭菌器，上海华线医用核子仪器有限公司；
DRP-9052型电热恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司。
2.3 菌种制备
菌种活化：将4℃冰箱保存的ZD-19菌种接种于空白斜面培养基，30℃恒温培养4-5 d。
种子培养：为保证每批实验的一致性，先培养种子，方便统一接种量。选择BSDM作为培养基，灭菌后，接入经活化菌种，置于摇床30℃、180 rpm条件下培养48 h，收集得菌体作为种子。如需种子多，几瓶种子可以混合用。
休止细胞制备：细胞在以DBT为唯一硫源的BSM培养基中培养至对数生长后期，培养液于5000 rpm，10 min离心分离，保留沉淀细胞，用0.85%的生理盐水洗涤2-3次，再根据所需菌液浓度，悬浮于pH 7.0 的0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液中制成菌悬液，置于冰箱4℃下保存。
2.4 菌液浓度及菌株生长曲线测定
测定菌液在620 nm波长下的吸光度，通过吸光度与细胞干重的线性关系，得到对应的菌液浓度值(g/L)。菌液浓度(Dry cell weight, DCW)和OD620的标准曲线见附录1。
对于微生物的生长情况，一般以群体生长作为衡量指标，微生物培养过程的生长曲线，即从接种到培养结束细胞数量的变化曲线，同时还考察了底物的降解和产物的生成情
况。脱硫菌ZD-19的生长曲线见附录2。
2.5 分析方法
2.5.1 含硫杂环化合物及其代谢产物鉴定（GC-MS）
各种含硫杂环化合物及其降解产物以GC-MS确定。培养液加10%HCl酸化至pH≤2.0，然后用等量的乙酸乙酯萃取，5000 rpm离心分离10 min，收集上层乙酸乙酯相，加入少量无水硫酸镁，静置过夜，脱去残余水分，样品送GC-MS分析鉴定。
2.5.2 含硫杂环化合物及其产物浓度测定（GC）
有机硫化物DBT、噻吩、苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩、二苯硫醚，以及产物2-HBP的浓度均以气相色谱分析，检测器为FID，色谱柱型号为SE-54，规格为30 m×0.32 nm×0.33 μm，由中国科学院兰州化学物理研究所色谱技术研究开发中心制造。
分析条件：各物质均以乙酸乙脂为萃取相，DBT和2-HBP测定的柱温维持200℃，采样时间设为15 min，检测器和进样器均设为280℃。载气为氮气，流速为2.07 ml/min；H2为FID检测器燃料气，流速为30 ml/min；空气为助燃气，流速300 ml/min。
3 实验结果与讨论
3.1 DBT代谢途径分析
分枝杆菌ZD-19能够以DBT为唯一硫源生长，使用GC-MS分析研究了菌株ZD-19生长细胞脱除DBT硫的代谢途径。在菌株培养对数中后期取样，使用乙酸乙酯萃取样品，然后进行GC-MS分析(图3.1至3.4)。
图3.1 ZD-19降解DBT的GC-MS气相色谱图
图3.2 ZD-19降解DBT气相谱图中7.26 min底物DBT质谱图与标准图谱的对照
图3.3 ZD-19降解DBT气相谱图中5.45 min产物2-HBP质谱图与标准图谱的对照
图3.4 ZD-19降解DBT气相谱图中5.74 min产物2-MBP质谱图与标准图谱的对照
GC色谱图(图3.1)显示，样品中共有3个物质峰。色谱峰1在7.26 min的物质，经过质谱分析以及和标准谱库对照(图3.2)，确定为底物DBT。色谱峰2在5.45 min的物质，经过质谱分析以及和标准谱库对照(图3.3)，确定为产物2-HBP。该物质为DBT按4S途径代谢的终产物。
根据GC谱图，在2-HBP出峰后面，色谱峰3在5.74 min有一个不同于传统4S途径的新物质出现，经过质谱分析(图3.4)，证实该物质为2-甲氧基联苯(2-methoxybiphenyl, 2-MBP)。根据ZD-19生长曲线，结合GC分析观察到，随培养时间继续有2-HBP减少，2-MBP增大的趋势，这一点与之前实验中观察到的细胞培养和休止细胞脱硫过程中2-HBP有减少的现象相符，也就是说2-HBP确实能被分支杆菌ZD-19进一步转化，2-HBP上的羟基甲基化生成2-MBP。
脱硫菌ZD-19代谢DBT的生物脱硫途径有别于传统的4S途径，2-HBP不是脱硫反应的最终产物，相当于延伸了4S途径的代谢路径。这一点与之前报道的两株分支杆菌相同[24,25]，推测在某些分支杆菌中含有一种甲基转移酶起主要作用。
图3.5 ZD-19脱硫底物和产物浓度变化
根据GC-MS鉴定结果，利用GC的出峰时间来定性各出峰物质，出峰面积来定量物质浓度，应用ZD-19进行DBT脱硫反应，初始菌液为浓度25 g/L, 与0.5 mmol/L DBT 反应，测定不同反应时间的底物消耗和代谢产物生成情况。图3.5定量反映ZD-19脱硫过程中底物消耗以及产物生成的浓度变化，根据GC谱图（附录3）直观地反映不同反应时间的底物和产物变化趋势。
3.2 表面活性剂对ZD-19脱硫活性的影响
初始DBT浓度: 0.8 mmol/L，油水比为1.0，加入表面活性剂：β-环糊精(beta-CD)，大豆卵磷脂（soya lecithin），吐温-80（Tween-80）各0.1 g/L，反应时间 t = 4h。实验结果如图3.6。
图3.6 表面活性剂的加入对ZD-19脱硫活性的影响
从图中显示反应4 h后，对照组（未加入表面活性剂）剩余的DBT浓度为0.19 mmol/L，在加入不同表面活性剂的各组中DBT剩余量都有不同程度减少，而大豆卵磷脂的加入更是极大的促进了ZD-19的脱硫活性，可以使脱硫效率提高73%。由于在有机反应体系中，生物降解存在的关键问题是不溶或微溶于水的有机物分子在油、水两相间的传质速率太低，而表面活性剂的加入可提高DBT在油、水两相中的传质效率，就能够有效地提高脱硫效率。其中大豆卵磷脂作为一种天然的亲水亲油两性表面活性剂，效果更佳。
3.3 不同SL的加入量对ZD-19脱硫活性的影响
从上实验看出，三种表面活性剂中，大豆卵磷脂（SL）对脱硫的促进效果最明显。故针对大豆卵磷脂，设置不同表面活性剂浓度0 g/L，0.1 g/L，0.2 g/L，0.3 g/L，0.4 g/L，0.5 g/L和0.6 g/L，进行具体实验。
实验条件：反应体系为油水两相 （1：1），菌种使用ZD-19，反应时间 t = 3h， 初始DBT加入量为0.6 mmol/L。实验结果如图3.7。
图3.7 不同SL的加入量对ZD-19脱硫活性的影响
根据实验结果发现，当SL的加入量为0.2 g/L 时，其对微生物脱硫的促进作用最大，可以在很大程度上提高微生物的脱硫速率。适量的表面活性剂能有效改善DBT在水中的分散度。当浓度过高时，一方面会引起溶液粘度增大，胶粒移动困难；另一方面表面活性剂之间发生桥联效应，将导致表面张力增加，不利于传质。
第4章 总结与展望
4.1 实验总结
(1) 通过GC-MS检测研究ZD-19代谢DBT的途径。结果表明，菌株代谢产生的终产物为2-MBP，有别于传统的4S途径，2-HBP作为降解DBT的中间产物，苯环上连接的羟基会被甲基化，生成2-MBP。在休止细胞降解DBT过程中，传统4S脱硫产物2-HBP会被完全转化为2-MBP，扩展了4S脱硫途径。
(2) 表面活性剂如β－环糊精、大豆卵磷脂、吐温-80的加入可以显著提高ZD-19的生物脱硫性能。其中以大豆卵磷脂（SL）的效果最明显，极大的促进了ZD-19的脱硫活性，可以使脱硫效率提高73%。当SL的加入量为0.2 g/L 时，其对微生物脱硫的促进作用最大，可以在很大程度上提高微生物的脱硫速率。
4.2 研究展望
本论文只是对分支杆菌ZD-19的一些基本性质作了初步研究。BDS技术具有广阔的工业应用前景，但仍需制备高活性的生物催化剂，进一步确定微生物脱硫的反应机理和其在反应器中的传质－反应机理，为工业化应用奠定基础。对今后工作提出以下几点建议：
(1) DBT的代谢途径基本研究清楚，购买2-MBP标准物质，进一步研究新产物对于菌株生长和脱硫的影响，以了解新途径的发现是否有利于生物脱硫技术的提高。
(2) 油品的生物脱硫涉及含生物催化剂的水相和油相组成的多相多酶催化反应体系，研究表面活性剂优化油水相传质效率，或采用固定化细胞优化油水分离和催化剂回收等，为生物脱硫技术工业化应用奠定基础。
(3) 分析比较多种有机硫化合物共存时
菌株的总体脱硫能力，以及推广到在实际燃油体系中的脱硫情况，为燃料油生物脱硫技术的工业化做好准备。
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致 谢
本论文是在导师曾翎教授和李伟教授的悉心指导下完成的，导师活跃的学术思想、严谨的治学态度、渊博的知识和踏实的工作作风为我树立了榜样，让我受益匪浅。论文从设计、实验到撰写与修改，凝结了导师大量的心血，感激之余，学生在此谨致最深的谢意。
感谢本课题组的陈晗师姐和张士汉师兄在实验工作中不辞辛劳地为我讲解实验注意事项，不厌其烦地给我讲实验机理，毫无保留的示范实验技巧，给我提出了许多宝贵的建议，并给予了热心的指导和帮助，在此表示诚挚的感谢。同样感谢实验室的各位同门在平时工作和生活中的诸多支持与帮助，令我度过了难忘的半年时光。
最后，还要特别感谢我的家人多年来对我的全力支持和付出！谢谢！
