英文摘要 Ⅱ
目录 Ⅲ
1. 绪论 1
1.1 酿酒酵母S02原生质体制备的意义 1
1.1.1 制备原生质体的原由 1
1.1.3 原生质体融合的优越性 1
1.2 酵母菌类属 2
1.3 人类对原生质体的了解 4
1.4 酵母菌细胞壁的组成 3
1.5 人类对酵母菌的应用 4
2. 实验部分 6
2.1 材料 6
2.1.1 菌种 6
2.1.2 主要试剂 6
2.1.3 主要仪器 6
2.1.4 培养基 7
2.2 方法 7
2.2.1 原生质体的制备 7
2.2.1.1 菌体培养方法 7
2.2.1.2 原生质体的形成 7
2.2.1.3 原生质体形成率的方法 7
2.2.2 各个单因素对原生质体形成率的影响 8
2.2.2.1 酶解时pH值对原生质体形成率的影响 8
2.2.2.2 酶解温度对原生质体形成率的影响 8
2.2.2.3 酵母菌菌龄对原生质体形成率的影响 8
2.2.2.4 混合酶中酶的相互比例对原生质体形成率的影响 8
2.2.2.5 酶解时间对原生质体形成率的影响 9
2.2.2.6 酶解液浓度对原生质体形成率的影响 9
2.2.2.7 渗透压稳定剂浓度对原生质体形成率的影响 9
2.2.2.8 渗透压稳定剂种类对原生质体形成率的影响 9
2.2.2.9 酿酒酵母S02原生质体形态观察 9
3. 结果与讨论 10
3.1 各个单因素对原生质体形成率的影响 10
3.1.1 酶解时pH值对原生质体形成率的影响 10
3.1.2 酶解温度对原生质体形成率的影响 11
3.1.3 酵母菌菌龄对原生质体形成率的影响 12
3.1.4 混合酶中酶的相互比例对原生质体形成率的影响 13
3.1.5 酶解时间对原生质体形成率的影响 14
3.1.6 酶解液浓度对原生质体形成率的影响 15
3.1.7 渗透压稳定剂浓度对原生质体形成率的影响 16
3.1.8 渗透压稳定剂种类对原生质体形成率的影响 17
3.1.9 酿酒酵母S02原生质体形态观察 18
3.2 本章小结 20
4.结论与展望 21
致谢 24
参考文献 25
附录 26
1.绪论
1.1酿酒酵母S02原生质体制备的意义
1.1.1制备原生质体的原由
制备大量具有活性的原生质体是微生物原生质体融合育种的前提。酿酒酵母S02具有遗传稳定性良好，酒精生产率高的特点，因此选择酿酒酵母S02作为融合育种的融合子。
1.1.2原生质体融合的定义
所谓原生质体融合就是把两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加以瓦解，使菌体细胞在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹的球状体（称原生质体）。两亲本的原生质体在高渗条件下使之混合。由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使他们互相凝聚，发生细胞融合，从而实现遗传重组。在再生成细胞的菌落中就有可能获得具有理想性状的重组子[1]。
1.1.3原生质体融合的优越性
原生质体融合技术有以下优点：1.去除了细胞壁的障碍，亲本基因组直接融合、交换，实现重组，不需要有已知的遗传系统。即使是相同接合型的真菌细胞也能发生原生质体的相互融合，并可对原生质体进行转化和转染。2.原生质体融合后两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组子。参与融合的亲株数并不限于一个，可以多至三个、四个，这是一般常规杂交所达不到的。3.重组频率特别高，因为有聚乙二醇作助融剂。如天蓝色链霉菌的种内重组频率可达到20%。4.可以和其他育种方法想接合，把其他方法得到的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。5.可以用温度、药物、紫外线等处理、钝化亲株的一方或双方，然后使之融合，再在再生菌落中筛选重组子,这样往往可以提高筛选效率。
由于以上优点，利用原生质体融合来培育工业新菌株已受到国内外重视，并在一些研究中有所突破。但微生物原生质体融合技术用于菌种选育仍属于一种半理性化筛选，因为尽管所采用的两亲株的特性是已知的，但它们基因组的交换、重组是非定向的[2]。
1.2酵母菌的类属
酵母菌是一种单细胞微生物，属真菌类。从酵母菌分类系统来讲属于真酵母属(Saccharomyces)，通常以出芽方式进行繁殖，繁殖速度较霉菌快；有坚韧的细胞壁，不同于原生动物；菌体较大，多为圆形、卵形、椭圆形或腊肠形等；内有细胞核和颗粒物质，形态复杂。酵母菌广泛地存在于自然界中，是发酵工业中的重要微生物之一，能分解碳水化合物产生酒精和二氧化碳等成分，是酵母属中的酿酒酵母种，凡是有糖的地方就可能存在着酵母菌[3]。
1.3人类对原生质体的了解
自从1919年Giaja用蜗牛胃液从酵母细胞分离得到原生质体以来，特别是1953年Weibull首次用溶菌酶酶解分离Bacillus megaterium 的原生质体以后，对于微生物原生质体的研究发展迅速。近3O年来，由于研究方法的不断改进、研究手段的不断更新，围绕着原生质体的研究。已经形成了一整套的原生质体技术，这些技术的日益成熟和发展，使人们对微生物原生质体的研究进入到了一个崭新的阶段。自1997年Sipiczki和Ferenczy首先开展酵母菌原生质体融合工作以来，不同学者已进行酵母菌种内、种间，属内和属间的原生质体融合研究。所采用的方法主要是通过电融合或PEG促融等手段诱导融合。原生质体的制备和再生是融合的前提，但是从已报导的文献看，存在的主要技术难题是原生质体的形成率较高，再生率较低，甚至接近于零。本实验通过改良和优化原生质体制备体系，控制酶解时间，协调再生环境，促使酵母菌原生质体的制备较大的提高，为进一步提高原生质体的融合，育种的效率打下基础[4]。
制备原生质体，是融合原生质体技术的前提和基础。但是不同微生物的细胞壁组成各不相同。所以制备其原生质体的最佳条件也存在着很大差异。早期人们曾探索使用研磨等机械方法和超声波等物理方法来制备原生质体，制备效果都不理想．目前人们主要运用酶法来制备原生质体。在制备细菌、放线菌的原生质体时．主要使用溶菌酶作为工具酶，但也有例外。1987年，Temeyer等发现．Bacillus thuringiensis的细胞壁对溶菌酶、几丁质酶、胰蛋白酶和蛋白酶等具有抗性。却可以被来自于本身的溶壁酶或突变溶菌素(Mutanolysin)降解。对于酵母菌、霉菌、大型真菌，由于其细胞壁组成更为复杂。人们多倾向于使用复合酶进行处理。常用的酶有纤维素酶、蜗牛酶和几丁质酶等[5]。
1.4酵母菌细胞细胞壁的组成
酵母菌细胞壁的厚度为25～70nm，重量约占细胞干重的25%，主要成分为葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和几丁质（总共超过90%），另有少量脂质。它们在细胞壁上自外到内的分布次序是甘露聚糖、蛋白质、葡聚糖(如图1-2)。葡聚糖(glucan)位于细胞壁的内层，
是赋予酵母细胞机械强度的主要物质基础。它分两类，其一占含量的85%，分子量为240000，称β-(1→3)葡聚糖，呈长扭曲的链状；另一为含量较低、呈分枝的网状分子，是以β-(1→6)方式连接的葡聚糖。甘露聚糖(mannan)是甘露糖分子以α-(1→6)相连的分枝状聚合物，位于细胞壁外侧，呈网状，若把它去除后，细胞仍维持正常形态。蛋白质夹在葡聚糖和甘露聚糖中间，呈三明治状，它常与甘露聚糖作共价结合而形成一复合物。蛋白质含量一般仅甘露聚糖的1/10。它们除少数为结构蛋白外，多数是起催化作用的酶，如葡聚糖酶、甘露聚糖酶、蔗糖酶、碱性磷酯酶和酯酶等。几丁质(chitin)在酵母细胞壁中的含量很低，仅在其形成芽体时合成，然后分布于芽痕的周围。
图1 酵母菌细胞壁结构示意图
不同种、属酵母菌的细胞壁成分差异也很大，且并非各种酵母都含有甘露聚糖。例如，点滴酵母(Saccharomyces guttulatus)和荚膜内孢霉(Endomyces capsulata)的细胞壁成分以葡聚糖为主，只含少量甘露聚糖；一些裂殖酵母(Schizosaccharomyces spp)则仅含葡聚糖而不含甘露聚糖，取代甘露聚糖的是含有较多的几丁质[6]。
1.5人类对酵母菌的应用
早在公元前 3000多年前，人类就开始利用酵母来制作发酵产品。因酵母菌在发酵过程中起着重要的生理生化作用，其发酵力的好坏，副产物的多少，直接影响生产的高低，间接影响产品的风味，因此具有重大的研究价值。目前已知的酵母菌有 490余种。由于酵母具有个体大、蛋白质含量高、杂食性强、易分离、易培养、代谢产物多、综合利用广等特点，在现代工业中主要用于酿酒，在其他行业也有广泛的用途。
遗传和变异是一切生物体最本质的属性之一。所谓的遗传，讲的就是发生在亲子间即上下代间的关系，即指上一代生物如何将自身的一套遗传基因稳定的传递给下一代的行为或功能，他具有极其稳定（保守）的特性[7]。
微生物由于其一系列极其独特的生物学特性，因而在现代遗传学、分子生物学和其他许多重要生物学基础研究中，成了学者们最热衷选用的模式生物，这些独特的生物学特性如：物种与代谢类型的多样性；个体的体制极其简单；营养体一般都是单倍体；易于在成分简单的组合基上大量生长繁殖；繁殖速度快；易于积累不同的中间代谢物或终产物；菌落形态的可见性和多样性；环境条件对微生物群体中各个体作用的直接性和均一性；易于形成营养缺陷型突变株；各种微生物一般都有其相应的病毒；以及存在多种处于进化过程中、富有特色的原始有性生殖方式等。
两个独立的基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程，称为基因重组或遗传重组，简称重组。重组是在核酸分子水平上的一个概念，是遗传物质在分子水平上的杂交，因此，与一般在细胞水平上进行的杂交有明显区别。细胞水平上的杂交，必然包含了分子水平上的重组。例如真核微生物中的有性杂交、准性杂交、原生质体融合以及原核微生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等[7]。
通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子，称为原生质体融合。原生质体融合的主要操作步骤是：先选择两株有特殊价值、并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本菌株置于等渗溶液中，用适当的脱壁酶（如真菌可用蜗牛消化酶或其他的相应酶处理）去处细胞壁，再形成原生质体（包括球状体）进行离心聚焦，加入促融剂PEG（聚乙二醇）或借电脉冲等因素促进融合，然后用等渗液稀释，再涂在能促使它再生细胞壁和进行细胞分裂的基本培养基平板上。待形成菌落后，再通过影印平板法，把他接种到选择性培养基平板上，检验它们是否为稳定的融合子，最后再测定其有关生物学性状或生产性能[8]。
2.1材料
2.1.1菌种
酿酒酵母S02（Saccharomyces cerevisiae S02） 本实验室保藏
2.1.2 主要试剂
蜗牛酶: 购于北京百泰生化技术公司
纤维素酶(绿色木霉): 购于上海伯奥生物技术有限公司
蔗糖: 市售
2.1.3 主要仪器
（1）超净工作台：SW-CJ-IF型单人双面净化工作台，苏净集团安泰公司制造
（2）霉菌培养箱：MJX-250B-Z型，上海博迅实业有限公司医疗设备
（3）电子天平：BS 224S型，北京赛多利斯系统有限公司
（4）高压蒸汽灭菌锅 ：上海博迅实业有限公司医疗设备厂
（5）震荡培养箱：BS-ZEA型，国华电器有限公司
（6）恒温水浴锅：DKS-12型，嘉兴市中新医疗仪器有限公司
（7）显微镜：Nikon N10，日本尼康公司
（8）其它常规玻璃仪器
2.1.4 培养基
（1）斜面培养基
麦芽汁(波美度7-8) 80 ml,水 20ml琼脂 2g ,121℃灭菌20min。
（2）菌体细胞培养基(YEPD培养基)
蔗糖 2g，蛋白胨 1g，酵母膏0.5g，水 50 ml，PH值自然 ,121℃灭菌20min。
2.2实验方法
2.2.1原生质体的制备
2.2.1.1菌体培养方法
斜面菌种活化后，用无菌水洗下斜面菌体，制备菌体悬浮液，菌体浓度为 5×108 ,按5%接种量接入菌体培养基，30℃，180r/Min培养一定时间。
2.2.1.2原生质体的制备
将己培养好的菌体细胞置于离心管中，3500r/min离心15min，去上清液。再用0.7mo1/L的蔗糖溶液作为渗透压稳定剂洗涤二次。按不同条件水浴酶解，隔15min振荡一次，酶解时每隔O.5h取样在显微镜下观察，当大多数细胞形成原生质体时，停止酶解。
2.2.1.3原生质体形成率计算方法
用无菌吸管，小心地向菌体酶解液吹吸几次，促使原生质体从残余菌丝上释放。取洁净的血球计数板，将盖玻片放在计数室上，吸取少量酶解液于盖玻片边缘，使其自行渗入（多余菌液滤纸吸去），静止5分钟后，将血球计数板放在载物台上，低倍镜下找计数室，于高倍镜下找到清晰的计数室线条。如果血球计数板为25中方格则取5个中方格中的原生质体数（即取4角4个中方格和中央一个中方格的原生质体数），如为16中方格则取4个中方格中的原生质体数（即取4角4个中方格的原生质体数）计算公式为[9]：
a、25中方格计数公式：
1ml菌液中的总菌数=（A/5）×16×10×1000×B
b、16中方格计数公式：
1ml菌液中的总菌数=（A＇/5）×16×10×1000×B＇
公式中：A，A＇指5个中方格的原生质体总数
B，B＇指稀释倍数
2.2.2各因素对原生质体形成率的影响
2.2.
2.1 pH值对原生质体形成率的影响[10]
在0.6mol/L蔗糖溶液作渗透压稳定剂，浓度为2%的混合酶（蜗牛酶：纤维素酶=1：1），菌龄为30h的酵母菌，30℃水浴条件下酶解2.5h的条件下。用pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的缓冲溶液配制酶液，制备原生质体，比较其形成率，确定最佳酶解PH值。
2.2.2.2酶解温度对原生质体形成率的影响
在0.6mol/L蔗糖溶液作渗透压稳定剂，浓度为2%的混合酶（蜗牛酶：纤维素酶=1：1），菌龄为30h的酵母菌，缓冲液pH值为6.0，酶解时间为2.5h的条件下，分别在34℃，32℃，30℃，28℃水浴条件下酶解酵母细胞制备原生质体[11]，比较其形成情况。
2.2.2.3 酵母菌菌龄对原生质体形成率的影响
在0.6mol/L蔗糖溶液作渗透压稳定剂，浓度为2%的混合酶（蜗牛酶：纤维素酶=1：1），缓冲液pH值为6.0，酶解时间为2.5h,30℃水浴条件下分别取培养12h, 18h, 24h, 30h, 36h时的菌体制备原生质体，计算形成率。
2.2.2.4酶配比对原生质体形成率的影响
在0.6mol/L蔗糖溶液作渗透压稳定剂，浓度为2%的混合酶，菌龄为24h的酵母菌，缓冲液pH值为6.0，酶解时间为2.5h，30℃水浴条件下，分别用2%的蜗牛酶;2%的纤维素酶;蜗牛酶:纤维素酶=7:3的混合酶;蜗牛酶:纤维素酶=6：4的混合酶；蜗牛酶:纤维素酶=5：5的混合酶；蜗牛酶:纤维素酶=4：6的混合酶制备原生质体[12]，对比其形成情况。
2.2.2.5酶解时间对原生质体形成率的影响
在0.6mol/L蔗糖溶液作渗透压稳定剂，浓度为2%的混合酶（蜗牛酶：纤维素酶=1：1），菌龄为24h的酵母菌，缓冲液pH值为6.0，30℃水浴条件下，酶解时间分别为1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h制备原生质体，比较原生质体形成情况。
2.2.2.6酶浓度对原生质体形成率的影响
在0.6mol/L蔗糖溶液作渗透压稳定剂，混合酶比例（蜗牛酶：纤维素酶=1：1），菌龄为24h的酵母菌，缓冲液pH值为6.0，酶解时间为3.5h，30℃水浴条件下，分别用质量分数为1%、1.5%、2.0%、2.5%浓度的混合酶酶解酵母菌制备原生质体，比较其形成率情况。
2.2.2.7渗稳剂浓度对原生质体形成率的影响。
在用蔗糖溶液作渗透压稳定剂，浓度为1.5%的混合酶（蜗牛酶：纤维素酶=1：1），菌龄为24h的酵母菌，缓冲液pH值为6.0，酶解时间为3.5h，30℃水浴条件下，分别用浓度为O.5mol/L, 0.6mol/L,0.7mo1/L,0.8mo1/L的蔗糖作为渗透压稳定剂制备原生质体[13]，比较其形成情况。
2.2.2.8渗透压稳定剂种类对原生质体形成率的影响
在0.7mol/L浓度溶液作渗透压稳定剂，浓度为1.5%的混合酶（蜗牛酶：纤维素酶=1：1），菌龄为24h的酵母菌，缓冲液pH值为6.0，酶解时间为3.5h，30℃水浴条件下，分别用KCl,蔗糖,NaCl,MgSO4,(NH4)SO4 溶液作为渗透压稳定剂制备原生质体，比较其形成状况。
2.2.2.9 酿酒酵母S02原生质体形态观察
在pH值为6.0，酶解温度为30℃，酵母菌S02菌龄为24h，酶配比为5：5,酶浓度为1.5%，在0.7mol/L的蔗糖溶液作为渗透压稳定剂的条件下酶解3.5h，然后取一定量的酶解液滴入血球计数板上，并用OLYMPUS显微镜观察进行显微摄影[15]。
3．实验结果和讨论
3.1各个单因素对原生质体形成率的影响
3.1.1酶解pH值对原生质体形成率的影响
酶充分发挥其高效性的特点，都必须在其最适pH值条件下，否则酶效率变低甚至会失活。酶解时pH值对原生质体形成率的影响结果见图2 。
图2 pH值对原生质体形成率的影响
从图2可知,混合酶在pH为6的时候效率最高，原生质体的形成率最高为72.22%,由此可见该混合酶的最佳酶解pH值为6.0。
酶的催化作用与反应液的pH值有很大的关系。每一种酶都有其各自的适宜pH值范围和最适pH值。只有在适宜的pH值范围内，酶才能显示其催化活性。在最适pH值条件下酶催化反应速度达到最大，其趋势线呈抛物线显示。pH值过高或过低，都可能引起酶的变性失活。因此，在催化反应过程中，必须控制好pH值。
pH值之所以影响酶的催化作用，主要是由于在不同的pH值条件下，酶分子和底物分子中基团的解离状态发生改变，从而影响酶分子的构象以及酶与底物的结合能力和催化能力。在极端pH值条件下，酶分子的空间结构发生改变，从而引起酶的变性失活[16]。
3.1.2不同的酶解温度对原生质体形成率的影响
酶只有在最佳温度下才能发挥其最佳的酶解作用，酶解温度对酿酒酵母S02原生质体形成率影响见图3。
图3 酶解温度对原生质体形成率的影响
从图3可以看出，在温度为30℃的时候原生质体的形成率最高，因此，选择温度为30℃作为酶解酵母菌制备原生质体的最佳温度。
每一种酶的催化反应都有适宜的温度范围和最适温度。在适宜的温度范围内，酶才能够进行催化反应；在最适温度条件下，酶的催化反应速度达到最大（趋势线呈抛物线形式）。一方面，在其他条件相同的情况下，温度每升高10℃，化学反应速度增加1～2倍。另一方面，酶是生物大分子，当温度升高时，酶的活性受到影响，甚至引起变性而丧失其催化活性。这两个方面的综合结果，在某一特定温度条件下，酶催化反应速度达到最大，这就是最适温度。超过最适温度，反应速度逐步降低，一般在60℃以上容易变性失活。但也有一些酶的热稳定性较高。添加酶的作用底物或者某些稳定剂可以适当提高酶的热稳定性[17]。
在微水介质中，由于水的含量低，酶的热稳定性增强，所以其最适温度高于在水溶液中催化的最适温度。要注意的是酶与其他非酶催化剂一样，温度升高时，其立体选择性降低。这一点在有机介质的酶催化过程中显得特别重要，因为手性化合物的拆分是有机介质酶催化的主要应用领域。必需通过试验，控制适宜的反应温度，使酶催化反应得以在较高的反应速度以及较强的立体选择性条件下进行[3]。
3.1.3酵母菌S02菌龄对原生质体形成率的影响
要得到较高的原生质体形成率，菌体本身的生理特性也十分重要，在不同条件下生长的酵母菌其细胞壁的特性也有差别，比如厚度不同等等。从酵母菌S02的菌龄和原生质体的形成率关系来看如图4。
图4 酵母菌菌龄对原生质体形成率的影响
从图4可知，酵母菌菌龄在24h的时候原生质体形成率最高，其次是30h的时候，在菌龄为12h的时候形成率最低。在酵母菌菌龄为24h的时候酶解的最好，原生质体的形成率最高。因此我们选用24h为制备原生质体的最佳菌龄。
微生物的生理状态是决定原生质体产量的主要因素
之一，特别是菌龄，明显的影响原生质体释放的频率。微生物菌龄是随着菌种和培养条件而异，其中酿酒酵母在对数期时菌体细胞壁容易被酶解，而静止期对酶渗入细胞有较大的抗性，这种抗性作用由对数期到静止期迅速增加。酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化，才能大幅度地提高制备率[4]。
3.1.4蜗牛酶与纤维素酶配比对原生质体形成率的影响
酶解时，混合酶之间的相互比例对原生质体的形成率也有一定的影响。蜗牛酶与纤维素酶配比对原生质体形成率的影响见图5。
1、蜗牛酶：纤维素酶=3：7 2、蜗牛酶：纤维素酶=4：6
3、蜗牛酶：纤维素酶=5：5 4、蜗牛酶：纤维素酶=6：4
5、蜗牛酶：纤维素酶=7：3
图5酶配比对原生质体形成率的影响
从图5可以看出，混合酶中，在两种酶比例为5：5的时候原生质体的形成率最高，在蜗牛酶：纤维素酶=7：3的时候形成率最低，因此我们选择在两种酶比例为5：5作为最佳混合酶比例。
细胞壁主要成分为葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和几丁质（总共超过90%），另有少量脂质。它们在细胞壁上自外到内的分布次序是甘露聚糖、蛋白质、葡聚糖，纤维素单独对其酶解很难发生作用。细胞壁酶解过程中，以蜗牛酶作为主要酶，纤维素酶作辅助酶。蜗牛酶浓度太低，则原生质体的形成率显著降低，而当蜗牛酶的比例超过5：5时，则原生质体的形成率也开始呈下降趋势。
不同的酶具有不同的结构和特性，同一种酶，由于来源的不同和处理方法的不同，其特性也有所差别。所以要根据需要通过实验进行选择。
3.1.5酶解时间对酿酒酵母S02原生质体形成率的影响
酶解过程中，酶解时间对原生质体的形成率影响非常重要，酶解时间对原生质体形成率的影响见图6。
图6 酶解时间对原生质体形成率的影响
如图6所示，酶解时间为3.5h内原生质体形成率随时间延长而增加，3.5 h时原生质体形成率最高，然后原生质体开始呈下降趋势。因此选择最佳酶解时间为3.5，原生质体形成率为89.47%。
在原生质体制备过程中，酶解时间是一个关键因素。酶解时间过短，则酵母菌酶解不彻底，原生质体的形成率偏低。反之，如果酶解时间过长，则形成出来的原生质体细胞膜会继续被酶解，导致原生质体破裂，因而原生质体的形成率降低。因此，选择了合适酶解时间就能保证原生质体的形成率不受较大的影响，能准确的反映出原生质体的形成率[18]。
3.1.6不同浓度的酶溶液对原生质体形成率的影响
酶解时，酶的浓度对原生质体形成率的影响作用非常明显。酶浓度对原生质体形成率的影响见图7。
图7.酶解时酶浓度对原生质体形成率的影响
如图7所示，在混合酶浓度为1.5%的时候原生质体的形成率最高为91.1%，然后随着酶浓度的增加原生质体形成率降低。因此，我们选择酶浓度为1.5%作为最佳酶解浓度。
在底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比，它们之间的关系式表示：V=k[E][5]
各种微生物，由于细胞壁组成不同，用于水解细胞壁的酶种类和浓度也不同[8]。用于水解细胞壁酶的浓度要适当，酶量过低，作用不彻底，不利于原生质体的形成，浓度过高，处理时间过长，会影响原生质体数量和活性，致使再生频率下降[4]。
在酶催化反应时，通常酶所作用的底物浓度远远高于酶浓度，所以酶催化反应速度随着酶浓度的升高而升高，两者成正比。
3.1.7渗透压稳定剂浓度对原生质体形成率的影响
渗透压稳定剂浓度直接影响着原生质体的保存。渗透压稳定剂浓度对原生质体形成率的影响结果见图8
图8渗透压稳定剂浓度对原生质体形成率的影响
从图8可以看出，在渗透压稳定剂浓度为0.7mol/L的时候原生质体的形成率最高，在0.5mol/L的时候最低。通过分析认为，在渗透压稳定剂浓度为0.7mol/L的时候原生质体的形成率最高，因此，酶解该菌的最佳渗透压稳定剂浓度选者为0.7mol/L。
渗透压稳定剂的浓度对原生质体的形成率测定影响非常大，合适浓度的渗透压稳定剂是使细胞膜内外浓度保持一致，能较好的保存原生质体，从而保证正确的测出原生质体的形成率。
在等渗溶液中，微生物正常生长繁殖；在高渗溶液（例如高盐、高糖溶液）中，细胞失水收缩，而水分为微生物生理生化反应所必需，失水会抑制其生长繁殖；在低渗溶液中，细胞吸水膨胀，酵母菌等大多数微生物具有较为坚韧的细胞壁，而且个体较小，因而在低渗溶液中一般不会像无细胞壁的细胞那样容易发生裂解，具有细胞壁的微生物受低渗透压的影响不大，反之则剧烈。而得到的原生质体正属于这种状况，因此要维持原生质体的存在，必须选择适宜的渗透压稳定剂浓度[2]
3.1.8渗透压稳定剂种类对原生质体形成率的影响
以KCl、蔗糖、NaCl 、MgSO4、(NH4)2SO4等五种不同的渗稳剂配制酶液，对酿酒酵母S02细胞进行降解，其结果见图9。
图9 不同渗透压稳定剂种类对原生质体形成率的影响
渗透压稳定剂是酶解的作用环境也是原生质体的存在环境，渗透压稳定剂的性质在一定程度上会促进酶的反应活性，有助于酶与底物的结合，是维持和控制原生质体数量的主要因素之一。如图9所示，蔗糖作为渗透压稳定剂，其原生质形成率达到最高。
3.1.9酿酒酵母S02原生质体形态观察
通过显微镜的观察，酵母菌S02菌体细胞以及原生质体的形态如图10和图11：
图10 酵母细胞（2540倍）
图11 酵母细胞原生质体（2540倍）
综上所述，在pH值为6.0，酶解温度为30℃，酵母菌S02菌龄为24h，酶配比为5：5,酶浓度为1.5%，在0.7mol/L的蔗糖溶液作为渗透压稳定剂的条件下酶解3.5h，酿酒酵母S02原生质体形成率最高，酿酒酵母S02的原生质体呈椭球形及球形，与酿酒酵母S02菌体细胞相比，个体体积较大，见图10及图11。
四．总结与展望
影响酵母菌原生质体形成的因数很多，本实验先对各单因数进行研究，这样可以简化实验步骤，得出最佳的单因数条件后，再进行各条件的综合研究。
菌龄：菌种的生理状态（特别是菌龄），对原生质体的形成和再生均有很大的影响，，太长菌龄的菌丝壁易老化增厚，不利于原生质体的释放，且菌体本身的活性较差，也导致难于再生。太短菌龄的菌体易破裂，原生质体释放量减少。不同时期的菌丝对酶的敏感度不同，只有在其生长的某个特定阶段对酶液最为敏感，在此阶段酶解较易获得大量均一的原生质体，过早、过晚都不利于酶解。由于处于细胞对数生长期的菌体代
谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，生长适应能力强，故取处于对数生长早期(36-72h)的菌体制备原生质体。本实验结果表明酵母菌培养24h后制备原生质体为最佳。
酶解时的pH值酶的催化作用与反应液的pH值有很大的关系。每一种酶都有其各自的适宜pH值范围和最适pH值。只有在适宜的pH值范围内，酶才能显示其催化活性。在最适pH值条件下酶催化反应速度达到最大，其趋势线呈抛物线显示。pH值过高或过低，都可能引起酶的变性失活。因此，在催化反应过程中，必须控制好pH值。pH值之所以影响酶的催化作用，主要是由于在不同的pH值条件下，酶分子和底物分子中基团的解离状态发生改变，从而影响酶分子的构像以及酶与底物的结合能力和催化能力。在极端pH值条件下，酶分子的空间结构发生改变，从而引起酶的变性失活。因此，我们选择pH值6.0作为最佳值。
酶解时间：充足的酶解时间是微生物细胞原生质体化的必要条件，时间短产量低，再生率高，时间长则不利于再生。随着酶解时间的延长，菌体去壁程度愈完全，表现为原生质体形成率逐渐上升，再生率也在不断提高。当酶解达到一定时间后，绝大多数的菌体细胞均已形成原生质体，然而如果时间过长，酶活力显著降低；同时时间过长，脱壁太彻底，使细胞壁再生的引物失去，并且杂酶的损害也越强导致早期所形成的原生质体变性，或是在某些情况下，在原生质体死亡前，再生出异常菌丝体。因此，再进行酶解作用，酶便会进一步对原生质体发生作用而使细胞质膜受到损伤，造成大量原生质体破裂，从而使原生质体失活，表现为原生质体再生率急剧降低。这就是酶解时间一到必须立即离心，原生质体才能再生的原因，即原生质体的质量与酶解时间密切相关。酶解时间过短，原生质体形成不完全，结果会影响原生质体间的融合；酶解时间过长，原生质体的再生率降低，最终亦不利于原生质体融合。因此，必须选择合适的酶解时间。本实验结果表明，酵母菌酶解时间约为3.5h为最佳。
酶解温度：温度对酶解作用有双重影响，一方面随着温度的提高，酶解反应速度加快；另一方面，随着温度的增加，酶蛋白逐渐变性而使酶失活，从而使原生质体制备率下降。因此，最适温度是这两种效应的共同结果。另外 ，人们发现酶解温度对原生质体的再生影响甚大。因此，在选择最佳酶解温度时，除了要考虑酶的最适温度外，还要以原生质体再生率加以校正。一般地说，酶解温度应控制在20～40 ℃。本实验结果表明，在30℃时，酵母菌原生质体的产量达到最大。
酶种类的选择：由于不同微生物的细胞壁成分与结构不同，因此制备不同微生物的原生质体时需选用不同的酶，例如，放线菌和细菌多用溶菌酶；而酵母和霉菌主要用蜗牛酶、纤维素酶。本实验用的是纤维素酶和蜗牛酶。
酶浓度及酶比例：对于不同种属的微生物来说，不仅对酶的种类要求不同，就是酶的浓度也有差异。这些对原生质体的形成与再生有明显的影响。在一定范围内一般地说 ，酶浓度增加，原生质体的形成率亦增大，超过一定范围，酶反应速率则不再明显提高，原生质体形成率也不会明显提高。一是由于酶中往往有一些对原生质体有害的酶类(如过氧化物酶、核糖核酸酶)，故酶量的增加，杂酶浓度也相应增加，当达到一定浓度的阈值时，必然会严重影响原生质体的活性；二是浓度过大会使细菌脱壁太彻底，使原生质体再生时合成细胞壁的引物失去。影响再生；三是酶量过大。也易使菌体凝聚，从而难于原生质体化。酶浓度过低，则不利于原生质体的形成；酶浓度过高，则导致原生质体再生率的降低。由于影响原生质体形成和再生的因素相互有关，若原生质体形成率很高而再生率很低，对于原生质体融合育种来说不大适合。因此，有人建议以使原生质体形成率和再生率之积达到最大时的酶浓度作为最佳酶浓度。本实验所用的浓度为1.5%，比例浓度蜗牛酶:纤维素酶=5：5。但需要强调的是不同批次购买的酶在纯度上有一些差异，因此要根据具体情况来调整酶的浓度。
渗透压稳定剂：渗透压稳定剂是酶解的作用环境也是原生质体的存在环境。渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨胀作用，而且还有助于酶和底物的结合。渗透压稳定剂的性质、浓度一定程度上会促进酶的反应活性，同时也是维持和控制原生质体数量的主要因素。细菌细胞壁一旦被破坏除去，只有在高渗透溶液里才能维持细胞内外的溶质浓度平衡制备过程中要注意始终维持适当的渗透压，防止细胞的破裂，并且也有助于酶与底物的结合。在真菌原生质体制备中，对稳定剂的选择迄今已有很多报道，大都认为，无机盐作为渗透压稳定剂要好于有机溶剂，但无机盐作为渗透压稳定剂不利于原生质体的保存，所以本实验用蔗糖溶液作渗透压稳定剂。
另外还需注意原生质体化率并非越高越好，太高往往会导致再生率的降低。此外，再生培养基的成分、菌种本身的特性等也是重要的影响因素。
除此以外，培养方式、培养基种类、离子强度和种类等对原生质体的形成亦有一定的影响。
酿酒酵母S02具有高产酒精，生长快，周期短，生长优势强的特点，通过其原生质体和其他菌种（如生长周期长的红曲酶等）原生质体的融合，可以选育出同时具有两种菌种特性的新菌种，可以较大幅度的提高经济利益，具有较强的实用性。
致 谢
通过本次实验，认识到通过原生质体的形成，再生，融合和选育后可以得到同时具有两种不同菌的特性的新菌种，能够应用与食品，医药，环保甚至采矿业，具有广泛的应用前景。在实验中，还向戴德慧老师、胡伟莲老师学到很多。老师对我们的实验操作是非常严格的，让我充分领会了“科学是严谨的”的道理。此外,，除了学到了更多的理论知识，得到了更多的动手机会。通过自己动手做实验，使自己的实际动手能力大大提高，附带的一些平时忽略的理论知识也能熟悉起来并能较好的去利用；同时也掌握了一个课题开展和研究的全过程，对自己有较大的帮助；也学会了自己去学习，查资料的方法，学会了自己去设计实验，也认识到了现在社会需要的知识、经验，为自己进入社会打下良好的基础。在实验过程中，我感受最深的就是我们实验室的同学非常团结，也非常积极。虽然我们有是不同课题的小组，但每一成员都拥有积极的，团结协作的精神。当出现问题时，大家都能提出自己的观点，帮助解决问题。使我
们深刻体会到越是积极主动参与，付出的越多，学到的也将越多，实验前后的变化就越大。在此，我想谢谢老师们给我这次学习机会，让我学习，让我成长。还要感谢我实验室的每位成员，感谢大家的配合，才使得我的实验得以顺利完成。
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毕业论文总结
专业：生物工程 姓名：吕斌 学号：103043009
马上就要毕业了，四年的时间真是弹指一挥间，美好的校园生活即将将结束。四年里，三个半学年用在学习理论知识上，最后半学年用于社会实践，不但培养了我们的学习能力，也培养了我们的实际动手能力，也更加丰富了我们的大学生活，从而达到理论与实践相互结合。
回顾这个学期的毕业设计，我有很大的感触。这次的毕业设计，我没有和其他很多同学一般在浙大或者是校外的研究所做课题。在最初，我对我们的课题并没有什么新鲜的感觉，只觉得毕业设计实验应该与我们经常做的微生物实验或者生化实验没有什么很大的区别。结果我发现，我所做的课题是酿酒酵母S02原生质体形成的研究，要做的就是把原生质体的形成的条件一个一个摸索出来，且与工业化接轨，很有实际意义。因此，自己的动手能力能得到了极大的培养，所以我对这个课题给于相当重视的。
前两个星期的任务主要是查找参考文献，熟悉这个课题并着手制定实验计划。前期的准备工作是很重要也很必要的过程，没有准备意味着实验无从下手和经常性的丢三落四。在前期的准备工作中，通过文献检索手段，我们学会了如何快捷地找到我们所需要的文献资料。，当然并不是所有找到的文献都有参考价值，但要是粗心的话，又会错过很多有价值的文献。因此，这个过程很讲究耐心和细心程度，尤其是在查阅外文文献时，由于英语水平的限制，文献的内容往往只能看个一知半解的，只有耐心翻译文中摘要，才知道这篇文章是否需要。
大概了解了实验，接下来就是自己亲自动手实验了。这个阶段是最重要的。科研不同于平时的那些实验课，平时的实验都是一个简单的按书就班的过程，只是让我们学习一般操作，了解各个实验类型，为我们的实际操作能力打下基础。因此所做实验一般都是成熟性的，容易上手；但科研讲究的是开创性。系统有条理地分析某一个问题，通常需要很多的小实验结合成一个完整的课题，然后通过总结得出自己的结论。科研还要忍受的住寂寞，别人可以休息，游玩，而我却只能呆在实验室，但是我并没有觉得惘然若失，相反，在实验中。我学会了独立的实验动手能力，数据分析能力。同时，在实验阶段还是碰到了一些自己力所不能及的问题，在自己钻研的同时，还要耐心地研究参考文献，或者虚心地向老师同学求教。
实验阶段很快也就结束了，接下来就是书写论文了。虽说，在实验阶段记录了很多的数据，处理一下很快就能成一篇文章了，但往往集中在以前的思维中写，如在论文中我往往加入了一些过于主观的想法或猜测，而忘了要客观的分析；还有一些遣词也不是十分恰当。在指导老师指正下，在他细心的指导下，我的论文完成得还算顺利。
经过半年的毕业设计实验，我的动手能力得到了较大的提高，理论结合实际的能力也得到了提高，最重要的是我学会如何主动的去学习、去动手、去钻研、去分析的能力，这成果将伴随我终身。
