中文摘要 Ⅰ
英文摘要 Ⅱ
目录 Ⅲ
1. 绪论 1
1.1 HA的分布 1
1.2 HA的理化性质 2
1.3 HA微生物发酵法生产工艺 4
1.3.1 工艺路线 4
1.3.2 工艺过程 4
1.4 HA的生理功能 5
1.5 发酵法生产HA的前景 6
2. 实验部分 7
2.1 微生物发酵法生产HA实验 7
2.1.1 实验器材 7
2.1.1.1 主要仪器及设备 7
2.1.1.2 细胞培养器皿和用品 7
2.1.1.3 主要试剂、药品 7
2.1.2 实验方法 8
2.1.2.1 菌种的纯化 8
2.1.2.2 种子的培养 9
2.1.2.3 发酵罐培养 10
2.2 发酵液中HA的含量测定方法的比较研究实验 14
2.2.1 仪器与试剂 14
2.2.2 实验方法 14
2.2.2.1 HA测定方法实验 14
2.2.2.2 发酵液的主要成分对2种方法测定结果的影响 15
2.2.2.3 2种方法对发酵液中HA含量测定的比较 16
3. 结果与讨论 17
3.1 微生物发酵法生产HA实验 17
3.1.1 初糖浓度影响 17
3.1.2 温度影响 17
3.1.3 pH影响 18
3.1.4 搅拌转速影响 19
3.1.5 通气量影响 19
3.1.6 乳酸的抑制 20
3.1.7 结论 20
3.2 发酵液中HA的含量测定方法的比较研究实验 21
3.2.1 2种方法测定HA溶液的结果比较 21
3.2.2 发酵液主要成分对2种方法测定结果的影响 21
3.2.3 2种方法测定发酵液中HA含量的结果比较 23
3.2.4 结论 23
4. 总结与展望 24
致谢 25
参考文献 26
1 绪 论
1.1 HA的分布
HA 作为一种高分子多糖，在动物、尤其是在人体中的广泛分布（见表1-1和表1-2），说明其与人有着密切的关系，因而促使人们通过多种方式认识、了解它在机体中的功能和代谢。
表1-1 HA 在机体中的分布
组织或体液 浓度/(mg•L-1)
人 脐带
关节滑液
表1-2 HA在胚胎和成人脑中的分布（以每1克湿品计）
表1-1和表1-2提供了HA分布的部分数据。
像葡萄糖一样，每天都要从外界摄取一定量能产生葡萄糖的食物以维持正常的活动，机体的每一部分都离不开它。而 HA 与葡萄糖的角色差别只在于少与多，同样为机体所必需。
1.2 HA的理化性质
（1）流变学特性
HA具有零切变粘度。粘度是衡量液体流动阻力的一种参数，HA溶液的浓度或Mr愈大，HA分子的缠绕程度则愈高，粘度愈大。
在低浓度或低Mr时，溶液的粘度随Mr或浓度的增加变化较小，对此现象可解释为HA分子在此情况下为一独立的单体，分子间不发生缠绕。
当Mr和浓度增高使粘度达10mPa•s后，此时HA分子发生缠绕，粘度随Mr或浓度的提高而明显提高，如Mr或浓度提高至1.8倍可使粘度提高至10倍。
HA具有假塑性。若提高HA溶液的流速，线圈状的HA分子在流线中变形和拉长，占据较小的空间，溶液流动的阻力减少，因此，随着切变速率的增高，溶液的粘度降低。
如Mr为4×106的1％HA溶液，零切变速率时，粘度为400000mPa•s，若切变速率为1000s-1时，粘度可降至130mPa•s。
（2）依数性
HA溶液的依数性（如冰点、渗透压等）与HA分子内和分子间氢键及疏水键的相互作用有关。实验中发现，溶液中的无机离子可影响 HA分子这种自身作用。
HA的缔合也影响水的结构和溶液的依数性。通过测定U形管中HA溶液的冰前沿移动的线性结晶速度可观察到HA对水溶液的作用。
（3）降解反应
HA大分子容易发生降解，研究表明降解主要由水解和羟基上的活性氧引起的。
HA降解使溶液的粘度降低，而HA制剂的粘度是临床使用价值的保证，尤其是作为眼科手术粘弹性保护剂时尤其重要。HA制剂在生产、储存过程中，若处理不当均会发生降解，尤其是要注意温度对HA的影响。
（4）交联反应
HA为水溶性物质，但在术后防粘连等临床应用中经常需要使其在体内保留较长时间，有时就需要将HA与交联剂反应形成交联的不溶性HA凝胶或膜。
HA交联形成的大分子网状物质，其交联度可根据交联剂的使用量和反应时间来控制。不同交联度的HA在体内的降解时间不同。许多研究利用该特性将其作为缓释药物的载体，制备缓释制剂。
（5）酯化和成盐反应
HA羧基在特定条件下均可酯化。
意大利Fidia公司研究发现，将HA分子中的羧基完全或部分与脂肪醇、芳基脂肪醇以及环状脂肪醇等酯化，既可保留许多HA原有的性质，如粘弹性、生物相容性及生物降解性，又可使其提高稳定性，抵抗HAas对其的降解作用，延长在体内的作用时间等。
HA分子中的羧基在生理条件下同金属离子成盐，HA成盐才具有水溶性，所以一般的HA制剂成分多为HA盐。
HA盐经H型阳离子交换层析可转换成HA，在生产中常利用该特点进行金属离子或其他阳离子的转换生成新的盐。
在此，HA如同一个小分子有机酸一样，具有羧基的典型反应。
1.3 HA微生物发酵法生产工艺
1.3.1 工艺路线
见图1
图1 微生物发酵法生产HA工艺路线图
1.3.2 工艺过程
(1)摇瓶种子液的培养
取斜面菌种，接种于装有灭菌培养液600mL的2.8L锥形瓶中，36℃培养8-10h，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中。
(2)发酵罐种子液的培养
按摇瓶种子液的配方配制培养液50L，加入种子罐中，通蒸汽加热，121℃灭菌30min。冷却至36℃，用火焰接种法，将摇瓶种子液接种于种子罐中，通气量30L/min，搅拌250rpm，36℃培养30-32h。在发酵过程中，发酵液的pH值不断下降，加5mol/L氢氧化钠溶液，调pH7.0-7.5。发酵后期，葡萄糖浓度下降至0.5%以下，pH值下降很慢或不再下降时，即为发酵终点。
(3)下游分离纯化发酵结束，用三氯乙酸调pH4.0-4.5，板框过滤除菌体，滤液用稀氢氧化钠调pH6.0-6.5,加三倍体积95%乙醇，沉淀出HA。沉淀用发酵体积的0.1mol/L氯化钠水溶液溶解，加入0.5%的活性炭，搅拌吸附1h。过滤，滤液在搅拌下，加入过量的1%CPC水溶液与滤液中的HA发生络合沉淀，静置使沉淀下沉，虹吸出母液，加入0.1mol/L氯化钠液洗涤沉淀两次。沉淀于发酵体积的0.4mol/L氯化钠液中搅拌解离过夜，过滤，滤液加三倍体积乙醇沉淀，沉淀用乙醇和丙酮脱水，用旋转式真空干燥器进行干燥，得SH（HA的钠盐）[1]。
1.4 HA的生理功能
HA－老化皱纹的终极杀手 人体真皮层的其中一种成份，具吸附水份的能力，份量更高达其本身重量的1000 倍，使用含有HA的保养品，可以改善干燥及减少肌肤皱纹的出现，因此，HA是改善干性及老化肌肤的最理想产品。将HA酸注入皮肤之真皮层，可使已生成之皱纹迅速填平，具有修颜的功效。
HA是减缓关节炎疼痛的良药。利用注射HA植入关节腔中，能够缓解骨性关节炎疼痛，并增加关节的可动性和运
动能量。在关节腔中注射HA，可诱发及恢复关节液的弹性和黏度。
HA是降低眼科手术危险性的安全秘方。最理想的眼睛外科手术黏弹液剂是用HA做的可支撑黏性液体，高分子量、高黏度的HA可用在白内障手术、眼角膜移植和青光眼手术中，用来维持眼睛的形状和保护细软的组织，使手术伤害降至最低。
HA是最佳防沾黏医用品。沾黏是纤维性的渗析物将正常应该分开的组织表面黏起来。病人经腹腔手术中约93%会产生术后沾黏，严重时造成小肠打结。动过妇科手术的病人中有 80％以上有沾黏的形成，而此种现象可能导致妇女不孕，故使用抗沾黏片将可防止。
HA是最佳涂布剂 HA涂布剂。涂在血导管、指引导管及其它医学工具上有减低磨擦力的功能，可以让血导管非常容易的引到血管系统，减轻损伤和磨损。
HA可用于眼药水。含有HA的眼药水可用来保护、润滑和润湿眼睛，以医治病人因眼睛太干或因恶劣环境引起的不适和其它疼痛的普遍眼疾。
HA可应用于兽医药学。利用注射高分子量HA的方式来治疗赛马及其它动物常有的骨性关节炎和疼痛。
HA可以作为伤口愈合敷料。HA可促进已清疮的伤口愈合速度，并减少疤痕的产生；根据报导研究指出，婴儿伤口修护后不易产生结疤的原因，为其体内持续含有大量之HA，而成人伤口则缺乏，故产生疤痕；若使用HA敷料则可有效的防止疤痕产生。除此之外，HA亦可加速伤口之修护功能，故可以使用于伤口不易愈合之病患，例如糖尿病足部溃疡或褥疮等病人[2]。
1.5 发酵法生产HA的前景
发酵法生产是HA工业的一场革命。除了人和动物一些组织能分离出HA,一些产气杆菌、铜绿假单胞菌、和A、B、C族溶血性链球菌也能合成HA，因此发酵生产HA工业也应运而生。能够产生HA的菌有多种，其中以兽疫链球菌变异株为主。生产出的HA成本大大降低，质量得到前所未有的提高，分子量大于动物组织提取所得HA，产品不受原料资源的限制，工艺也较简单[3]。
据报道，目前国际上药用级HA价格20万美元/公斤，1995年国际市场HA的总销售额就已达6亿美元。
有关专家对HA做出如下预测：
见表1-3
表1-3 HA的市场预期增长趋势
HA的市场及其预期增长率：
HA的产品 年全球市场销售总值 年预期增长率
化妆品、食用级的HA
医药用HA
含HA的医用品 >1亿美金
0.25亿美金
5.00亿美金 5%
两位数增长
两位数增长
这么好的前景刺激了HA发酵工业的发展，国内几家超前意识强的公司已大规模的用发酵法生产HA。据不完全统计，目前我国有十几家HA生产企业，主要包括山东福瑞达生物化工有限公司、浙江瑞邦制药厂、上海聚源生物科技有限公司、江苏无锡柯兰精细化学品厂、山东东营东辰集团公司、江苏吴江振兴生物制品厂、杭州嘉伟生物制品有限公司、重庆团结生化制品有限公司等等。
目前，发酵法生产HA已成为HA产业的主要生产方法，我国在这方面的发展是比较快速的。现在，各厂家正向高质量高收率开发药用HA等方面发展。
2 实验部分
2.1 微生物发酵法生产HA实验
2.1.1 实验器材
2.1.1.1 主要仪器及设备
见表 2-1
表 2-1 仪器及设备
主要仪器及设备 型号 产地
洁净工作台 D-650 德国Bruker
HPLC T-230A 德国Bruker
控温磁力搅拌器 78HW-1 杭州仪表电机厂
高速离心机 TGL-16G 上海医用分析仪表厂
低温冷冻离心机 6R 北京医用离心机厂
微电脑控制培养箱 LRH-250-2 广东医疗器械厂
紫外分光光度计 UV-PC1601 日本SHIMADZU
数字显示黏度计 DJ-8S 上海医用分析仪表厂
脉动真空灭菌柜 YXQ.NIG-208 江苏东方医疗器械厂
摇床 250.SEG.2 德国B.Broun
电子显微镜 CX41 瑞士Mettler
磁力震荡仪 099AVB424 上海医用分析仪表厂
电子称 200S-WEI、ALC 北京赛多斯天平有限公司
自动罐 BIOFLO5000 美国Labeonco
电热恒温股风干燥箱 DHG-9623A 上海实验仪器总厂
2.1.1.2 细胞培养器皿和用品
培养皿；培养瓶；三角烧瓶250mL；2.8L摇瓶；离心管；量筒；移液管；洗耳球；样品瓶等。
2.1.1.3 主要试剂、药品
见表2-2
表2-2 试剂及药品
试剂、药品名 产地
葡萄糖、蔗糖（分析纯） 中国医药上海化学试剂公司
牛肉膏（生化试剂） 中国医药上海化学试剂公司
Polypepton（蛋白胨）（生化试剂） 日本制药株式会社
yeast extract(酵母浸出粉) （生化试剂） Ovid
NaCl、 MnSO4（分析纯） 上海美兴化工有限公司
Na2HPO4•12H2O（分析纯） 湖州化学试剂有限公司
KHPO4、KH2PO4（分析纯） 湖州化学试剂有限公司
琼脂（生化试剂） 北京三药科技开发公司
MgSO4、FeSO4（分析纯） 上海化学试剂有限公司
NaOH（分析纯） 天津大茂化学试剂厂
ZnSO4•7H20（分析纯） 上海来峰精细化工厂
CuSO4•5H2O、MnCl•4H2O（分析纯） 上海化学试剂有限公司
95%乙醇（分析纯） 杭州长征化学试剂有限公司
泡沫消除剂 中国医药上海化学试剂公司
2.1.2 实验方法
2.1.2.1 菌种的纯化
a.菌种：X4链球菌
b.斜面、平板[4]（固体培养基）
见表2-3
表2-3 固体培养基组成
试剂、药品名 固体培养基组成（g/L）
葡萄糖G 0.5
牛肉膏 1.5
Polypepton 2.0
yeast extract 0.8
NaCl 0.8
Na2HPO4•12H2O 0.2
KHPO4 0.3
琼脂 4.0
调pH 7.0-7.2 , 121℃灭菌30min
c.方法
取原菌株，接入固体培养基的斜面中，35-37℃培养1-2天，进行活化，将活化的菌株取1-2环接入装有玻璃珠的100mL无菌蒸馏水中，180rpm振荡分散菌体，取1mL菌液至9mL无菌水中，梯度稀释至10-7，从每一个稀释度中吸0.2mL悬液，分别用刮刀均匀涂布至含有固体培养基的培养皿中，每个稀释度连续涂布2个平板，35-37℃培养，得到单一菌落[5]，从平板中选取单菌落，革兰染色镜检，将荚膜厚大（见图2）的优质纯菌落接入斜面中，35-37℃恒温培养18小时，冰箱1-4℃保存备用[6]。
图2 X4链球菌荚膜示意图（菌体周围是荚膜）
2.1.2.2 种子的培养
a.种子培养基
见表2-4
表2-4 种子培养基组成
试剂、药品名 种子培养基组成（g/L）
蔗糖 20
酵母粉 10
牛肉膏 10
MgSO4 4
MnSO4 0.2
KH2PO4 4
微量元素液 2mL
注：微量元素液（ZnSO4•7H20 0.1g/L，CuSO4•5H2O 50mg/L，MnCl•4H2O 30mg/L）
配制4L，调pH7.0-7.2 ,分装于6×600mL/2.8L种子摇瓶，121℃灭菌30min。
b.方法
无菌操作，将已经培养2天的斜面1支/瓶用无菌水刮洗接入种子摇瓶。36℃、250rpm摇床培养。移种控制pH在5以上，至对
数增长期约8h，种子液无明显酸味[7]。
2.1.2.3 发酵罐培养
a.发酵培养基
见表2-5
表2-5 发酵培养基组成
试剂、药品名 发酵培养基组成（g/L）
蔗糖 50
酵母粉 20
MgSO4 4
K2SO4 2.6
FeSO4 10mg
微量元素 10mL
泡敌 0.3
NaHPO4 4.8
b.过程中应加入物质
见表2-6
表2-6 过程中需加物质、配置方法及加入时间
试剂、药品名 配置方法
NaHPO4 4.8g溶于1L水加热溶解
NaOH 5mol/L 1000mL×2瓶
G[1] 1.6kg葡萄糖溶于3L水
G[2] 60%浓度葡萄糖4L装HPLC瓶
需分消：121℃灭菌30min
c.方法
本实验采用100L自动发酵罐，温度自控，pH酸碱双相调控，初始装量50L，发酵过程补糖[8]。
准备工作：先清洗发酵罐。然后，将发酵培养基倒入，料定容50L并矫正pH值7.0，检查仪表是否运行正常；检查气密性。121℃灭菌30min。
火焰接种，同时倒入NaHPO4 、G[1]；并开始流补NaOH,以控制pH；
10-11小时开始补葡萄糖G[2]；
20小时后控制补葡萄糖，浓度不低于1%，pH可控制到7.5-8.0；
初始搅拌速度250r/min,当溶氧降到0时升高转速到350r/min,溶氧再次降到0时转速调节为450r/min,不断提高转速，维持溶氧不低于10%，到发酵结束[9]。
d.实验过程（步骤）
（1）接种：火焰接种将6×600mL/2.8L摇瓶种子接入发酵罐中，并将分消的NaHPO4、G[1]一起倒入。
初始设置：
见表2-7
表2-7 发酵罐设初始置
项目 设初始置
搅拌 250rpm,与DO 5%相关联
温度 36℃
空气通量 30L
Feed2 自动补5mol/L的NaOH,与pH7.0 相关
（2）3小时开始： 每小时测粘度η、菌浓、总糖、还原糖、葡萄糖、蔗糖、校正pH。
（3）到10小时，补入G[2]：测试每小时的糖耗，总糖小于等于1%，则补入G[2]。
（4）12小时开始：每2小时测粘度η、菌浓、总糖、还原糖、葡萄糖、蔗糖、校正pH。
（5）21小时开始：每小时测粘度η、菌浓、总糖、还原糖、葡萄糖、蔗糖、校正pH。
（6）32小时放罐：乙醇浸泡，用于产物提取；粗产物产量有1g/L。
e.过程中的取样分析方法
取发酵液至5mL×2离心管，冷冻离心3650rpm 15℃ 10min；取离心管中上清液200µL加600µL乙醇（95%）至EP管，高速离心14000rpm,20min；剩余上清液倒至试管送检，测总糖、还原糖；取EP管中上清液至HPLC样品瓶送检，测G[10]。
f.注意事项
（1）如果pH在短时间内下降，自动补NaOH不能控制pH，则手动补入另一瓶NaOH，手动控制可间歇性开启或关闭；
（2）HPLC测G，当G接近1%时，以0.5L/h补入G[2]；
（3）若DO一直跌，而且搅拌已经达到450rpm，则把空气流量调到40L，还不行则把罐后排气阀略开。如上操作DO仍然跌。则直接补G[2]；
（4）补入G G[2]后，pH调控关联升至7.5。
g.数据记录
见表2-8
表2-8 发酵罐培养过程数据记录
时间 NO pH 粘度ηR30 菌浓
620nm 总糖 还原糖 葡萄糖 蔗糖
Vm消后
Fm消后 7.50 3.52 0.14 3.87
Vm移种 4.86 3.10 0.21 1.11
3h 15：00 1 7.00 0.345 10倍稀释1.067 2.83 0.27 3.28
4h 16：00 2 6.97 0.339 1.093 2.00 0.21 1.79
5h 17：00 3 6.93 0.339 1.096 2.28 0.08 4.11
6h 18：00 4 7.09 0.338 1.071 2.35 0.21 3.68
7h 19：00 5 7.02 0.345 1.223 2.41 0 3.42
8h 20：00 6 6.97 0.335 1.227 2.76 0 3.92
9h 21：00 7 7.00 0.346 1.184 5.56 2.62 2.28 4.18
10h 22：00 8 6.96 0.340 1.219 5.48 2.57 3.26 2.5
12h 24：00 9 7.00 0.338 1.227 5.39 2.48 3.63 3.76
14h 02：00 10 6.99 0.338 1.226 5.41 2.41 2.64 4.29
16h 04：00 11 6.96 0.339 1.273 5.32 2.56 2.64 3.26
18h 06：00 12 6.92 0.227 1.308 5.25 2.48 2.08 3.43
21h 09：00 13 6.75 0.338 1.271 4.92 2.62 2.26 2.68
22h 10：00 14 8.42 0.343 20倍稀释0.760 4.54 2.48 2.14 2.7
23h 11：00 15 7.89 0.341 0.791 4.33 2.28 2.17 2.6
24h 12：00 16 7.45 0.347 0.913 4.47 2.14 1.84 2.7
25h 13：00 17 7.51 0.355 0.873 4.33 1.94 1.60 2.58
26h 14：00 18 7.69 0.351 0.752 4.61 2.00 0.34 2.33
27h 15：00 19 7.70 0.363 0.763 4.47 1.67 1.31 0.45
28h 16：00 20 7.75 0.377 0.798 4.35 1.43 1.14 1.58
29h 17：00 21 7.70 0.398 0.852 4.41 1.23 1.22 1.34
30h 18：00 22 7.65 0.425 0.889 4.38 1.03 1.15 1.88
取部分数据作图可比较直观地看出各项检测内容所体现的趋势：
见图3
图3 pH等随时间变化趋势图
2.2 发酵液中HA含量测定方法的比较研究实验
目前，发酵液中HA含量测定方法主要是咔唑法或改良咔唑法(Bitter Muir法)，其原理是HA中的葡萄糖醛酸可与咔唑发生显色反应。Bitter Muir法在没有杂质的情况下能较好地测定HA含量，但如果样品中含有杂质，分析结果就会出现明显误差。而在溶液中，HA可同十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等阳离子表面活性剂发生络合反应，产生混浊现象，并在一定浓度范围内遵循朗伯比尔定律。用以上原理，Ferrante等采用CTAB浊度法测定溶液中的HA含量，取得较好效果[11]。本实验将CTAB浊度法应用于发酵液中的HA含量的测定，比较了其与Bitter Muir法的准确度和精确度，并探讨了葡萄糖、蛋白质、酵母膏、无机盐等发酵液中主要成分对2种方法分析HA质量浓度所产生的影响[12]。
2.2.1 仪器与试剂
主要仪器与试剂
见表 2-9
表 2-9 仪器与试剂
仪器与试剂名 产地
752型紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司
葡萄糖醛酸 Sigma公司
HA 山东东辰生化集团有限公司,医药级
牛血清白蛋白 BBI公司
其它试剂均为分析纯。
2.2.2 实验方法
2.2.2.1 HA测定方法实验
Bitter Muir法以葡萄糖醛酸溶液制作标准工作曲线。CTAB浊度法以HA为标准制作标准工作曲线。配制45、90、135、180μg/mLHA溶液，分别采用Bitter Muir法与CTAB浊度法测定其HA的质量浓度。
Bitter Muir法:
a.试剂
(1)0.025M四硼酸钠•10H2O(分析级)，溶于浓硫酸（分析级）中，比重1.84；
(2)0.125%咔唑溶于无水乙醇或甲醇中，黑暗中4℃稳定12周；
(3)葡萄糖醛酸标准液4-40(g/mL)，用贮备的苯甲酸饱和去离子水制备。4℃下稳定6个月。
b.步骤
将5mL硫酸试剂加入试管固定在于架子上，冷却到4℃；小心加入0.8mL水和0.2mL样品或标准样，试管用磨砂玻璃塞或聚四氟乙烯塞密封，摇动试管。开始较轻，然后剧烈，其间不断冷却，任何时间都不能超过室温，否则界面上温度将超过135℃。 然后试管在剧烈沸腾的蒸馏水浴中加热10min，然后冷却到室温。（样品加入前冷却到-70℃，然后在摇动时允许其慢慢升到
室温。） 然后加入咔唑试剂(0.2mL)，再次摇动试管，在沸水中再加热15min，冷却到室温，然后在530nm下，用1cm比色皿测量光密度(OD)，OD值对硫酸空白的应小于0.025[13]。
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）沉淀法：
a.试剂
配制45、90、135、180μg/mLHA样品；配制CTAB 质量分数为1%。
b.步骤
初步除去菌体和不溶性杂质后，提取液上加入CTAB。CTAB与HA生成CTAB－HA复合物沉淀。沉淀用0.15 mol/L NaCl中过夜，CTAB－HA 复合物可解离溶解。此法得到清亮，较纯的HA液体。然后在560nm下，用1cm比色皿测量光密度(OD) [14]。
2.2.2.2 发酵液的主要成分对2种方法测定结果的影响
分别配制100、200、300、400、500μg/mL的葡萄糖、蛋白质、酵母膏和KH2PO4溶液作为空白溶剂，再配制不同浓度的葡萄糖、蛋白质、酵母膏和KH2PO4溶液的HA溶液作为样品溶液。采用Bitter Muir法与CTAB浊度法分别测定HA溶液的质量浓度。
2.2.2.3 2种方法对发酵液中HA含量测定的比较
取不同发酵批次的HA发酵液5瓶(培养基配方：葡萄糖44.0g/L，酵母膏9.8g/L，蛋白胨8.4g/L，牛肉膏5.2g/L，KH2PO41.45g/L)，分别采用CTAB浊度法直接测定和提纯HA后采用Bitter Muir法测定。
CTAB浊度法：取适当稀释后的发酵液经0.45μm滤膜过滤除去菌体，滤液采用CTAB浊度法直接测定。
Bitter Muir法：取一定体积的发酵液适当稀释，3000g离心10min除去菌体，取上清加入2倍体积的无水乙醇，混匀后4℃静置1h沉淀HA，弃上清，沉淀溶于同体积0.2mol/dm3的NaCl溶液中，取1mL溶液以Bitter Muir法测定HA含量。
3 结果与讨论
3.1 微生物发酵法生产HA实验
实验采用的是低初糖浓度、高温、高搅拌、通风发酵。低初糖浓度，有利于菌体生长，但高初糖浓度则有抑制作用；高温有利于碳源更多转化为菌体，但温度太高不利于HA合成；高搅拌改善传质传氧，利于营养物质进入细胞，但搅拌产生很大的剪切力，伤害细胞，影响丝状HA分子量；氧能使丙酮酸更多地被氧化成乙酸，从而得到更多的能量，但若不能控制pH，大量乳酸、乙酸会抑制菌体的浓度[15]。
实验过程：3h进入对数生长期（糖耗明显加快，菌液味道有点变酸-有乳酸产生，测pH，pH下降，呈弱酸性）；13h菌体量最高（测菌浓发现数值达到最大值）；32h HA 产量最高(菌液明显变粘，并有浓厚的香甜气味)。
3.1.1 初糖浓度影响
初糖浓度对菌体生长的影响：在控制PH的情况下，低初糖浓度，菌体生长延迟期短，启动快。从底物消耗看，低初糖浓度，菌体能很快进入高糖耗阶段。低初糖发酵时间短、生产强度高。
初糖浓度对产物生成的影响：HA合成与菌体生长偶联，HA合成延迟期与菌体生长延迟期一致。细胞干重和HA产量随初糖浓度增加而增加。但HA产率随初糖浓度提高而迅速下降。高初糖下，HA在发酵后期受到强烈抑制。
本实验控制初始加蔗糖20g/L用于种子的培养，在此适中的低初糖浓度下，菌体能很快的进入高糖耗阶段，数量大幅度增长，从而大大地缩短了种子培养的时间（从原方案的11小时降到了8小时）。在发酵过程开始培养基中加蔗糖50g/L，并加入1.6kg的葡萄糖；过程中采用流补的方式补加葡萄糖以补充消耗的糖。这样既保证了菌体有足够的糖，又不会因为高糖浓度而抑制菌体代谢。
3.1.2 温度影响
33℃HA产量最高，但合成速率低，细胞生长速度降低，发酵时间延长。高温有利菌体生长，碳源更多转化为菌体。发酵后期可考虑降温。随温度升高，细胞生长速度加快，但温度太高不利于HA合成。且温度升高乳酸产量也迅速增加。
最佳温度的选择：以装液量50mL/250mL、pH7.0、250rpm，采用不同的温度培养30小时，结果见图4。
图4 温度对细菌生长和HA产量的影响趋势图
由图4可见，在28℃-38℃范围内，菌体生长随温度的升高而增大，但HA的表达量在36℃左右达到最高，在此温度下HA合成酶活性最大。因此本实验控制温度36℃。
3.1.3 pH影响
pH影响菌体生长和产物积累，影响原生质电荷，改变酶活，从而改变菌体对底物的利用速度和细胞结构，影响菌体生长和产物合成。
最佳pH的选择：以装液量50mL/250mL、36℃、250rpm，采用不同的温度培养30小时，结果见图5。
图5 pH对细菌生长和HA产量的影响趋势图
由图5可见，pH对细菌生长和HA产物的积累有显著影响，并且最佳生长pH值与HA积累pH值不同，当培养基起始pH值为7.2时，菌体生长最好，故最适生长pH值为7.2，而HA积累的最适pH值为6.8。因此，本实验初始控制pH7.2，后控制pH为6.8。
3.1.4 搅拌转速影响
搅拌影响传质，高搅拌产生很大的剪切力，伤害细胞，影响丝状HA分子量。当搅拌小于650rpm，HA产量产率正比于搅拌，因为高搅拌改善传质传氧，也使荚膜更快脱落，利于营养物质进入细胞，促进生长代谢和HA合成。但搅拌高于850rpm时，高搅拌伤害了细胞，虽还能生长，但合成HA能力大大下降。
搅拌在发酵过程中的作用（1）混合：维持溶氧，混匀营养底物利于细胞呼吸；（2）剪切：影响细胞生长，加速荚膜脱离。
搅拌越高菌体生长速率越快，细胞产率也大，但发酵周期只有16hr左右。
发酵产生多糖，黏度增大氧速率增大、DO有相当一部分时间是处于接近零的，这会导致菌体代谢机制发生变、细胞干重增大、耗化。
高搅拌有利于菌体生长，但高DO并不意味着高HA产量，因为还有氧对部分途径的抑制，氧中间代谢产物的毒害。HA荚膜多糖保护防止细胞受氧的毒害。搅拌加速了氧的溶解，增加了细胞与氧的接触，也加速了细胞荚膜的合成以抵抗氧的毒害。但超出一定限度，细胞过量摄入氧，则使氧对细胞毒害，HA降低。
搅拌对分子量的影响：HA由HA合成酶在细胞膜上合成并分泌到细胞外。由于剪切作用引起HA非正常合成，使正在链延长阶段的HA分子提前脱落，同时使丝状长链的HA断裂。
因此本实验采用先控制低搅拌转速250rpm，再慢慢提高转速至450rpm，最后控制低DO（1%）的方法来达到最佳效果。
3.1.5 通气量影响
增大通气量能增加罐内截面气速，增加发酵液气含率，使得气-液表面积增大。增大通气量却使氧传递速率减小，相对低的通气量对合成HA有利。
本实验初始设置通气量30L，当搅拌已经达到450rpm，溶氧DO一直降，则把空气流量调到40L 。这样维持较低的通气量以促进HA的合成。
3.1.6 乳酸的抑制
产HA同时会产生大量的乳酸，80%左右底物转化为乳酸，乳酸生成也偶联于
菌体生长。当乳酸浓度达到30g/L以上，HA合成基本停止。大部分碳源都转化成乳酸，搅拌转速低，表现越明显。转速增加，DO提高，使发酵产生的还原型辅酶I（NADH）通过呼吸链氧化，减少乳酸。
通过pH的自动调控，本实验可以较有效的解决乳酸的影响。
3.1.7 结论
通过实验可以确定的工艺条件：
(1) 初糖浓度：种子培养加蔗糖20g/L；发酵过程中初始加蔗糖50g/L，并加入1.6kg的葡萄糖；过程中采用流补的方式补加葡萄糖。
(2) 温度：全过程控制温度36℃。
(3) pH：初始控制pH7.2，后控制pH为6.8。
(4) 搅拌转速：先控制低搅拌转速250rpm，再慢慢提高转速至450rpm，最后控制低DO（1%）。
(5) 通气量：初始设置通气量30L，当搅拌已经达到450rpm，溶氧DO一直降，则把空气流量调到40L。
(6) 乳酸：pH自动调控。
3.2 发酵液中HA含量测定方法的比较研究实验
3.2.1 2种方法测定HA溶液的结果比较
Bitter Muir法的标准工作曲线：A=0.015C-0.0116，ｒ=0.9993，根据理论计算HA分子中葡萄糖醛酸的含量为46.32%，因此将葡萄糖醛酸测量值除以46.32%，即可得到HA的含量。CTAB浊度法的标准工作曲线：A=0.0037C+0.0214，ｒ=0.9983。
由2种方法的标准曲线和表3-1可知，Bitter Muir法和CTAB浊度法都有较高的准确度和精确度，在没有杂质的情况下都能很好地测定溶液中的HA含量。
表3-1 Bitter Muir法、浊度法的准确度和精确度
测定方法 C（HA）/（μg/mL）
实际值 测量值 测定误差/% 标准差/
（μg/mL）
Bitter Muir法 45
90
135
180 44.69
89.62
135.20
178.02 0.69
0.42
0.15
1.10 0.45
0.42
0.67
2.08
浊度法 45
90
135
180 45.17
90.53
134.02
179.26 0.38
0.59
0.73
0.41 0.67
0.24
1.25
0.89
3.2.2 发酵液主要成分对2种方法测定结果的影响
（1）葡萄糖对2种方法测定结果的影响
HA发酵碳源主要是葡萄糖，所以以葡萄糖来分析糖分对测定方法的影响。葡萄糖浓度在较低的情况下，能使Bitter Muir法产生极大误差。这是因为Bitter Muir法中加入浓硫酸使葡萄糖碳化，形成色素具有强吸光性，严重影响测量结果。葡萄糖对CTAB浊度法结果的影响见表3-2，可看出葡萄糖对CTAB浊度法测定HA的影响很小，误差都在1%左右。
表3-2 葡萄糖浓度对CTAB浊度法测定HA的影响
C（葡萄糖）/
μg/mL C（HA）/（μg/mL）
实际值 测量值 测定误差/%
0
100
200
300
400
500 180
150
120
100
80
60 180.45
149.07
119.15
99.38
79.06
59.49 0.25
0.62
0.71
0.62
1.18
0.85
（2）蛋白质对2种方法测定结果的影响
由表3-3的结果可知，蛋白质对Bitter Muir法测定HA浓度存在较大干扰，当蛋白质浓度超过300μg/mL时，分析结果明显偏低。而蛋白质对CTAB浊度法测定结果的影响很小，说明无需预处理除去发酵液中的蛋白质就可以直接测定。
表3-3 蛋白质浓度对测量结果的影响
C（蛋白质）/
（μg/mL） C（HA）实际值/（μg/mL） Bitter Muir法
C（HA）测量值 测定误差/% CTAB浊度法
C（HA）测量值 测定误差/%
（3）无机盐对2种方法测定结果的影响
以HA发酵培养中含量较多的KH2PO4来研究无机盐对测定方法的影响。由表3-4的结果发现KH2PO4对Bitter Muir法有一定干扰。这可能是因为无机盐对显色物质的分子构象有一定影响，而无机盐对CTAB浊度法的干扰较小。
表3-4 KH2PO4浓度对测量结果的影响
C（KH2PO4）/
μg/mL C（HA）实际值/（μg/mL） Bitter Muir法
C（HA）测量值 测定误差/% CTAB浊度法
C（HA）测量值 测定误差/%
（4）酵母膏对2种方法测定结果的影响
从表3-5结果可以看出，酵母膏对Bitter Muir法也有很大干扰，当其浓度大于300μg/mL时，HA的测定结果明显偏低。这可能是酵母膏中所含有的糖分和色素干扰测定结果所致。而酵母膏对CTAB浊度法影响较小，其测定误差均小于2%。
表3-5 酵母膏浓度对测量结果的影响
C（酵母膏）/
μg/mL C（HA）实际值/（μg/mL） Bitter Muir法
C（HA）测量值 测定误差/% CTAB浊度法
C（HA）测量值 测定误差/%
0
100
200
300
400
500 180
150
120
100
80
60 178.51
144.33
115.52
86.85
66.78
47.94 0.83
3.78
3.73
13.15
16.53
20.10 179.69
151.10
120.44
100.82
80.71
60.72 0.17
0.73
0.37
0.82
0.89
1.20
3.2.3 2种方法测定发酵液中HA含量的结果比较
发酵液不经过预处理直接采用Bitter Muir法测定误差极大，而HA经过提纯，发酵液中影响测定的成分得以去除，此时采用Bitter Muir法的测量值可视为标准。比较提纯HA后采用Bitter Muir法的测量值和CTAB浊度法直接测量值，结果如表3-6所示。CTAB浊度法直接测量值与提纯HA后的测量值的差距较小，测定误差均在2%以内。所以CTAB浊度法应用于HA发酵液的分析，可以不经预处理而直接测定，并且具有较好的准确度和精确度。
表3-6 发酵液中HA的测定结果
发酵液
编号 C（HA）/（μg/mL）
提纯HA后B•M法测量值 CTAB浊度法直接测量/（μg/mL）
C（HA）测量值 标准差 测定误差/%
1
2
3
4
5 97
153
183
230
286 96
156
182
229
189 0.13
0.75
1.56
0.80
1.78 1.03
1.96
0.55
0.43
1.05
3.2.4 结论
Bitter Muir法和CTAB浊度法在没有杂质的情况下都能很好地测定HA含量，有较高的准确度和精确度。但相对于Bitter Muir法较为繁琐的测定步骤，CTAB浊度法的操作简便快捷。发酵液的主要成分对Bitter Muir法测定结果都存在一定干扰，特别是葡萄糖和酵母膏对结果影响很大。因此利用Bitter Muir法测定HA之前发酵液必须经过预处理，需先将菌体去除，再用乙醇将HA提取出来测定。加之Bitter Muir法反应时间较长，每测定一个样品需要3h以上。发酵液成分对CTAB浊度法测定HA质量浓度的影响较小，在大部分的情况下结果误差都小于2%，因此发酵液不需要预处理即可测定。并且,CTAB浊度法的步骤简便，特别适合大量样品的测定，能够大大提高工作效率。
4．总结与展望
HA是一种性能优良的生化物质，广泛应用于医药、日化、食品等领域，具有独特的保湿性能，是目前国内外生物化工界热点产品之一。
采用发酵法制造的HA，优点是能按商品设计来设定分子量。微生物发酵法具有产品不受原料资源限制，生产成本低，工艺简单等
特点，是今后主要的研究开发方向。我国发酵法尚处于研究开发阶段。本论文阐述的正是采用低初糖浓度、高温、高搅拌、通风发酵的微生物发酵法。低初糖浓度，有利于菌体生长，高初糖浓度则有抑制作用；高温有利于碳源更多转化为菌体，但温度太高不利于HA合成；高搅拌改善传质传氧，利于营养物质进入细胞，但搅拌产生很大的剪切力，伤害细胞，影响丝状HA分子量；氧能使丙酮酸更多地被氧化成乙酸，从而得到更多的能量，但若不能控制pH，大量乳酸、乙酸会抑制菌体的浓度。所以设计合适的工艺条件尤其重要，需要经过几次、几十次、甚至几百几千次实验研究，而最适合的工艺将在实验研究过程中不断改善。在实验中工艺条件的是否合理最直观地可以表现在HA的产品含量上，而如果要在过程中进行工艺调节则需要一个时时检测HA含量的简便、有效、快速的测定方法。通过对Bitter Muir法和CTAB浊度法的详细比较发现，两种方法在没有杂质的情况下都能很好地测定HA含量，但相对于Bitter Muir法较为繁琐的测定步骤,CTAB浊度法的操作简便快捷。发酵液的主要成分对Bitter Muir法测定结果都存在一定干扰,测定之前发酵液必须经过预处理。而发酵液成分对CTAB浊度法测定HA质量浓度的影响较小。所以本实验就采用了CTAB浊度法来测定HA含量。
由于HA性能独特、应用广泛，随着科学技术的进步，其研究方兴未艾，新的用途不断被开发，该产品已成为当前国内外极具发展潜力的精细化学品。所以能够在实验研究过程中找到最优的工艺条件，设计出最优的生产工艺就意味着已经取得了最高的商业价值。
致 谢
本次毕业论文是在学院李惠博士和华东医药发酵工程实验室马骏研究员的悉心指导下完成的。导师以其严谨求实的治学态度、高度的敬业精神、兢兢业业、孜孜以求的工作作风和大胆创新的进取精神对我产生重要影响。他们渊博的知识、开阔的视野和敏锐的思维给了我深深的启迪。同时，在此次毕业设计过程中我也学到了许多了关于微生物发酵方面的知识，实验技能有了很大的提高。本论文从选题到完成，每一步都是在导师的指导下完成的，倾注了导师大量的心血。在此，谨向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢！
论文的顺利完成，也离不开各位老师、同学和朋友的关心和帮助。我要特别感谢校友席联欢对我论文写作的指导，他为我完成这篇论文提供了巨大的帮助。感谢发酵工程实验室一起做毕业设计的黄燕同学对我的无私帮助，使我得以顺利完成论文。同时实验室的谢培军老师也时常帮助我，在此我也衷心地感谢他。
还要感谢大学四年来所有的老师，为我们打下制药工程专业知识的基础；同时还要感谢所有的同学们，正是因为有了你们的支持和鼓励。此次毕业设计才会顺利完成。
最后感谢生化学院和我的母校-浙江科技学院四年来对我的大力栽培。
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