大小鼠研究报告论文

从20世纪70年代中期开始，就有人尝试用各种办法向动物体内转移外源基因。如将牛奶成分中特有的基因转移到白鼠体内，这些外来基因在白鼠体内重组后，白鼠分泌的乳汁便含有牛奶成分。这种通过人工方法获得外来基因的白鼠，称为转基因鼠。 转基因动物技术的核心，是把遗传的功能单位——基因转移到动物体内，使它成为动物体内的一部分。被转移的基因可以来自同种或异种动物，也可以来自植物或微生物。这样一来，就打破了物种之间的界线，也可以说动物能与植物、微生物杂交了。不过目前的杂交是低水平的，只限于主管一两个性状的一两个基因。随着科学技术的发展，一次可以转移的遗传信息将越来越多，那时就可以实现真正意义上的动植物之间的杂交。从科学上讲，这将是一个大突破。 目前，世界上已报道了多种生产转基因动物的方法，但真正成熟并可以稳定生产转基因动物的方法只有两种，即显微注射DNA的方法和精子介导的基因转移法。 显微注射DNA的方法是对单细胞的胚胎进行基因操作，涉及复杂的操作步骤。首先是要准确掌握母畜的性周期，在此基础上加以人工调节，使母畜在预先确定的时间排卵，保证获得大量的刚刚受精的单细胞胚胎。第二步是用手术或非手术的方法收集单细胞胚胎，经短暂的离心处理后，放在显微镜下用口径1 μm玻璃微管向细胞核注射500～600拷贝基因。然后把经过DNA注射的胚胎移植到另外一头处于相同性周期的母畜的体内。经过这样处理后，在后代中就会出现1%～3%的转基因动物。效率虽然不高，但结果相当稳定。全世界已在各种动物身上进行了上万次的试验，都能生产出转基因动物。 精子介导的基因转移是把精子作适当处理后，使其具有携带外源基因的能力。然后，用携带有外源基因的精子给发情母畜授精。在母畜所生的后代中，就有一定比例的动物是整合了外源基因的转基因动物。同显微注射方法相比，精子介导的基因转移有两个优点：首先是它的成本很低，只有显微注射法成本的1／10。其次，由于它不涉及对动物进行手术处理，因此，可以用生产牛群或羊群进行试验，以保证每次试验都能够获得成功。 生产转基因动物的研究自20世纪90年代以来日趋活跃，转基因动物技术的实用意义是：①生产出性状优良的家畜家禽，如长得快的，繁殖力高的，能抗病的等；②利用动物体作为反应器，生产珍贵的蛋白质，如一些只能从人体内提取的蛋白质；③利用动物作研究模型，比如，知道高血压症是由某种原因造成，可以生产一些高血压小鼠，让医生在小鼠身上试用各种疗法；④生产玩赏动物，如同猫一样大的小马，如同鼠一样大的兔子，以及各种不同毛色和花纹的观赏动物。 在转基因动物方面，我国也取得了许多可喜的成果，目前已获得了转基因鱼、兔、鸡等多种转基因动物。1998年2月中国科学家又获得了在所分泌的乳汁中含有蛋白凝血因子X的转基因山羊。把两只老鼠放在一个仿真环境中，并将其中一只小白鼠的压力基因全部抽取出来，结果那只未被抽取压力基因的灰颜色的老鼠走路或者觅食物总是小心翼翼的。 在那个面积约500平方米的仿真自然环境里面，灰老鼠一连生活了十几天，没有出现任何意外。它甚至开始为自己积蓄过冬的食物，也开始习惯这一种没有人类恐吓的空间。而另一只被抽取了压力基因的小白鼠则从一开始就生活在兴奋之中。小白鼠只用一天时间把500平方米的全部空间都大摇大摆地观察了一遍，灰老鼠用了近四天的时间才把整个仿真空间全部熟悉。小白鼠爬上了仿真空间高达13米的假山，而灰老鼠最高只爬上了盛有食物的那个仅高2米的吊篮。 结果是小白鼠在仿真空间的第三天，因为没有任何压力而爬上了那个高达13米的假山，在试验能不能通过一个小石块时一下子摔了下来，死了。而灰老鼠因为有一定的压力，它鲜活地出来了。

一、 气味介导的连续性延迟样本不匹配任务（Odor-guided Continuous Delayed-Nonmatching-to-Sample Task，cDNM，1992） 在该任务当中 ( Otto and Eichenbaum, 1992a , b ; Ramus and Eichenbaum, 2000 )，研究人员训练大鼠依据前后两个气味是否相同来做出适当的选择从而获得水的奖励。大鼠被放置于一个30 X 30 X 30厘米的亚克力箱子里，在箱子的一面墙上，离地面5厘米的位置设置了一个用于喷气味的圆形开口，开口正上方的适当位置有一个出水口，出水口上方距离地面13厘米处安置了两个闪光灯。大鼠的鼻子进出出气口或出水口的行为用两个独立的红外分别监测。在一次测试（Trial）当中，灯首先被打开，指示本次测试的开始。当大鼠把鼻子伸进出气口500 ms之后，随机给大鼠闻一种气味（从16种气味之中），闻到气味5秒之内大鼠需要做出正确的反应，即决定是否把鼻子伸入出水口。所谓正确的反应，是指当此气味与前一个气味不一样时，大鼠需要将鼻子伸入出水口，以获得奖励；或者当与前一个气味一样时，不做任何反应，但没有奖励。错误的反应则是当此气味与前一个气味不一样时，没有及时的进入出水口，或当两个气味一样时鼻子伸入了出水口。错误的反应没有奖励，且在下一个测试中，两个气味之间的时间间隔加长为7秒（正确情况下为3秒）。在一天的实验中，有一半的测试气味与前一个气味是不相同的，另一半则相同。 若要正确地执行这个任务以获取奖励，在两个气味之间的时间间隔时大鼠要准确地记住第一个气味，从而将后面的气味与之进行比较进而做出正确的行为反应。在两个气味之间的间隔记住前一个气味即模拟了人类在交谈时短暂地记住前几句话从而帮助理解后面的内容这一认知过程，即工作记忆。人类工作记忆的一个特点是随着时间间隔的加长记忆的准确度随之降低，在这个任务中，研究人员可以通过调节两个气味之间的时间间隔从而观测时间长度对于工作记忆准确度的影响。 二、 嗅觉延迟配对偶联任务（Olfactory Delayed Paired Association Task, ODPA Task，1993） 在该任务当中 ( Bunsey and Eichenbaum, 1993 ; Rajji et al., 2006 ; Zhu et al., 2020 )，研究人员训练大鼠/小鼠根据气味的配对关系做出正确的反应以获取奖励。该任务可以在自由运动的大鼠，或者头部固定的小鼠上实现。实验中，研究人员给实验动物一前一后闻两种不同的气味（分别称为样本气味和测试气味），两个气味之间为延迟期（没有任何刺激），实验动物需要根据两个气味的配对关系决定选择左侧还是右侧出水口（大鼠），或者决定是否舔舐出水口（小鼠）。 实验中，部分气味组合是有奖励的（比如A-C，B-D），部分气味组合是没有奖励的（比如A-D, B-C）。为了做出正确的行为反应，实验动物需要在两个气味之间的延迟期记住第一个气味，再与第二个气味进行配对，从而做出正确的反应。在两个气味之间的延迟期，即工作记忆发挥作用的时间段。三、 延迟性空间交替任务（Delayed Spatial Alternation Task，1998） 在该任务当中 ( Baeg et al., 2003 ; Jung et al., 1998 ; Kim et al., 2016 )，研究人员训练大鼠在迷宫中交替选择不同的空间位置从而获得奖励。该任务在一个8-字形迷宫中完成。8-字形迷宫的中间作为起始位点，向上的方向大鼠可以向左或者向右拐弯，当本次拐弯的方向与上一次相反时，大鼠沿着8-字迷宫从下方绕回起始位点从而获得奖励。相反，如果前后两次拐弯的方向一样时，则没有奖励。实验人员通过调节大鼠在起始位点的时间长短，进而控制前后两次拐弯之间的时间间隔，即工作记忆发挥作用的时间长度。四、 气味-位置匹配任务（Odor–Place Matching Task，2008） 在该任务当中 ( Fujisawa et al., 2008 )，研究人员训练大鼠依据不同的气味（巧克力气味或奶酪气味）选择所去的位置从而获得相应的奖励（巧克力或奶酪）。该任务在一个M形的迷宫里完成，M形迷宫的中间臂底部作为起始位点。当大鼠将鼻子伸进起始位点的给气口时，系统随机喷出两个气味中的一个，然后大鼠需要根据气味的身份选择去左边或者右边的侧臂，以获取奖励。 从中间臂的底部跑至顶部，直至做出向左或向右的选择这段时间之前，大鼠需要准确地记住气味的身份，以便做出正确的选择从而获得奖励。这个时间段即模拟了工作记忆的过程。五、 记忆介导的方向选择任务（Memory-Guided Orienting Task，2011） 在该任务当中 ( Erlich et al., 2011 ; Kopec et al., 2015 )，研究人员训练大鼠依据声音震动的不同频率做出正确的选择以获取奖励。该任务在一个隔音和避光的训练盒内完成。在盒子的一面墙上，设置了3个并排的开孔。当中间开孔的LED灯亮起时，指示一次测试的开始。大鼠需要将鼻子深入中间开孔，并保持一段时间（0.9-1.5 s），这段时间称之为关注期（Fixation Period）。在大鼠将鼻子伸入中间开孔150毫秒之后，系统会发出一定频率（20-150 Hz）的滴答声，持续300毫秒。当中间的LED熄灭时，标志着关注期的结束，大鼠需要根据滴答声的频率做出向左或向右的选择。当频率大于50 Hz时选择左侧开孔，反之则选择右侧开孔，以获得水的奖励。 从声音刺激结束，到关注期结束这段时间（450 –1050 ms），大鼠需要记住声音的频率，或者即将选择的方向，以做出正确的选择从而获得奖励。这段时间需要调用工作记忆的功能。六、延迟性空间位置非匹配任务（Delayed-Nonmatch-to-Place Task, DNMP，2011） 在该任务当中 ( Spellman et al., 2015 ; Suh et al., 2011 ; Yamamoto et al., 2014 )，研究人员训练自由运动的小鼠在T形迷宫中选择不同的空间位置以获取奖励。该任务的每个测试需要小鼠跑两次T迷宫。第一次称为采样跑（Sample run）。小鼠从T形迷宫的长臂起始，当跑至T形迷宫的横臂时，进入打开的那半个横臂，称为T1（另外一个横臂则被一块挡板挡住，称为T2）。然后小鼠回到起始位点。在起始位点等待一定时间之后（这段时间称为延迟期，通过挡板可人为调节其长短），开始测试跑（Test run）。在测试跑中，左右两个T形横臂都处于打开的状态，小鼠需要选择与采样跑相反的那侧横臂，即T2，才能够得到奖励。如果两次都选择了同样的横臂，则没有奖励。 为了在测试跑时选择正确的横臂，小鼠需要在延迟期牢牢地记住采样跑是选择的是哪个横臂，这个时间段需要大脑行使工作记忆的功能。七、 基于虚拟现实系统的T迷宫记忆导向任务（Virtual-reality System Based T-maze Memory-guided Task，2012） 在该任务当中 ( Driscoll et al., 2017 ; Harvey et al., 2012 )，研究人员训练头部固定的小鼠根据不同的视觉刺激做出正确的方向选择以获取奖励。这是首次利用头部固定的小鼠成功开发出来的工作记忆行为范式。实验中，头部固定的小鼠可以在一个悬空的泡沫球上（通过在装载泡沫球的容器底部持续吹气）自由跑动。在小鼠正前方，放置一个环形显示器，用于呈现虚拟的T形迷宫。T形迷宫的长臂（大约2米）分为上下两部分，下部分用于呈现不同的视觉刺激，指示小鼠在T形交叉口到底是向左还是向右转。而T形长臂的上半部分呈现相同的图形。 为了在T形交叉口选择正确的横向臂，当小鼠跑过T形长臂上半部分时需要准确记住在T形长臂下半部分呈现的视觉刺激，或者将要选择的横向臂。这个时间段，大脑需要调用工作记忆的功能。八、基于触须的物体空间位置辨别任务（Vibrissa-Based Object Localization Task，2014） 在该任务当中 ( Guo et al., 2017 ; Guo et al., 2014 ; Li et al., 2015 )，研究人员训练头部固定的小鼠利用触须去辨别物体的空间位置以获取奖励。实验前，研究人员剪去多余触须，仅留下编号为C2的单根触须。头部固定的小鼠被放置在一个圆柱形管子上，在C2触须可触及的范围内一前一后放置了两个可调节升降的金属杆。正常情况下，金属杆的位置较低，触须无法触碰到。在行为训练的过程中，通过电机随机地将其中的一根金属杆上调（样本期），小鼠听到电机的声音会前后摆动触须去触碰金属杆，进而判断其前后位置。如果是前部金属杆，小鼠需要舔舐左侧出水口以获得水的奖励；如果是后部的金属杆，则需要舔舐右侧出水口才有奖励。如果在前部金属杆的情况下小鼠舔了右侧出水口，或者在后部金属杆的情况下小鼠舔了左侧出水口，则没有奖励。在一次测试（Trial）中，样本期持续1.3秒，样本期后，金属杆调节至触须无法触及的范围，此时期称为延迟期，持续1.3秒。延迟期结束后，一个100毫秒的听觉刺激指示小鼠可以做出舔舐左侧或者右侧出水口的选择。在延迟期，如果小鼠出现舔舐的行为，会有一个高分贝的噪音用于警示其停止反应。 从样本期结束到听觉刺激出现之前的延迟期（1.3秒），小鼠需要记住之前出现的金属杆的前后位置，或者记住到底应该舔舐左侧还是右侧出水口的抉择，直至在声音之后做出正确的反应。这个时间段即属于工作记忆发挥作用的过程。九、气味延迟样本非匹配任务（Olfactory Delayed-Non-match-to-Sample Task, DNMS，2014） 在该任务当中 ( Liu et al., 2014 ; Zhang et al., 2019 )，研究人员训练头部固定的小鼠利用利用前后两个气味的关系来做出恰当的反应以获取奖励。实验人员给头部固定的小鼠闻一前一后两个气味，如果两个气味不相同，则舔舐出水口以获得水的奖励；反之，如果相同，则不能舔舐出水口。该任务通过调节两个气味之间的时间间隔来控制对于工作记忆需求的高低程度，进而模拟人类在不同时间尺度下的工作记忆情况。十、 多感觉模态的基于规则的工作记忆任务（Cross-modal Rule-based Working Memory Task, 2015） 在该任务当中 ( Rikhye et al., 2018 ; Schmitt et al., 2017 ; Wimmer et al., 2015 )，研究人员训练自由运动的小鼠根据不同的规则和不同模态的感觉刺激做出正确的行为选择以获取奖励。研究人员通过使用两种不同的声音刺激（即规则信息）来指示接下来到底是使用视觉刺激还是听觉刺激来做抉择。在短暂地给出指示规则的声音刺激之后，有一个500-700 ms的延迟期（此时期没有任何刺激），然后同时给出一个具有方位信息的视觉刺激（比如左侧）和听觉刺激（比如右侧）。小鼠需要结合规则信息和感觉刺激的方位信息做出正确的反应。如果当前规则指示使用视觉刺激做判断，那么小鼠应该根据视觉刺激的方位而选择左侧出水口；相反，如果当前规则为使用听觉刺激做判断，那么小鼠应该根据听觉刺激的方位而选择右侧出水口。正确的选择会使小鼠得到水的奖励，错误的选择则会有一个反馈的警示噪声。 为了正确地执行这个任务，小鼠需要在规则信息之后的延迟期记住当前的规则，用于指示接下来到底该使用哪种信息来做判断，在这个时间段大脑就需要调用工作记忆的功能。