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热固性粉末涂料由于其独特的应用条件，通常表现出较高固化温度(120C以上)、较厚的涂膜厚度(50u以上)、较短的固化时间(20min以内)，以及较高的初始熔融黏度(无溶剂稀释)等特点。实践表明，正是由于上述特点，使得粉末涂料，在固化过程中比初始黏度较低的溶剂型涂料更容易出现针孔。值得一提的是，热塑性粉末涂料由于体系黏度并不增加，出现针孔的几率相对较小。
针孔作为涂膜缺陷的一种，在高光泽粉末涂料中尤为明显，低光泽粉末涂料，尤其是无光砂纹粉末涂料则通常不明显。如何预防和消除中、高光泽粉末涂料的针孔，成为粉末涂料技术人员必须面对的课题(以下的研究仅针对热固性高光粉末涂料体系)。
粉末涂料涂膜针孔产生的原因及其解决方法：
粉末涂料涂膜针孔的形成与其独特的熔融固化过程是密切相关的，因此，研究粉末涂料涂膜针孔的形成机理，必须弄清楚粉末涂料的熔融固化过程。
粉末涂料，顾名思义是一种粉状的涂料，在涂装过程中首先是通过静电喷涂方式，以一种松散的结构吸附或堆积在底材表面。喷涂完成后，工件进入炽热的烘道，底材及涂料受热熔融流动，原有的松散结构或堆积模式随着粉末颗粒的熔融流动而破坏。需要特别提到的是，在成膜过程中液体流动产生的一种局部涡流效应，称为贝纳德漩涡。贝纳德漩涡产生的本质，则是粉末涂料熔融固化过程中伴随着的黏度变化而导致表面张力的变化，使高黏度低表面张力的流体下沉到涡流的中间(凹部)，而低黏度高表面张力的流体则上升至漩涡的周边(凸部)，直至固化完成。在此过程中，涂装后原有松散堆积空隙内的气体(空气)会在粉末熔融塌陷的过程中聚集形成气泡被排出，来自于涂层内部或者底材的小分子气体也会聚集形成气泡并被排出。随着固化进行体系黏度的不断加大，那些被裹挟于贝纳德漩涡的气泡在排出过程中最终形成针孔。因此，要预防和消除粉末涂料的针孔，就是要分析涂层内小分子(气泡)产生的根源，然后对症下药，预防和解决涂膜针孔缺陷。
在粉末涂料熔融固化过程中，被裹挟于粉末涂层的挥发性小分子主要可分为以下几种情形：
(1) 粉末涂料原生性针孔：被裹挟在涂层内的空气
粉末涂料经喷涂后以疏松的结构堆积在工件上，这种疏松的结构使得粉末颗粒与粉末颗粒之间存在大量的空隙被空气所填充，随着环境温度的升高，粉末涂料颗粒熔融导致这种疏松的结构塌陷，由于粉末涂料涂膜厚度一般大于50μ(喷涂后的疏松结构则远大于这个厚度)，处于中间位置而升温较慢的粉末颗粒熔融较慢，使得其颗粒间的空气被熔融的涂料所裹挟，随着固化的进行，体系黏度逐渐增大，被裹挟在涂层中的空气导致形成了涂膜针孔。这种涂膜针孔是热固型粉末涂料因自身的特点而必然具有的，因此，严格来讲，针孔是粉末涂料的原生性缺陷。为了消除上述因素而导致原生性针孔，去气剂是高光粉末涂料配方中必须使用的原料，而安息香(苯偶姻)则是消除上述针孔的一种高效去气剂。安息香的消泡机理非常复杂，除了可消除上述针孔以外，苯偶姻还对其它因素所造成的针孔的消除有一定的作用。
需要说明的，尽管安息香是一种非常有效的粉末涂料消泡去气剂，它也无法解决所有粉末涂料针孔的问题。即便是粉末涂料原生性的去气问题，仍然需要注意：
(A)安息香在加热情况下容易分解并导致涂膜发黄，过多的安息香的加入会给浅色粉末涂料带来变色的问题。
(B)随着涂膜厚度的增加，尤其是超过120μ以上时，即使加入较大量的安息香，通常涂膜表面仍然会出现明显的针孔(厚膜针孔)。此类厚膜针孔就需要加入其它类型的消泡剂与安息香复配使用来消除。
(C)安息香无法完全消除某些低温固化粉末涂料中的针孔：
为降低固化温度，通常会在聚酯/TGIC体系或聚酯/环氧混合型粉末涂料体系内加入固化促进剂，导致加热固化时体系的熔融黏度会快速增加，使得大量的气体被裹挟在涂层内无法完全释放出来，导致产生针孔。实践表明，安息香无法完全解决这个问题，也需要配合其它消泡剂来解决。
(2)粉末涂料固化反应所产生的挥发性小分子
粉末涂料固化反应可分两类，一类是直接反应无小分子释放型，如羧基与环氧基反应，以及羟基与未封闭的异氰酸酯基反应。目前市场所大量使用的聚酯/环氧混合型室内粉末涂料、聚酯/TGIC型户外粉末涂料、GMA型丙烯酸树脂/DDDA型透明粉末涂料、纯环氧粉末涂料等在固化过程中，固化反应并不产生额外的小分子。另一类固化反应则释放出小分子，如聚酯/β-羟烷基酰胺户外粉末涂料、羟基聚酯/四甲氧基甲基甘脲粉末涂料，以及羟基/封闭异氰酸酯粉末涂料体系，在固化过程中分别释放出水、甲醇及异氰酸酯封闭剂。固化反应所释放的小分子会聚集成气泡并被排出涂膜，但由于粉末体系的黏度增加及膜厚的问题，使得部分小分子来不及释放，被裹挟在涂层内，导致针孔的产生。因此，这类粉末涂料，不仅有原生性的针孔要解决，还有额外产生并聚集的小分子气泡需要消除。当然，值得一提的是，由于B1530封闭剂的解封温度较高，约为160℃，在解封之前体系有足够的时间、低黏度来流平及释放所裹挟的气体，B1530固化体系的针孔问题反而并不是特别明显。
实践表明，单独安息香并不能够显著解决这种针孔问题。此类粉末涂料针孔的消除，除了安息香的使用，还需要配合其它消泡去气剂一起使用。
(3)底材的因素
底材是导致粉末涂料涂膜针孔的又一重要原因，多孔底材，如铸铝、铸铁，是粉末涂料针孔问题的高发区。
究其原因，多孔底材本身存在大量的空气，或者空隙内存在大量可挥发性物质(如未烘干的水分等)，粉末涂装完成后，空隙内的空气或可挥发行物质在加热过程中被熔融的粉末涂料所封闭，随着涂料固化过程中体系黏度快速增大，使得空隙内的气体来不及从涂层内释放，造成针孔。
消除此类针孔，首先，喷涂前可将多孔底材预热温度高一些、时间久一些，尽可能烘干底材，并且使得粉末涂料由于底材温度高而有一个较低的初始熔融黏度，有助于底材内气体的排出。在粉末制造时，一方面可在粉末涂料配方中加入某些能够提高粉末涂料底材的润湿性能的物质，使得熔融的涂料能够快速渗透进多孔的底材，趁体系初始熔融黏度低时尽早逼出空隙内的气体。另一方面，应当选择熔融黏度低一些的树脂(成膜物质)，或者在制粉配方中加入某些可显著降低涂料熔融黏度的物质。
为了提高粉末涂料对底材的润湿性能，可在体系中加入某些含极性基团(如酰胺基、羟基等)的化合物，这些化合物不但可以有助于润湿底材，而且可以帮助降低体系的熔融黏度，类似于液体涂料中的溶剂或者稀释剂，由于在粉末涂料中它们表现出固体的特点，姑且可称之为“固体溶剂”。“固体溶剂”是解决此类问题的一个非常有益的尝试，当然，为了不影响体系的防腐蚀性能， 这类“固体溶剂”不能为非反应且溶于水的化合物，添加量也不可以太大。
值得一提的是，某些反应型的“固体溶剂”的发现可能会表现非常出彩。此类“固体溶剂”主要表现出两个特点：第一，分子量较低的固体物质，并且初始熔融黏度较低;第二，能够参与化学反应，但它不一定与原有粉末涂料体系反应，而是某种自洽的反应体系。典型代表，如封闭型或未封闭的异氰酸酯固化剂(如B1530、B1540)，它们的引入可以参与体系中的残余羟基进行反应可延长体系胶化时间，降低熔体黏度，提高交联密度。此类物质对消除针孔也是有帮助的。
(4)粉末受潮
除非条件异常恶劣，正常情况下粉末涂料是不容易受潮的。容易发生粉末受潮的情况，往往是由于粉末长期处于低温储存条件，突然进入高温潮湿的环境中。开箱后的粉末涂料由于温度较低，很容易使得空气中的水分凝结而受潮。
严重受潮后的粉末涂料，体系中引入了大量的水分，这些水分在烘烤过程被排出涂层，部分来不及排出的气体，则以非常细小的针孔形式，通常是以雾影的形式表现出来。
此类问题，只有预防。首先是确保粉末正常的储存条件，其次是尽可能避免超低温存放，如果实在需要低温存放，应当在开箱使用前让粉末有足够的时间恢复到正常温度，以免受潮。
(5)粉末原材料的因素
原材料小分子含量太高，也是造成涂膜针孔的一个重要因素。一方面，粉末树脂本身挥发份太高，尤其是高沸点小分子含量过高;另一方面，粉末原材料受潮，吸收了大量的水分。
以上因素所导致的针孔一般非常细小，其主要表现为涂膜表面的雾影。
(6)消泡剂的选择
安息香是高光泽粉末涂料最为有效的消泡去气剂，可有效消除正常膜厚( 60-90μ)下的原生性针孔。对其它原因引发的针孔，安息香也有一定的协同作用，但往往作用有限。大量的安息香使用也会带来涂膜黄变得问题，同时安息香本身也是加热分解及升华的物质，过多的使用会带来负面影响。
含酰胺基团、羟基基团的消泡剂可有效提高涂料对底材润湿性能，也可以改善树脂对颜料，尤其是无机颜填料的润湿性，降低涂料的熔融黏度，可有效消除各种原因所产生的泡孔。当然，选择低黏度、胶化时间的树脂对泡孔发生严重的情形，也是必要的。
透明粉消泡剂：作为粉末涂料的一个特殊品种，透明粉的针孔产生的原理与消泡方法与普通粉末涂料相同。特别的一点在于，透明粉是一个高度透明的体系，整个系统在光学上是各向同性的，不存在严重的相分离。因此，在消泡的过程中，所添加的消泡去气剂，必须与体系是完全相容的。在这个意义上，此类消泡剂需要精挑细选。
需要注意的是，大量非反应型消泡剂的加入对涂料性能是有害的，需要谨慎添加的使用量。
总之，粉末涂料针孔(泡孔)的形成原因是多方面的，究其根本原因，是随着固化时体系黏度的增加，被裹挟(Entrapped)在涂层内的小分子气体聚集且来不及释放而形成。被裹挟在涂层内的小分子来源包括：粉末涂料涂装时所疏松堆积的空气(粉末涂料原生性的)、某些固化反应所产生的水、甲醇等小分子、来自多孔底材内部的小分子气体，以及粉末原料或粉末成品存储不当而引入的小分子气体等。可以针对不同的原因，采取相应的解决方法。
一、引言 在聚乙烯生产过程中，会产生少量的低聚物即低相对分子质量聚乙烯，又称高分子蜡简称聚乙烯蜡。因其优良的耐寒性、耐热性、耐化学性和耐磨性而得到应泛的应用。正常生产中，这部分蜡作为一种添加剂可直接加到聚烯烃加工中，它可以增加产品的光译和加工性能。高分子蜡是*良好的钝感剂，同时也可作塑料、颜料的分散润滑剂，瓦楞纸防潮剂，热熔粘合剂及地蜡，汽车美容蜡等。 二、化学性质 聚乙烯蜡R-（CH2-CH2）n-CH3，分子量1000-5000，是白色、无味、无臭的惰性物质，可在104-130℃下熔融，也可以在高温时溶解于溶剂和树脂中，但在降温时仍会析出，它的析出细度与冷却速度有关：慢速冷却得到较粗的颗粒（5-10u），快速冷却析出较细的颗粒（）。在粉末涂料的成膜过程中，当涂膜冷却，聚乙烯蜡从涂液中析出，形成细微颗粒，浮在涂膜表面，起到纹理、消光、滑爽、抗擦划伤作用；适当地选择微粉蜡和涂料体系可得到各种花纹。 三、技术发展 微粉技术是近10年发展起来的一项高新技术，一般把粒径小于μm的粒子称为超微粒子20μm以下的称为微粒子，超微粒子的集合体称为超微粉体。 高分子微粒制备主要有了3种途径：一是由粗粒子出发，用机械粉碎法，蒸发凝缩法和熔融法等物理的方法；二是利用化学试剂的作用，使形成的各种分散状态的分子逐渐长成期望大小的微粒，可分为溶解和乳化两种分散方法；三是直接调节聚合或降解制备。如PMMA微粉、可控分子量PP、分散聚合制备PS微粒子、热裂解成辐射裂解制PTF微粉。我们在国内首先制备出PWEax微粉，经上海市粉体工程中试基地测定达到国外同类产品先进水平。主要工艺过程是物理方法。 （一）PEWax微粉的应用 1、涂料用聚乙烯蜡可以制备高光泽溶剂性涂料水性涂料、粉未涂料、罐头涂料、UV固化、金属装饰涂料等，还可以作为纸板等日用防潮涂料。 2、油墨、套印光油、打印油墨。PEWax可以用来制备凸版水性油墨，溶剂性凹版油墨，石印/胶印、油墨、套印光油等。 3、化妆品、个人护理品。PEWax可以作为粉饼、防汗剂/祛臭剂原材料。 4、卷材用微粉蜡。卷材用蜡有两个要求：即在提高涂膜表面滑度和硬度时，不能影响涂料的流平和对水的敏感性。 5、热熔粘合剂。PEWax微粉可以制备烫印用热熔粘合剂。 6、其它应用。PEWax还可以作铸压金属部件、发泡部件的隔离剂、橡塑片材、管材添加剂，还可以用作紫油流变改性剂和电流变体，也可以作为母料的载体和润滑剂。 （二）改性聚乙烯蜡的发展 我们在20世纪90年代初进行了低相对分子质量聚乙烯蜡的改性工作，关于羧化，接枝也有不少报道。国外申请专利的有德国、法国、波兰、日本。国内也申请了两相相关专利。 从文献调研和市场分析看，聚乙烯蜡和改性聚乙烯蜡，特别是微粉化后将会有更长足的发展。聚乙烯微粉蜡的表面效应、体积效应为在各新产品开发提供了优异的物理化学性能，为适应油墨、涂料、整理剂等各种领域要求也将有更多的系列超细微粉问世。 四、在涂料中的应用及作用机理 涂料用蜡主要以添加剂的形式加入，蜡类添加剂一般以水乳液形式存在，最初是用于改善涂膜的表面防扩性能。主要包括提高涂膜的平滑性、抗划性以及改善防水性。此外，它还可以影响涂料的流变性能，它的加入可以使金属闪光漆中铝粉这类的固体颗粒的取向变得均匀。在无光漆中它可以作为消光剂，根据其粒径和粒径分布，蜡类添加剂的消光效力也各不相同。因此，蜡添加剂即有适于有光漆的也有适用于无光漆的。微晶化改性聚乙烯蜡，可用于改善水性工业涂料的表面性质。如Ffka-906，加入后平滑性、抗粘连性、抗划伤性及消光作用都有加强，而且可以有效抑制颜料沉淀。添加量为。 （一）蜡在涂膜中所提供的特点 1、耐磨、防刮伤、防擦伤：蜡分布在涂膜中借此保护涂膜、防止刮伤、擦伤并提供耐磨损性；譬如集装箱涂料、木器涂料、装饰涂料等均需此功能。 2、控制磨擦系数：通常利用它的低摩擦系数，提供涂膜优异的滑度，同时因不同种类的蜡而有特殊丝绸柔和的触感。 3、耐化学品性：由于蜡的安定性而能赋予涂膜更佳的耐水，耐盐水喷雾等性能。 4、防止贴合：避免涂装物或被印刷物有回粘、贴合现象。 5、控制光泽度：选择适当的蜡，依不同添加量而有不同的消光效果。 6、防止二氧化硅等硬结沉积，增加涂料储存安定性。 7、防止金属刮痕（Antimetal Marking）：尤其在印罐涂料，除了提供良好的加工性，更可以起到保护印罐储存物的储存安定。 （二）蜡在涂料中的特点与机理 蜡的种类繁多，而其展现在涂膜的形态我们大致可分成下列三种： 1、起霜效果：例如选用的蜡的熔点低于烘烤温度时，由于蜡在烘烤时熔融成液态，成膜冷却后，即在涂面上形成似霜的薄层。 2、球轴效果：此效应在于蜡由其本身的粒径大小与涂层膜厚相近，甚至大一些，而显露在外，使得腊的耐刮、防擦伤性能可以显现。 3、漂浮效应：不论蜡的粒子形态，蜡在成膜过程中漂移至涂膜表面均匀的分散开来，使得涂膜最上层有蜡的保护，显现蜡的特点。 （三）蜡生产方法 1、熔融法：以溶剂在密闭、高压的容器下加热熔融，然后在适当的冷却条件下出料，获得成品；缺点是质量不易控制，操作成本高且危险，同时某些蜡并不适用这种方法。 2、乳化法：可得又细又圆的粒子，适用于水性系统，但所加入的表面活性剂会对涂膜的耐水性造成影响。 3、分散法：将蜡加入树蜡/溶液中，利用球磨机、滚筒或其他分散设备分散；缺点是难获得高质量的产品，且成本高。 4、微粉化法：可采用喷射微粉机（Jet-Microniser）或微粉/分级机（Microniser/Classifier）生产工艺，即是利用粗腊在高速状态下相互间激烈碰撞后逐渐碎裂成微粒状，然后再由离心离心力作用，在失重下被吹逸出来收集而得。此为目前应用最多的制造方法。 虽然蜡的使用方法颇多，但仍以微粉化蜡为最多，而市面上微粉化腊的种类繁多，且各制造厂家生产工艺也均有差异，使得各厂微粉化蜡的粒径分布，相对分子质量、密度、熔点、硬度等性质均有些差异。 聚乙烯蜡的制造，一般有高压、低压聚合法；其中高压法的制得的聚乙烯蜡带支链，密度与熔融温度均较低，而低压法则可制得直链的低比重的腊；PE腊有各种不同的密度，例如同为低压法制得的非极性PE蜡而言，通常低密度者（低支链、高结晶度）较坚硬，有较佳的耐磨损及抗创痕性，但在滑性及降低摩擦系数上则稍差。
表观遗传学，包括组蛋白共价修饰(covalent histone modification)、DNA甲基化修饰(DNA methylation)、RNA甲基化修饰(RNA methylation)、基因组印记(genomic imprinting)、基因沉默(gene silencing)、RNA编辑(RNA editing)及非编码RNA(noncoding RNA)等，是 指在核苷酸序列不发生改变的情况下，生物表型或基因表达发生了稳定的可遗传变化 。 RNA甲基化 作为表观遗传学研究的重要内容之一，是指发生在RNA分子上不同位置的甲基化修饰现象， 6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A) 和 5-甲基胞嘧啶(C5-methylcytidine，m5C) 是真核生物中最常见的两种RNA转录后修饰。RNA甲基化在调控基因表达、剪接、RNA编辑、RNA稳定性、控制mRNA寿命和降解等方面可能扮演重要角色。 相对于DNA甲基化，RNA甲基化更加复杂、种类繁多、普遍存在于各种高级生物中。已知绝大部分真核生物中，mRNA在5’ Cap处存在甲基化修饰，作用包括维持mRNA稳定性、 mRNA前体剪切、多腺苷酸化、 mRNA运输与翻译起始等。而3’ polyA发生的修饰有助于出核转运、翻译起始以及与polyA结合蛋白⼀起维持mRNA的结构稳定。但是这些修饰只发生mRNA的头部和尾部，关于RNA的内部修饰（internal modification）在许多种类的RNA中都有发⽣。无论是mRNA还是lncRNA，都大量存在m6A修饰。m6A能够加速mRNA前体的加工时间，加快mRNA在细胞中的转运速度和出核速度。主要学习研究较多的m6A。RNA的m6A甲基化⼀共有大三类酶参与： Writers、 Erasers和Readers ，需要相关研究的可以学习相关文献。 检测m6A的方法非常多，如包括MeRIPseq、 miCLIP-seq、 SCARLET、 LC-MS/MS等。2012年之后，两篇发表于Nature和Cell上的论⽂可以说是第⼀次从转录水平上，大范围高通量地鉴定了人和小鼠m6A的甲基化水平（Dominissini 2012和Meyer 2012）。这两篇独立发表的论文采用的 核心方法就是 将m6A抗体与带有m6A的mRNA片段相结合 后进行高通量测序 。通过对下机数据的分析，来鉴定mRNA上m6A程度较高的区域，分辨率约为100nt。这种方法我们称之为MeRIP-seq（ me thylated R NA i mmuno p recipitation sequencing）或m6A-seq。 MeRIP-seq建库步骤 ： 1. 提取total RNAs，并用Oligo-dT磁珠对total RNAs带有polyA的mRNA进行富集（通常要求Total RNA 300ug，人鼠可以做微量2ug 但结果可能会出现map率低dup率高 建库步骤与常量也有区别）； 2. 用磁珠进行富集，得到带有polyA的mRNA。之后加入片段化试剂，将完整的mRNA进行片段化。或者使用超声波仪直接进行片段化； 3. 将片段化后的RNA分成两份。⼀份加入带有m6A抗体的免疫磁珠，对含有m6A甲基化的mRNA片段进⾏富集。另⼀份作为control，直接构建类似常规的转录组测序文库（这一步就是IP步骤，片段化程度、抗体抓取效率都会影响到后期实验结果；这里的control通常称为Input）；4. 对m6A抗体免疫磁珠进行富集，带有m6A的mRNA片段进行回收后，按照转录组的建库流程构建常规的测序文库； 5. 分别将构建好的2个测序文库，即m6A-seq library和RNA-seq library分别进行高通量测序。测序平台保持一致，推荐Hiseq X ten或Novaseq； 6. 对下机数据进行生物信息学分析，对发生m6A甲基化程度较高的区域进行peak calling。由于不能做到单个碱基的分辨率，所以只能对大致的区域进行分析。从下图中我们可以发现，与右侧常规的转录组测序结果相比，在基因上有两处区域存在非常明显的高甲基化峰； 7.接下来会进行一些常规分析，如peak区域基因注释，差异peak分析。 以上就是关于m6A-seq的标准步骤，现在是不是对m6A-seq有了一个非常直观的认识呢？ 再次强调下，这种测序方法只能鉴定高甲基化的区域，并不能做到单碱基的分辨率。 思路1 老数据挖掘 第一步：先从原有的转录组数据中，挖掘到差异表达的甲基化酶； 第二步：对挖掘到的甲基化酶如METTL3或FTO等进⾏qPCR验证，并进行m6A-seq分析哪些基因甲基化水平发生改变； 第三步：在细胞（动物模型可选）中对这些酶进行敲低和过表达，进行常规的qPCR和WB检测相关酶表达情况，并用LC-MS/MS法检测RNA整体m6A水平； 第四步：继续对这些敲低和过表达的细胞进行转录组测序/小RNA测序或表达谱芯片/小RNA芯片，分析哪些基因出现差异表达变化和可变剪切变化； 第五步：找到甲基化酶调控的靶基因，进行敲低和过表达，看甲基化酶缺陷的细胞或动物模型表型能否补救； 第六步：在确定上一步靶基因确实受到甲基化酶调控后，对靶基因上的motif进行点突变后进行验证； 第七步：鉴定新型的甲基化酶（可选）。 思路2 研究甲基化修饰差异基因 第一步：直接进行m6A-seq和转录组测序，找到时间顺序或差异表达的基因并用qPCR、 WB等⽅法验证，此外找到m6A有差异的基因； 第二步：对甲基化酶进行敲低和过表达，检测RNA整体的m6A水平，之后可进行转录组或小RNA测序等方法检验甲基化酶敲低和过表达对mRNA或miRNA整体的影响，并着重研究第⼀步中感兴趣的m6A有差异的靶基因； 第三步：对靶基因进行敲低或过表达，是否能够对甲基化酶异常表达后的表型进⾏恢复； 第四步：对靶基因上motif进行点突变后进⼀步确认直接受到甲基化酶调控； 第五步：鉴定新型的甲基化酶（可选）。 当然根据不同的研究目的还有许多其他的研究思路，可根据自身实验设计进行延申和拓展。m6A相关SCI论文根据不同实验手段IF2~20不等，实验手段：m6A-seq、转录组测序/表达谱芯片、 LC-MS/MS 或 m6A 比色法、小RNA 测序/小RNA芯片、qPCR、 WB、敲降/过表达、靶基因验证、动物实验、临床实验/药物实验等。 学习资源来源网络，侵删。 参考学习： 1、 高通量RNA甲基化测序数据处理与分析研究进展 2、 RNA修饰检测技术 Roundtree, Ian A et al. “Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation.” Cell vol. 169,7 (2017): 1187-1200. doi: Helm, M, & Y. Motorin. "Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate.” Nature Reviews Genetics (2017):275.
m6A RNA甲基化是最常见、最丰富的真核生物mRNA转录后修饰。研究表明，m6A 在不同组织，细胞系中是一个复杂的调控网路，m6A RNA 甲基化参与 RNA 的代谢过程，并与肿瘤的发生和发展密切相关。本期着重解读两篇癌症中的 m6A 研究，看一下 m6A RNA 甲基化如何玩转高分期刊。 2020年10月，南京医科大学汪秀星课题组和美国 UCSD Jeremy Rich 等课题组在Cancer Discovery上发表题为“The RNA m6A reader YTHDF2 maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells”的研究论文。该研究为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。 研究背景 胶质母细胞瘤（GBM）代表了最常见的原发性，内在性脑肿瘤，患者的平均生存期限制在一年以上。鉴于胶质母细胞瘤干细胞（GSC）在治疗抗性，血管生成，免疫逃逸和侵袭中的作用，临床和临床前观察表明，靶向GSC可以改善肿瘤预后神经肿瘤学上的精准医学研究。 研究方法 研究结果 1. 在 GSC 中上调的致癌转录本以 RNA m6A 修饰为标志 作者利用 MeRIP-seq 对 GSC 和神经干细胞（NSC）进行 m6A 标记的检测，结果发现，与非肿瘤对应物相比，GSCs 的m6A 分布发生了改变。通过38个 GSCs 和5个 NSCs 的队列中的 RNA-seq 数据进行 GSEA 分析，具有 m6A 峰的基因在GSC 高度富集，而且在 GSC 中获得的具有 m6A 峰的基因均被上调。相反，相对于 NSC、GSC 中丢失 m6A 峰的基因通常在 GSC 中被下调。而且，在 GSC 中，与癌症干细胞相关的重要基因上获得了 m6A 峰，包括表达增加的 OLIG2 和 MYC 。 2. YTHDF2 在 GSC 中表达上调，对 GSC 的维持至关重要 作者为研究 m6A YTHDF 在胶质母细胞瘤中的功能作用，利用 CRIPR 技术检测了 YTHDF2 ，相对于对照 sgRNA，敲除 YTHDF2 会降低细胞活力及减少 GSCs 中细胞球形成。为研究了 YTHDF2 耗竭是否会诱导 GSC 分化，正交实验发现，shRNA 介导的 YTHDF2 敲低会降低 GSC 的活性，过表达的 YTHDF2 可以挽救 GSC 的活性。结果表明， YTHDF2 是胶质母细胞瘤维持的一个特异性和有效的调节因子。 3. YTHDF2 通过 m6A RNA 修饰支持 GSCs 中的基因表达 作者利用 RNA-seq 检测 YTHDF2 的下游靶点，敲除 YTHDF2 可引起 GSCs 中广泛基因表达的改变， MYC 靶点显著富集，而且，GSCs 中获得 m6A 峰的基因更频繁地下调。通过 qPCR 也验证了 YTHDF2 敲除对 MYC、VEGFA mRNA 水平降低的作用。为了预测 YTHDF2 在 GSCs 中的作用，作者结合 TCGA 胶质母细胞瘤基因表达数据，发现 YTHDF2 相关基因 MYC 和 E2F 靶点以及 G2M 调节因子和氧化磷酸化介质高度富集。这些数据表明 YTHDF2 作为与 m6A 差异修饰相关的转录程序的调节因子。 4. YTHDF2 通过保持 MYC 转录稳定发挥 GSC 特异性依赖作用 为了确定 YTHDF2 介导作用于 GSCs 中 MYC 的特异性，作者比较了在 NSCs 和 GSCs 之间 YTHDF2 缺失的影响。NSCs 中 YTHDF2 敲低并不影响 MYC mRNA 水平，但降低了 GSCs 中 MYC mRNA 水平。而且， YTHDF2 耗竭降低了GSC 的活性，而不影响 NSCs。因此， YTHDF2 代表了一种 GSC 特异性依赖，通过 MYC 基因的特异性稳定支持胶质母细胞瘤的生存。 5. IGFBP3 是 GSCs 中 YTHDF2-MYC 轴的下游靶点 因为 IGFBP3 是 YTHDF2 耗尽后最高下调基因之一，作者研究了 IGFBP3 是否调控 YTHDF2-MYC 轴下游的细胞活力。 IGFBP3 的缺失降低了 GSC 的活性和细胞球形成。 IGFBP3 过表达挽救了 GSCs 免于 YTHDF2 下调介导的细胞死亡。最后，作者利用20个胶质母细胞瘤和20个非肿瘤脑组织中 IGFBP3 的表达进行验证，观察到 GSC 中 IGFBP3 mRNA 表达升高。结果表明， IGFBP3 是 GSCs 中 YTHDF2-MYC 信号轴的关键下游效应子。 6. YTHDF2-MYC-IGFBP3 轴促进体内肿瘤生长 为了探讨在体内靶向 YTHDF2 治疗的潜在益处，作者利用 CRISPR 敲除技术对原位异种移植物的小鼠进行检测。结果表明，与携带对照 sgRNA 的 GSCs 的小鼠相比，敲除 YTHDF2 延长了肿瘤潜伏期并减少了肿瘤体积。 IGFBP3 过 表达恢复了 YTHDF2 缺失的 GSCs 体内成瘤能力。 研究结论 通过结合体外和体内的 GSCs 研究，该研究阐明了 m6A 介质在 GSCs 中的功能，并确定 YTHDF2 是 GSCs 特异性依赖，通过稳定 MYC 转录物调控 GSCs 中的葡萄糖代谢。这些发现为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。 2020年4月，上海交通大学医学院附属仁济医院洪洁团队在 Molecular Cancer 上发表了题为“m6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression”的研究论文。研究表明，靶向 METTL3 及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。 研究背景 结直肠癌 (CRC) 是全球第四大常见恶性肿瘤和第三大癌症死亡原因，而以乳酸作为糖酵解的最终产物，被认为是治疗癌症的一种有前途的方法。m6A 调控基因的改变在多种人类疾病的发病机制中起着重要的作用，但 m6A 修饰是否在 CRC 的葡萄糖代谢中起作用尚不清楚。 研究方法 研究结果 1. METTL3 与结直肠癌糖酵解密切相关 为了探讨结直肠癌（CRC）中 m6A 修饰与糖酵解代谢之间的相关性，作者对47例 CRC 患者进行 RT-PCR分析，CRC患者中FDG 摄取与 METTL3 表达之间存在最显着的相关性。进一步分析发现 CRC 患者中 FDG 摄取与 METTL3 免疫组化染色存在显著相关性。最后，作者利用 RNA-seq 比较 METTL 3 敲除和野生型(WT) HCT116 CRC 细胞的基因表达谱， METTL3 敲除细胞表现出更高的 METTL3 表达。这些结果表明 METTL3 可能介导 CRC 患者糖溶解代谢和癌变。 2. METTL3 在结直肠癌中促进糖酵解代谢 为了弄清 METTL3 的改变是否直接影响糖酵解代谢，研究发现敲除 METTL3 可显著降低 HCT116 和 SW480 细胞的胞外酸化速率(ECAR)水平，过表达 METTL3 显著提高了 DLD1 细胞的乳酸生成、葡萄糖吸收和 ECAR 水平。为了阐明 Mettl3 诱导的 CRC 糖酵解是否依赖于其甲基转移酶功能，作者通过 Mettl3 野生型和突变型的研究，发现 Mettl3 的 MTase 结构域的缺失阻断了 Mettl3 诱导的糖酵解过程。这些数据表明 Mettl3 通过其甲基转移酶结构域调控结直肠癌糖酵解代谢。 3. 在结直肠癌中， METLC3 诱导的增殖依赖于糖酵解的激活 METLC3 的敲除消除了 HCT116 细胞的细胞增殖和集落形成，并且降低了 HCT116 肿瘤的生长和异种移植小鼠模型中的肿瘤重量。在功能分析中， METTL3 的过表达增加细胞增殖、集落形成、肿瘤的生长和肿瘤的重量。2-DG（糖酵解途径的抑制剂）处理在体外和体内显着阻断了 METTL3 诱导的细胞增殖和菌落形成，这些结果表明 Mettl3 通过调控结直肠癌糖代谢促进 CRC 进展。 4. METTL3 在结直肠癌中的潜在靶点 为了鉴定 METTL 3 的潜在靶标，作者选择了 METTL3 敲除和 WT HCT116 细胞进行 MeRIP-seq和RNA-seq，最常见的motif ' GGAC '在 m6a 峰中显著富集，大部 分 METTL3 结合位点位于 CDS区，在 5'UTR 和 3'UTR 高度富集，并且 m6A在转录水平上发生了全局低甲基化。联合RNA-seq数据，确定了429个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被下调，595个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被上调。基于甲基化水平与 mRNA 表达水平都下降，找到与糖酵解密切相关的靶基因 HK2 和 SLC2A1(GLUT1) 。 6. HK2 和 SLC2A1 是 METTL3 在 CRC 中重要的功能靶基因 作者通过 HCT116 WT 和 mettl3 敲除细胞转染 control、 HK2 或 SLC2A1 过表达实验发现， HK2 或 SLC2A1 的异位表达部分恢复了敲除 mettl3 细胞的增殖、集落形成能力和肿瘤生长，而且，也能恢复 HCT116 mettl3 敲除细胞中乳酸产量的下降。同时，在体外和体内，过表达 SLC2A1 显著恢复了 HCT116 mettl3 敲除细胞葡萄糖摄取下降的趋势。因此， HK2 和 SLC2A1 介导了 CRC 细胞中 METLL3 的调节功能。 研究结论 METTL3 是 CRC 的一种功能性和临床致癌基因。 METTL3 通过 m6A- IGF2BP2/3— 依赖机制稳定 CRC 中 HK2 和 SLC2A1 的表达。靶向 METTL3 及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。 参考文献 [1] Dixit D, Prager B, GimpleShen R, et al. The RNA m6A reader YTHDF2 maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells[J]. Cancer Discovery, 2020. [2] Shen C, Xuan B, Yan T, et al. M6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression[J]. Molecular Cancer, 2020, 19(1).
可以通过谷歌学术输入参考文献，检索出文献后点击篇名下方的引号，打开参考文献框会有多种格式的参考文献，大部分文献能看到年、卷、期、页码（有的文献没有页码是文章编号）：
第一篇文献：
第二篇文献：
中文文献可以用百度学术输入参考文献检索，检索到文献后点击篇名打开文献，就链接到文献来源了，例如第四篇文献在维普数据库中，并查找到了出处：
在报馆方面，反正可以登载的材料不多，北平的广告又未必太多，多来它几个副刊，一面配合着这古城里看重读书人的传统，一面也可以镇静镇静
以甲基化对肿瘤发生为例，其对基因表达的调控如下： DNA甲基化水平和模式的改变是肿瘤发生的一个重要因素。这些变化包括CpG岛局部的高甲基化和基因组DNA低甲基化状态。 在正常细胞中，位于抑癌基因启动子区域的CpG岛处于低水平或未甲基化状态，此时抑癌基因处于正常的开放状态，抑癌基因不断表达抑制肿瘤的发生。而在肿瘤细胞中，该区域的CpG岛被高度甲基化，染色质构象发生改变，抑癌基因的表达被关闭，从而导致细胞进入细胞周期，凋亡丧失，DNA修复缺陷，血管生成以及细胞粘附功能缺失等，最终导致肿瘤发生。 同样，对于在正常细胞中处于高度甲基化的一些基因和重复序列，如果其甲基化水平降低，这些基因将表达和重复序列将激活，从而导致基因印记丢失，细胞过度增长，不合适的细胞特异性表达，基因组脆性增加，以及内寄生序列(endoparasitic sequence)激活，最终也导致肿瘤发生。
DNA甲基化发生于DNA的CpG island（CG序列密集区）。发生甲基化后，那段DNA就可以和甲基化DNA结合蛋白相结合。结合后DNA链发生高度的紧密排列，其他转录因子，RNA合成酶都无法再结合了，所以这段DNA的基因就无法得到表达了。
一般研究中所涉及的DNA甲基化主要是指发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，其产物称为5—甲基胞嘧啶（5—mC），是植物、动物等真核生物DNA甲基化的主要形式，也是发现的哺乳动物DNA甲基化的唯一形式。
由于Dnmtl和Dnmt3基因家族没有针对CpG二核苷酸序列的特异性，人们因此提出了DNA甲基化转移酶发现靶位点的机制。首先，甲基化转移酶并不是同等地接近所有染色体区域。
具有染色体重构和DNA螺旋酶活性的蛋白质能调节哺乳动物细胞内DNA甲基化，如SNF2家族2个成员ATRX和Lsh；其次，附件因子（蛋白质、RNA等）能召集DNA甲基化转移酶到特定基因组序列或染色体结构中，如pRB蛋白等能够与Dnmtl作用，在S期晚期将它召集到高度甲基化的异染色质区。
参考资料来源：百度百科-DNA甲基化
甲基叔丁基醚（MTBE）一般是以甲醇和异丁烯为原料，借助酸性催化剂合成，其中催化剂在工业上用得最多的是树脂催化剂。其中由于异丁烯的来源不同而形成了不同的合成路线。 异丁烯的来源： - 裂解制乙烯副产的C4馏分 -炼油厂催化裂化装置副产的C4馏分 - 以正丁烷为原料经异构化和脱氢制得 合成MTBE的催化剂： - 氢氟酸 - 硫酸 -苯乙烯系阳离子交换树脂 - 固体酸 -分子筛 相关文献：1 ZSM-5沸石酸性对合成甲基叔丁基醚的影响 (被引用 6 次)[期刊论文] 《石油学报(石油加工)》 ISTIC EI PKU -2002年6期胡津仙相宏伟李永红王俊杰李永旺采用磺酸+丙酮溶剂浸渍法对一组不同硅铝比(～)的ZSM-5沸石改质,得到不同酸性的ZSM-5沸石.利用NH3-TPD和Py-IR法分别考察改质前后的两种ZSM-5沸石的酸性,并对两种沸石制成的催化剂进行了合成MTBE反应的活性评价,...关键词：甲基叔丁基醚 ZSM-5 甲醇 异丁烯查看全文 - 下载全文 - 导出 - 引用通知 2 合成甲基叔丁基醚的沸石分子筛催化剂的研究 (被引用 13 次)[期刊论文] 《石油化工》 ISTIC PKU -2000年11期袁兴东李国辉周敬来关键词：查看全文 - 下载全文 - 导出 - 引用通知 3 合成甲基叔丁基醚沸石分子筛催化剂的研究 (被引用 3 次)[学位论文] 刘明， 2001 - 南开大学 南开大学：物理化学该论文针对甲醇和异丁烯合成甲基叔丁基醚(MTBE)的醚化反应,分别采用常压气相和带压液相固定床连续流动反应装置,从分子筛催化剂的制备源头,水热合成阶段出发,系统地考察了不同制备改性方法得到的ZSM-5和β沸石分子筛催化...关键词：ZSM-5分子筛 β分子筛 甲基叔丁基醚 酸催化反应 沸石分子筛催化剂查看全文 - 下载全文 - 导出 - 引用通知 4 12-钨磷酸催化合成甲基叔丁基醚 [期刊论文] 《燃料化学学报》 ISTIC EI PKU -2008年1期陈志敏李江CHEN Zhi-minLI Jiang甲基叔丁基醚(MTBE)作为汽油抗暴剂已经在全世界范围内普遍使用,它不仅能提高汽油辛烷值,而且还能改善汽车性能,降低排气中CO和有机物含量,同时降低汽油生产成本.关键词：12-钨磷酸 催化 合成 甲基叔丁基醚(MTBE)查看全文 - 下载全文 - 导出 - 引用通知 5 β沸石上合成甲基叔丁基醚反应动力学研究 (被引用 2 次)[期刊论文] 《天津大学学报(自然科学与工程技术版)》 ISTIC EI PKU -2001年6期王莅古玲李永红马忠龙陈洪钫水热改性β沸石为催化剂研究了甲醇和异丁烯醚化反应动力学,结合TPD技术探讨了反应机理.结果表明,反应物和产物在催化剂上的吸附均为中等强度的化学吸附;正反应对甲醇和异丁烯浓度分别是零和一级,逆反应对产物浓度是一级...关键词：动力学 甲基叔丁基醚 醚化反应查看全文 - 下载全文 - 导出 - 引用通知 6 甲基叔丁基醚合成催化剂的研究 [学位论文] 金仙玲， 2009 - 华东理工大学 华东理工大学：工业催化本文研究一种新型的用于甲醇和异丁烯合成甲基叔丁基醚的催化剂，该催化剂以氢型β分子筛(简称Hβ)为载体，用活性组分Y调节催化剂的催化活性，并用助剂X进一步修饰催化剂酸性。考察了活性组分和助剂的浸渍浓度、浸渍时间、焙烧...关键词：甲基叔丁基醚 分子筛 催化剂 催化活性 醚化反应 温吸脱附曲线导出 - 引用通知 7 β沸石上合成MTBE反应的本征动力学研究 (被引用 4 次)[期刊论文] 《石油学报（石油加工）》 ISTIC EI PKU -2000年6期李永红王莅李振花陈洪钫闵恩泽LI Yong-hongWANG LiLI Zhen-huaCHEN Hong-fangMIN En-ze采用序贯实验设计法研究了改性β沸石上液相合成甲基叔丁基醚反应的本征动力学,建立了反应的动力学模型,并以后验概率、相关指数和F方差指标为准则判别模型,得到了改性β沸石上合成甲基叔丁基醚反应的动力学方程.结果表明,...关键词：甲基叔丁基醚 动力学 β沸石查看全文 - 下载全文 - 导出 - 引用通知 8 悬浮催化蒸馏合成甲基丁醚的模拟 [期刊论文] 《化工学报》 ISTIC EI PKU -2008年4期王健常玉王二强李成岳WANG JianCHANG YuWANG ErqiangLI Chengyue建立了悬浮催化蒸馏合成甲基叔丁基醚过程的平衡级模型.利用模型模拟研究了特征参数,特别是固液分离器分率φ和塔底流量B对塔性能的影响.结果表明:参数φ对应的多重定态区域的上界非常小,在实际操作条件下,塔内仅存一个高...关键词：甲基叔丁基醚 悬浮催化蒸馏 数学模型 分岔分析 多重定态查看全文 - 下载全文 - 导出 - 引用通知 9 合成MTBE全流程仿真及膨胀床反应器动态模拟 [学位论文] 张昊， 2008 - 北京化工大学 北京化工大学：化学工程本文对甲基叔丁基醚合成装置的全流程仿真进行了研究，并重点对膨胀床反应器的动态模拟进行了研究，以了解膨胀床反应器操作特点和动态特性。 本文建立了甲基叔丁基醚合成过程中所涉及到的各种单元设备和反应器的数学模...关键词：甲基叔丁基醚 数学模型 动态模拟 膨胀床反应器查看全文 - 下载全文 - 导出 - 引用通知 10 ZSM-5沸石的制备及其对甲基叔丁基醚的吸附性能研究 [期刊论文] 《环境污染与防治》 ISTIC PKU -2008年6期林琼蔡伟民路佳徐芳Lin QiongCai WeiminLu JiaXu Fang采用无模板剂水热合成法和晶种诱导水热合成法成功制备了ZSM-5沸石.使用X射线衍射(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)和BET比表面积测试等手段对合成产物进行了表征,结果显示,两种ZSM-5沸石晶体粒径均在微米级,孔道均以～...关键词：ZSM-5沸石 无模板剂合成 晶种诱导合成 甲基叔丁基醚 吸附
MTBE的反应机理：甲基叔丁醚是以甲醇和混合碳四（含有异丁烯）为原料，在酸性催化剂的作用下合成的，这是一个可逆的放热反应。
MTBE的生产技术：合成MTBE生产工艺主要是醚化工艺，根据醚化反应器的而不同，MTBE合成技术存在以下几种形式：固定床反应技术:固定床技术采用的是下流式固定床反应器，在70到100℃液相，甲醇与异丁烯在强酸阳离子交换树脂的作用下，反应生成MTBE。
该技术采用外循环取热方式来控制，用冷却水在反应器外移走反应热，用分馏塔分离产物MTBE和甲醇以及剩余的碳四馏分。此法用于含异丁烯浓度变化较大的碳四原料。尽管反应器用水冷却，但仍会出现热点，难于消除，且反应速率低，这类技术在近年来已较少采用。
膨胀床反应技术:该技术的主反应器采用上流式膨胀床，在生产过程中，反应原料自下而上经膨胀床反应器催化剂床层。达到一定值后，催化剂床层便开始膨胀，由于催化剂床层受到轻微的扰动，有利于提高催化剂的活性，加快反应床层的传热过程，有利于反应的进行和反应热的扩散，使床层温度分布均匀，不存在局部热点。
此方法投资少，结构简单，催化剂装卸方便，但操作弹性较小。硫酸催化技术:该技术是将一定比例的原料送人第一反应器中，待反应混合物预热至70℃时，与硫酸混合，在一定温度下将混合物送入第二反应器中。
最后反应混合物进入分离器分离有机相和酸相，在分离器中回收得到的硫可循环使用，有机相则进入水洗塔，用NaOH含的循环水中和酸，生成Na2SO4和H2O。
凯瑞化工股份有限公司的MTBE工艺技术、选择性加氢、丁烯-1（工艺包）已成功应用于宁夏石化、沧州石化、神华包头煤化工、呼炼、中化MTBE项目、大庆石化12万吨MTBE等等.........
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表观遗传学，包括组蛋白共价修饰(covalent histone modification)、DNA甲基化修饰(DNA methylation)、RNA甲基化修饰(RNA methylation)、基因组印记(genomic imprinting)、基因沉默(gene silencing)、RNA编辑(RNA editing)及非编码RNA(noncoding RNA)等，是 指在核苷酸序列不发生改变的情况下，生物表型或基因表达发生了稳定的可遗传变化 。 RNA甲基化 作为表观遗传学研究的重要内容之一，是指发生在RNA分子上不同位置的甲基化修饰现象， 6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A) 和 5-甲基胞嘧啶(C5-methylcytidine，m5C) 是真核生物中最常见的两种RNA转录后修饰。RNA甲基化在调控基因表达、剪接、RNA编辑、RNA稳定性、控制mRNA寿命和降解等方面可能扮演重要角色。 相对于DNA甲基化，RNA甲基化更加复杂、种类繁多、普遍存在于各种高级生物中。已知绝大部分真核生物中，mRNA在5’ Cap处存在甲基化修饰，作用包括维持mRNA稳定性、 mRNA前体剪切、多腺苷酸化、 mRNA运输与翻译起始等。而3’ polyA发生的修饰有助于出核转运、翻译起始以及与polyA结合蛋白⼀起维持mRNA的结构稳定。但是这些修饰只发生mRNA的头部和尾部，关于RNA的内部修饰（internal modification）在许多种类的RNA中都有发⽣。无论是mRNA还是lncRNA，都大量存在m6A修饰。m6A能够加速mRNA前体的加工时间，加快mRNA在细胞中的转运速度和出核速度。主要学习研究较多的m6A。RNA的m6A甲基化⼀共有大三类酶参与： Writers、 Erasers和Readers ，需要相关研究的可以学习相关文献。 检测m6A的方法非常多，如包括MeRIPseq、 miCLIP-seq、 SCARLET、 LC-MS/MS等。2012年之后，两篇发表于Nature和Cell上的论⽂可以说是第⼀次从转录水平上，大范围高通量地鉴定了人和小鼠m6A的甲基化水平（Dominissini 2012和Meyer 2012）。这两篇独立发表的论文采用的 核心方法就是 将m6A抗体与带有m6A的mRNA片段相结合 后进行高通量测序 。通过对下机数据的分析，来鉴定mRNA上m6A程度较高的区域，分辨率约为100nt。这种方法我们称之为MeRIP-seq（ me thylated R NA i mmuno p recipitation sequencing）或m6A-seq。 MeRIP-seq建库步骤 ： 1. 提取total RNAs，并用Oligo-dT磁珠对total RNAs带有polyA的mRNA进行富集（通常要求Total RNA 300ug，人鼠可以做微量2ug 但结果可能会出现map率低dup率高 建库步骤与常量也有区别）； 2. 用磁珠进行富集，得到带有polyA的mRNA。之后加入片段化试剂，将完整的mRNA进行片段化。或者使用超声波仪直接进行片段化； 3. 将片段化后的RNA分成两份。⼀份加入带有m6A抗体的免疫磁珠，对含有m6A甲基化的mRNA片段进⾏富集。另⼀份作为control，直接构建类似常规的转录组测序文库（这一步就是IP步骤，片段化程度、抗体抓取效率都会影响到后期实验结果；这里的control通常称为Input）；4. 对m6A抗体免疫磁珠进行富集，带有m6A的mRNA片段进行回收后，按照转录组的建库流程构建常规的测序文库； 5. 分别将构建好的2个测序文库，即m6A-seq library和RNA-seq library分别进行高通量测序。测序平台保持一致，推荐Hiseq X ten或Novaseq； 6. 对下机数据进行生物信息学分析，对发生m6A甲基化程度较高的区域进行peak calling。由于不能做到单个碱基的分辨率，所以只能对大致的区域进行分析。从下图中我们可以发现，与右侧常规的转录组测序结果相比，在基因上有两处区域存在非常明显的高甲基化峰； 7.接下来会进行一些常规分析，如peak区域基因注释，差异peak分析。 以上就是关于m6A-seq的标准步骤，现在是不是对m6A-seq有了一个非常直观的认识呢？ 再次强调下，这种测序方法只能鉴定高甲基化的区域，并不能做到单碱基的分辨率。 思路1 老数据挖掘 第一步：先从原有的转录组数据中，挖掘到差异表达的甲基化酶； 第二步：对挖掘到的甲基化酶如METTL3或FTO等进⾏qPCR验证，并进行m6A-seq分析哪些基因甲基化水平发生改变； 第三步：在细胞（动物模型可选）中对这些酶进行敲低和过表达，进行常规的qPCR和WB检测相关酶表达情况，并用LC-MS/MS法检测RNA整体m6A水平； 第四步：继续对这些敲低和过表达的细胞进行转录组测序/小RNA测序或表达谱芯片/小RNA芯片，分析哪些基因出现差异表达变化和可变剪切变化； 第五步：找到甲基化酶调控的靶基因，进行敲低和过表达，看甲基化酶缺陷的细胞或动物模型表型能否补救； 第六步：在确定上一步靶基因确实受到甲基化酶调控后，对靶基因上的motif进行点突变后进行验证； 第七步：鉴定新型的甲基化酶（可选）。 思路2 研究甲基化修饰差异基因 第一步：直接进行m6A-seq和转录组测序，找到时间顺序或差异表达的基因并用qPCR、 WB等⽅法验证，此外找到m6A有差异的基因； 第二步：对甲基化酶进行敲低和过表达，检测RNA整体的m6A水平，之后可进行转录组或小RNA测序等方法检验甲基化酶敲低和过表达对mRNA或miRNA整体的影响，并着重研究第⼀步中感兴趣的m6A有差异的靶基因； 第三步：对靶基因进行敲低或过表达，是否能够对甲基化酶异常表达后的表型进⾏恢复； 第四步：对靶基因上motif进行点突变后进⼀步确认直接受到甲基化酶调控； 第五步：鉴定新型的甲基化酶（可选）。 当然根据不同的研究目的还有许多其他的研究思路，可根据自身实验设计进行延申和拓展。m6A相关SCI论文根据不同实验手段IF2~20不等，实验手段：m6A-seq、转录组测序/表达谱芯片、 LC-MS/MS 或 m6A 比色法、小RNA 测序/小RNA芯片、qPCR、 WB、敲降/过表达、靶基因验证、动物实验、临床实验/药物实验等。 学习资源来源网络，侵删。 参考学习： 1、 高通量RNA甲基化测序数据处理与分析研究进展 2、 RNA修饰检测技术 Roundtree, Ian A et al. “Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation.” Cell vol. 169,7 (2017): 1187-1200. doi: Helm, M, & Y. Motorin. "Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate.” Nature Reviews Genetics (2017):275.
m6A RNA甲基化是最常见、最丰富的真核生物mRNA转录后修饰。研究表明，m6A 在不同组织，细胞系中是一个复杂的调控网路，m6A RNA 甲基化参与 RNA 的代谢过程，并与肿瘤的发生和发展密切相关。本期着重解读两篇癌症中的 m6A 研究，看一下 m6A RNA 甲基化如何玩转高分期刊。 2020年10月，南京医科大学汪秀星课题组和美国 UCSD Jeremy Rich 等课题组在Cancer Discovery上发表题为“The RNA m6A reader YTHDF2 maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells”的研究论文。该研究为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。 研究背景 胶质母细胞瘤（GBM）代表了最常见的原发性，内在性脑肿瘤，患者的平均生存期限制在一年以上。鉴于胶质母细胞瘤干细胞（GSC）在治疗抗性，血管生成，免疫逃逸和侵袭中的作用，临床和临床前观察表明，靶向GSC可以改善肿瘤预后神经肿瘤学上的精准医学研究。 研究方法 研究结果 1. 在 GSC 中上调的致癌转录本以 RNA m6A 修饰为标志 作者利用 MeRIP-seq 对 GSC 和神经干细胞（NSC）进行 m6A 标记的检测，结果发现，与非肿瘤对应物相比，GSCs 的m6A 分布发生了改变。通过38个 GSCs 和5个 NSCs 的队列中的 RNA-seq 数据进行 GSEA 分析，具有 m6A 峰的基因在GSC 高度富集，而且在 GSC 中获得的具有 m6A 峰的基因均被上调。相反，相对于 NSC、GSC 中丢失 m6A 峰的基因通常在 GSC 中被下调。而且，在 GSC 中，与癌症干细胞相关的重要基因上获得了 m6A 峰，包括表达增加的 OLIG2 和 MYC 。 2. YTHDF2 在 GSC 中表达上调，对 GSC 的维持至关重要 作者为研究 m6A YTHDF 在胶质母细胞瘤中的功能作用，利用 CRIPR 技术检测了 YTHDF2 ，相对于对照 sgRNA，敲除 YTHDF2 会降低细胞活力及减少 GSCs 中细胞球形成。为研究了 YTHDF2 耗竭是否会诱导 GSC 分化，正交实验发现，shRNA 介导的 YTHDF2 敲低会降低 GSC 的活性，过表达的 YTHDF2 可以挽救 GSC 的活性。结果表明， YTHDF2 是胶质母细胞瘤维持的一个特异性和有效的调节因子。 3. YTHDF2 通过 m6A RNA 修饰支持 GSCs 中的基因表达 作者利用 RNA-seq 检测 YTHDF2 的下游靶点，敲除 YTHDF2 可引起 GSCs 中广泛基因表达的改变， MYC 靶点显著富集，而且，GSCs 中获得 m6A 峰的基因更频繁地下调。通过 qPCR 也验证了 YTHDF2 敲除对 MYC、VEGFA mRNA 水平降低的作用。为了预测 YTHDF2 在 GSCs 中的作用，作者结合 TCGA 胶质母细胞瘤基因表达数据，发现 YTHDF2 相关基因 MYC 和 E2F 靶点以及 G2M 调节因子和氧化磷酸化介质高度富集。这些数据表明 YTHDF2 作为与 m6A 差异修饰相关的转录程序的调节因子。 4. YTHDF2 通过保持 MYC 转录稳定发挥 GSC 特异性依赖作用 为了确定 YTHDF2 介导作用于 GSCs 中 MYC 的特异性，作者比较了在 NSCs 和 GSCs 之间 YTHDF2 缺失的影响。NSCs 中 YTHDF2 敲低并不影响 MYC mRNA 水平，但降低了 GSCs 中 MYC mRNA 水平。而且， YTHDF2 耗竭降低了GSC 的活性，而不影响 NSCs。因此， YTHDF2 代表了一种 GSC 特异性依赖，通过 MYC 基因的特异性稳定支持胶质母细胞瘤的生存。 5. IGFBP3 是 GSCs 中 YTHDF2-MYC 轴的下游靶点 因为 IGFBP3 是 YTHDF2 耗尽后最高下调基因之一，作者研究了 IGFBP3 是否调控 YTHDF2-MYC 轴下游的细胞活力。 IGFBP3 的缺失降低了 GSC 的活性和细胞球形成。 IGFBP3 过表达挽救了 GSCs 免于 YTHDF2 下调介导的细胞死亡。最后，作者利用20个胶质母细胞瘤和20个非肿瘤脑组织中 IGFBP3 的表达进行验证，观察到 GSC 中 IGFBP3 mRNA 表达升高。结果表明， IGFBP3 是 GSCs 中 YTHDF2-MYC 信号轴的关键下游效应子。 6. YTHDF2-MYC-IGFBP3 轴促进体内肿瘤生长 为了探讨在体内靶向 YTHDF2 治疗的潜在益处，作者利用 CRISPR 敲除技术对原位异种移植物的小鼠进行检测。结果表明，与携带对照 sgRNA 的 GSCs 的小鼠相比，敲除 YTHDF2 延长了肿瘤潜伏期并减少了肿瘤体积。 IGFBP3 过 表达恢复了 YTHDF2 缺失的 GSCs 体内成瘤能力。 研究结论 通过结合体外和体内的 GSCs 研究，该研究阐明了 m6A 介质在 GSCs 中的功能，并确定 YTHDF2 是 GSCs 特异性依赖，通过稳定 MYC 转录物调控 GSCs 中的葡萄糖代谢。这些发现为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。 2020年4月，上海交通大学医学院附属仁济医院洪洁团队在 Molecular Cancer 上发表了题为“m6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression”的研究论文。研究表明，靶向 METTL3 及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。 研究背景 结直肠癌 (CRC) 是全球第四大常见恶性肿瘤和第三大癌症死亡原因，而以乳酸作为糖酵解的最终产物，被认为是治疗癌症的一种有前途的方法。m6A 调控基因的改变在多种人类疾病的发病机制中起着重要的作用，但 m6A 修饰是否在 CRC 的葡萄糖代谢中起作用尚不清楚。 研究方法 研究结果 1. METTL3 与结直肠癌糖酵解密切相关 为了探讨结直肠癌（CRC）中 m6A 修饰与糖酵解代谢之间的相关性，作者对47例 CRC 患者进行 RT-PCR分析，CRC患者中FDG 摄取与 METTL3 表达之间存在最显着的相关性。进一步分析发现 CRC 患者中 FDG 摄取与 METTL3 免疫组化染色存在显著相关性。最后，作者利用 RNA-seq 比较 METTL 3 敲除和野生型(WT) HCT116 CRC 细胞的基因表达谱， METTL3 敲除细胞表现出更高的 METTL3 表达。这些结果表明 METTL3 可能介导 CRC 患者糖溶解代谢和癌变。 2. METTL3 在结直肠癌中促进糖酵解代谢 为了弄清 METTL3 的改变是否直接影响糖酵解代谢，研究发现敲除 METTL3 可显著降低 HCT116 和 SW480 细胞的胞外酸化速率(ECAR)水平，过表达 METTL3 显著提高了 DLD1 细胞的乳酸生成、葡萄糖吸收和 ECAR 水平。为了阐明 Mettl3 诱导的 CRC 糖酵解是否依赖于其甲基转移酶功能，作者通过 Mettl3 野生型和突变型的研究，发现 Mettl3 的 MTase 结构域的缺失阻断了 Mettl3 诱导的糖酵解过程。这些数据表明 Mettl3 通过其甲基转移酶结构域调控结直肠癌糖酵解代谢。 3. 在结直肠癌中， METLC3 诱导的增殖依赖于糖酵解的激活 METLC3 的敲除消除了 HCT116 细胞的细胞增殖和集落形成，并且降低了 HCT116 肿瘤的生长和异种移植小鼠模型中的肿瘤重量。在功能分析中， METTL3 的过表达增加细胞增殖、集落形成、肿瘤的生长和肿瘤的重量。2-DG（糖酵解途径的抑制剂）处理在体外和体内显着阻断了 METTL3 诱导的细胞增殖和菌落形成，这些结果表明 Mettl3 通过调控结直肠癌糖代谢促进 CRC 进展。 4. METTL3 在结直肠癌中的潜在靶点 为了鉴定 METTL 3 的潜在靶标，作者选择了 METTL3 敲除和 WT HCT116 细胞进行 MeRIP-seq和RNA-seq，最常见的motif ' GGAC '在 m6a 峰中显著富集，大部 分 METTL3 结合位点位于 CDS区，在 5'UTR 和 3'UTR 高度富集，并且 m6A在转录水平上发生了全局低甲基化。联合RNA-seq数据，确定了429个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被下调，595个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被上调。基于甲基化水平与 mRNA 表达水平都下降，找到与糖酵解密切相关的靶基因 HK2 和 SLC2A1(GLUT1) 。 6. HK2 和 SLC2A1 是 METTL3 在 CRC 中重要的功能靶基因 作者通过 HCT116 WT 和 mettl3 敲除细胞转染 control、 HK2 或 SLC2A1 过表达实验发现， HK2 或 SLC2A1 的异位表达部分恢复了敲除 mettl3 细胞的增殖、集落形成能力和肿瘤生长，而且，也能恢复 HCT116 mettl3 敲除细胞中乳酸产量的下降。同时，在体外和体内，过表达 SLC2A1 显著恢复了 HCT116 mettl3 敲除细胞葡萄糖摄取下降的趋势。因此， HK2 和 SLC2A1 介导了 CRC 细胞中 METLL3 的调节功能。 研究结论 METTL3 是 CRC 的一种功能性和临床致癌基因。 METTL3 通过 m6A- IGF2BP2/3— 依赖机制稳定 CRC 中 HK2 和 SLC2A1 的表达。靶向 METTL3 及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。 参考文献 [1] Dixit D, Prager B, GimpleShen R, et al. The RNA m6A reader YTHDF2 maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells[J]. Cancer Discovery, 2020. [2] Shen C, Xuan B, Yan T, et al. M6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression[J]. Molecular Cancer, 2020, 19(1).