甲基化研究进展论文提纲怎么写

表观遗传学，包括组蛋白共价修饰(covalent histone modification)、DNA甲基化修饰(DNA methylation)、RNA甲基化修饰(RNA methylation)、基因组印记(genomic imprinting)、基因沉默(gene silencing)、RNA编辑(RNA editing)及非编码RNA(noncoding RNA)等，是 指在核苷酸序列不发生改变的情况下，生物表型或基因表达发生了稳定的可遗传变化 。 RNA甲基化 作为表观遗传学研究的重要内容之一，是指发生在RNA分子上不同位置的甲基化修饰现象， 6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A) 和 5-甲基胞嘧啶(C5-methylcytidine，m5C) 是真核生物中最常见的两种RNA转录后修饰。RNA甲基化在调控基因表达、剪接、RNA编辑、RNA稳定性、控制mRNA寿命和降解等方面可能扮演重要角色。 相对于DNA甲基化，RNA甲基化更加复杂、种类繁多、普遍存在于各种高级生物中。已知绝大部分真核生物中，mRNA在5’ Cap处存在甲基化修饰，作用包括维持mRNA稳定性、 mRNA前体剪切、多腺苷酸化、 mRNA运输与翻译起始等。而3’ polyA发生的修饰有助于出核转运、翻译起始以及与polyA结合蛋白⼀起维持mRNA的结构稳定。但是这些修饰只发生mRNA的头部和尾部，关于RNA的内部修饰（internal modification）在许多种类的RNA中都有发⽣。无论是mRNA还是lncRNA，都大量存在m6A修饰。m6A能够加速mRNA前体的加工时间，加快mRNA在细胞中的转运速度和出核速度。主要学习研究较多的m6A。RNA的m6A甲基化⼀共有大三类酶参与： Writers、 Erasers和Readers ，需要相关研究的可以学习相关文献。 检测m6A的方法非常多，如包括MeRIPseq、 miCLIP-seq、 SCARLET、 LC-MS/MS等。2012年之后，两篇发表于Nature和Cell上的论⽂可以说是第⼀次从转录水平上，大范围高通量地鉴定了人和小鼠m6A的甲基化水平（Dominissini 2012和Meyer 2012）。这两篇独立发表的论文采用的 核心方法就是 将m6A抗体与带有m6A的mRNA片段相结合 后进行高通量测序 。通过对下机数据的分析，来鉴定mRNA上m6A程度较高的区域，分辨率约为100nt。这种方法我们称之为MeRIP-seq（ me thylated R NA i mmuno p recipitation sequencing）或m6A-seq。 MeRIP-seq建库步骤 ： 1. 提取total RNAs，并用Oligo-dT磁珠对total RNAs带有polyA的mRNA进行富集（通常要求Total RNA 300ug，人鼠可以做微量2ug 但结果可能会出现map率低dup率高 建库步骤与常量也有区别）； 2. 用磁珠进行富集，得到带有polyA的mRNA。之后加入片段化试剂，将完整的mRNA进行片段化。或者使用超声波仪直接进行片段化； 3. 将片段化后的RNA分成两份。⼀份加入带有m6A抗体的免疫磁珠，对含有m6A甲基化的mRNA片段进⾏富集。另⼀份作为control，直接构建类似常规的转录组测序文库（这一步就是IP步骤，片段化程度、抗体抓取效率都会影响到后期实验结果；这里的control通常称为Input）；4. 对m6A抗体免疫磁珠进行富集，带有m6A的mRNA片段进行回收后，按照转录组的建库流程构建常规的测序文库； 5. 分别将构建好的2个测序文库，即m6A-seq library和RNA-seq library分别进行高通量测序。测序平台保持一致，推荐Hiseq X ten或Novaseq； 6. 对下机数据进行生物信息学分析，对发生m6A甲基化程度较高的区域进行peak calling。由于不能做到单个碱基的分辨率，所以只能对大致的区域进行分析。从下图中我们可以发现，与右侧常规的转录组测序结果相比，在基因上有两处区域存在非常明显的高甲基化峰； 7.接下来会进行一些常规分析，如peak区域基因注释，差异peak分析。 以上就是关于m6A-seq的标准步骤，现在是不是对m6A-seq有了一个非常直观的认识呢？ 再次强调下，这种测序方法只能鉴定高甲基化的区域，并不能做到单碱基的分辨率。 思路1 老数据挖掘 第一步：先从原有的转录组数据中，挖掘到差异表达的甲基化酶； 第二步：对挖掘到的甲基化酶如METTL3或FTO等进⾏qPCR验证，并进行m6A-seq分析哪些基因甲基化水平发生改变； 第三步：在细胞（动物模型可选）中对这些酶进行敲低和过表达，进行常规的qPCR和WB检测相关酶表达情况，并用LC-MS/MS法检测RNA整体m6A水平； 第四步：继续对这些敲低和过表达的细胞进行转录组测序/小RNA测序或表达谱芯片/小RNA芯片，分析哪些基因出现差异表达变化和可变剪切变化； 第五步：找到甲基化酶调控的靶基因，进行敲低和过表达，看甲基化酶缺陷的细胞或动物模型表型能否补救； 第六步：在确定上一步靶基因确实受到甲基化酶调控后，对靶基因上的motif进行点突变后进行验证； 第七步：鉴定新型的甲基化酶（可选）。 思路2 研究甲基化修饰差异基因 第一步：直接进行m6A-seq和转录组测序，找到时间顺序或差异表达的基因并用qPCR、 WB等⽅法验证，此外找到m6A有差异的基因； 第二步：对甲基化酶进行敲低和过表达，检测RNA整体的m6A水平，之后可进行转录组或小RNA测序等方法检验甲基化酶敲低和过表达对mRNA或miRNA整体的影响，并着重研究第⼀步中感兴趣的m6A有差异的靶基因； 第三步：对靶基因进行敲低或过表达，是否能够对甲基化酶异常表达后的表型进⾏恢复； 第四步：对靶基因上motif进行点突变后进⼀步确认直接受到甲基化酶调控； 第五步：鉴定新型的甲基化酶（可选）。 当然根据不同的研究目的还有许多其他的研究思路，可根据自身实验设计进行延申和拓展。m6A相关SCI论文根据不同实验手段IF2~20不等，实验手段：m6A-seq、转录组测序/表达谱芯片、 LC-MS/MS 或 m6A 比色法、小RNA 测序/小RNA芯片、qPCR、 WB、敲降/过表达、靶基因验证、动物实验、临床实验/药物实验等。 学习资源来源网络，侵删。 参考学习： 1、 高通量RNA甲基化测序数据处理与分析研究进展 2、 RNA修饰检测技术 Roundtree, Ian A et al. “Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation.” Cell vol. 169,7 (2017): 1187-1200. doi: Helm, M, & Y. Motorin. "Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate.” Nature Reviews Genetics (2017):275.

m6A RNA甲基化是最常见、最丰富的真核生物mRNA转录后修饰。研究表明，m6A 在不同组织，细胞系中是一个复杂的调控网路，m6A RNA 甲基化参与 RNA 的代谢过程，并与肿瘤的发生和发展密切相关。本期着重解读两篇癌症中的 m6A 研究，看一下 m6A RNA 甲基化如何玩转高分期刊。 2020年10月，南京医科大学汪秀星课题组和美国 UCSD Jeremy Rich 等课题组在Cancer Discovery上发表题为“The RNA m6A reader YTHDF2  maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells”的研究论文。该研究为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。 研究背景 胶质母细胞瘤（GBM）代表了最常见的原发性，内在性脑肿瘤，患者的平均生存期限制在一年以上。鉴于胶质母细胞瘤干细胞（GSC）在治疗抗性，血管生成，免疫逃逸和侵袭中的作用，临床和临床前观察表明，靶向GSC可以改善肿瘤预后神经肿瘤学上的精准医学研究。 研究方法 研究结果 1. 在 GSC 中上调的致癌转录本以 RNA m6A 修饰为标志 作者利用 MeRIP-seq 对 GSC 和神经干细胞（NSC）进行 m6A 标记的检测，结果发现，与非肿瘤对应物相比，GSCs 的m6A 分布发生了改变。通过38个 GSCs 和5个 NSCs 的队列中的 RNA-seq 数据进行 GSEA 分析，具有 m6A 峰的基因在GSC 高度富集，而且在 GSC 中获得的具有 m6A 峰的基因均被上调。相反，相对于 NSC、GSC 中丢失 m6A 峰的基因通常在 GSC 中被下调。而且，在 GSC 中，与癌症干细胞相关的重要基因上获得了 m6A 峰，包括表达增加的 OLIG2  和 MYC 。 2.  YTHDF2  在 GSC 中表达上调，对 GSC 的维持至关重要 作者为研究 m6A YTHDF  在胶质母细胞瘤中的功能作用，利用 CRIPR 技术检测了 YTHDF2 ，相对于对照 sgRNA，敲除 YTHDF2  会降低细胞活力及减少 GSCs 中细胞球形成。为研究了 YTHDF2  耗竭是否会诱导 GSC 分化，正交实验发现，shRNA 介导的 YTHDF2  敲低会降低 GSC 的活性，过表达的 YTHDF2  可以挽救 GSC 的活性。结果表明， YTHDF2  是胶质母细胞瘤维持的一个特异性和有效的调节因子。 3.  YTHDF2  通过 m6A RNA 修饰支持 GSCs 中的基因表达 作者利用 RNA-seq 检测 YTHDF2  的下游靶点，敲除 YTHDF2  可引起 GSCs 中广泛基因表达的改变， MYC  靶点显著富集，而且，GSCs 中获得 m6A 峰的基因更频繁地下调。通过 qPCR 也验证了 YTHDF2  敲除对 MYC、VEGFA  mRNA 水平降低的作用。为了预测 YTHDF2  在 GSCs 中的作用，作者结合 TCGA 胶质母细胞瘤基因表达数据，发现 YTHDF2  相关基因 MYC  和 E2F  靶点以及 G2M  调节因子和氧化磷酸化介质高度富集。这些数据表明 YTHDF2  作为与 m6A 差异修饰相关的转录程序的调节因子。 4.  YTHDF2  通过保持  MYC  转录稳定发挥 GSC 特异性依赖作用 为了确定 YTHDF2  介导作用于 GSCs 中 MYC 的特异性，作者比较了在 NSCs 和 GSCs 之间 YTHDF2  缺失的影响。NSCs 中 YTHDF2  敲低并不影响 MYC mRNA 水平，但降低了 GSCs 中 MYC mRNA 水平。而且， YTHDF2  耗竭降低了GSC 的活性，而不影响 NSCs。因此， YTHDF2  代表了一种 GSC 特异性依赖，通过 MYC  基因的特异性稳定支持胶质母细胞瘤的生存。 5.  IGFBP3  是 GSCs 中  YTHDF2-MYC  轴的下游靶点 因为 IGFBP3  是 YTHDF2  耗尽后最高下调基因之一，作者研究了 IGFBP3  是否调控 YTHDF2-MYC  轴下游的细胞活力。 IGFBP3  的缺失降低了 GSC 的活性和细胞球形成。 IGFBP3  过表达挽救了 GSCs 免于 YTHDF2  下调介导的细胞死亡。最后，作者利用20个胶质母细胞瘤和20个非肿瘤脑组织中 IGFBP3  的表达进行验证，观察到 GSC 中 IGFBP3  mRNA 表达升高。结果表明， IGFBP3  是 GSCs 中 YTHDF2-MYC  信号轴的关键下游效应子。 6.  YTHDF2-MYC-IGFBP3  轴促进体内肿瘤生长 为了探讨在体内靶向 YTHDF2  治疗的潜在益处，作者利用 CRISPR 敲除技术对原位异种移植物的小鼠进行检测。结果表明，与携带对照 sgRNA 的 GSCs 的小鼠相比，敲除 YTHDF2  延长了肿瘤潜伏期并减少了肿瘤体积。 IGFBP3 过 表达恢复了 YTHDF2  缺失的 GSCs 体内成瘤能力。 研究结论 通过结合体外和体内的 GSCs 研究，该研究阐明了 m6A 介质在 GSCs 中的功能，并确定 YTHDF2  是 GSCs 特异性依赖，通过稳定 MYC  转录物调控 GSCs 中的葡萄糖代谢。这些发现为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。 2020年4月，上海交通大学医学院附属仁济医院洪洁团队在 Molecular Cancer 上发表了题为“m6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression”的研究论文。研究表明，靶向 METTL3  及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。 研究背景 结直肠癌 (CRC) 是全球第四大常见恶性肿瘤和第三大癌症死亡原因，而以乳酸作为糖酵解的最终产物，被认为是治疗癌症的一种有前途的方法。m6A 调控基因的改变在多种人类疾病的发病机制中起着重要的作用，但 m6A 修饰是否在 CRC 的葡萄糖代谢中起作用尚不清楚。 研究方法 研究结果 1.  METTL3 与结直肠癌糖酵解密切相关 为了探讨结直肠癌（CRC）中 m6A 修饰与糖酵解代谢之间的相关性，作者对47例 CRC 患者进行 RT-PCR分析，CRC患者中FDG 摄取与 METTL3  表达之间存在最显着的相关性。进一步分析发现 CRC 患者中 FDG 摄取与 METTL3  免疫组化染色存在显著相关性。最后，作者利用 RNA-seq 比较 METTL 3 敲除和野生型(WT) HCT116 CRC 细胞的基因表达谱， METTL3 敲除细胞表现出更高的 METTL3 表达。这些结果表明 METTL3  可能介导 CRC 患者糖溶解代谢和癌变。 2. METTL3  在结直肠癌中促进糖酵解代谢 为了弄清 METTL3  的改变是否直接影响糖酵解代谢，研究发现敲除 METTL3  可显著降低 HCT116 和 SW480 细胞的胞外酸化速率(ECAR)水平，过表达 METTL3 显著提高了 DLD1 细胞的乳酸生成、葡萄糖吸收和 ECAR  水平。为了阐明 Mettl3  诱导的 CRC 糖酵解是否依赖于其甲基转移酶功能，作者通过 Mettl3  野生型和突变型的研究，发现 Mettl3  的 MTase 结构域的缺失阻断了 Mettl3  诱导的糖酵解过程。这些数据表明 Mettl3 通过其甲基转移酶结构域调控结直肠癌糖酵解代谢。 3. 在结直肠癌中， METLC3  诱导的增殖依赖于糖酵解的激活 METLC3  的敲除消除了 HCT116 细胞的细胞增殖和集落形成，并且降低了 HCT116 肿瘤的生长和异种移植小鼠模型中的肿瘤重量。在功能分析中， METTL3  的过表达增加细胞增殖、集落形成、肿瘤的生长和肿瘤的重量。2-DG（糖酵解途径的抑制剂）处理在体外和体内显着阻断了 METTL3  诱导的细胞增殖和菌落形成，这些结果表明 Mettl3 通过调控结直肠癌糖代谢促进 CRC 进展。 4. METTL3  在结直肠癌中的潜在靶点 为了鉴定 METTL 3 的潜在靶标，作者选择了 METTL3  敲除和 WT HCT116 细胞进行 MeRIP-seq和RNA-seq，最常见的motif ' GGAC '在 m6a 峰中显著富集，大部 分 METTL3  结合位点位于 CDS区，在 5'UTR 和 3'UTR 高度富集，并且 m6A在转录水平上发生了全局低甲基化。联合RNA-seq数据，确定了429个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被下调，595个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被上调。基于甲基化水平与 mRNA 表达水平都下降，找到与糖酵解密切相关的靶基因 HK2  和 SLC2A1(GLUT1) 。 6.  HK2  和  SLC2A1  是  METTL3  在 CRC 中重要的功能靶基因 作者通过 HCT116 WT 和 mettl3  敲除细胞转染 control、 HK2  或 SLC2A1  过表达实验发现， HK2  或 SLC2A1  的异位表达部分恢复了敲除 mettl3  细胞的增殖、集落形成能力和肿瘤生长，而且，也能恢复 HCT116 mettl3  敲除细胞中乳酸产量的下降。同时，在体外和体内，过表达 SLC2A1  显著恢复了 HCT116 mettl3  敲除细胞葡萄糖摄取下降的趋势。因此， HK2  和 SLC2A1 介导了 CRC 细胞中 METLL3 的调节功能。 研究结论 METTL3  是 CRC 的一种功能性和临床致癌基因。 METTL3  通过 m6A- IGF2BP2/3— 依赖机制稳定 CRC 中 HK2  和 SLC2A1 的表达。靶向 METTL3  及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。 参考文献 [1] Dixit D, Prager B, GimpleShen R, et al. The RNA m6A reader YTHDF2  maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells[J]. Cancer Discovery, 2020. [2] Shen C, Xuan B, Yan T, et al. M6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression[J]. Molecular Cancer, 2020, 19(1).