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1998 年底美国科学促进会将基因芯片技术列为 1998 年度自然科学领域十大进展之一，足见其在科学史上的意义。现在，基因芯片这一时代的宠儿已被应用到生物科学众多的领域之中。它以其可同时、快速、准确地分析数以千计基因组信息的本领而显示出了巨大的威力。这些应用主要包括基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。在基因表达检测的研究上人们已比较成功地对多种生物包括拟南芥（ Arabidopsis thaliana ）、酵母(Saccharomyces cerevisiae)及人的基因组表达情况进行了研究，并且用该技术（共 157,112 个探针分子）一次性检测了酵母几种不同株间数千个基因表达谱的差异 。实践证明基因芯片技术也可用于核酸突变的检测及基因组多态性的分析，例如对人 BRCA Ⅰ基因外显子11、 CFTR 基因 、β - 地中海贫血 、酵母突变菌株间 、 HIV-1 逆转录酶及蛋白酶基因（与 Sanger 测序结果一致性达到 98% ） 等的突变检测，对人类基因组单核苷酸多态性的鉴定、作图和分型 ，人线粒体 16.6kb 基因组多态性的研究 [24] 等。将生物传感器与芯片技术相结合，通过改变探针阵列区域的电场强度已经证明可以检测到基因（ ras 等）的单碱基突变 。此外，有人还曾通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图。杂交测序是基因芯片技术的另一重要应用。该测序技术理论上不失为一种高效可行的测序方法，但需通过大量重叠序列探针与目的分子的杂交方可推导出目的核酸分子的序列，所以需要制作大量的探针。基因芯片技术可以比较容易地合成并固定大量核酸分子，所以它的问世无疑为杂交测序提供了实施的可能性，这已为实践所证实。在实际应用方面，生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防、航天等许多领域。它将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径，为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。 由于所有药物（或兽药）都是直接或间接地通过修饰、改变人类（或相关动物）基因的表达及表达产物的功能而生效，而芯片技术具有高通量、大规模、平行性地分析基因表达或蛋白质状况（蛋白质芯片）的能力，在药物筛选方面具有巨大的优势。用芯片作大规模的筛选研究可以省略大量的动物试验甚至临床，缩短药物筛选所用时间，提高效率，降低风险。随着人类基因图谱的绘就，基因工程药物将进入一个大发展时期，在基因工程药物的研制和生产中，生物芯片也有着较大的市场。以基因工程胰岛素为例，当我们把人的胰岛素基因转移到大肠杆菌细胞后，我们就需要用某种方法对工程菌的基因型进行分析，以便确证胰岛素基因是否转移成功。过去人们采取的方法叫做“限制性片段长度多态性”（简称RELP），这种方法非常地烦琐复杂，在成本和效率方面都不如基因芯片，今后被芯片技术取代是必然的趋势。通过使用基因芯片筛选药物具有的巨大优势决定它将成为本世纪药物研究的趋势。 包括基因表达检测、寻找新基因、杂交测序、基因突变和多态性分析以及基因文库作图以及等方面。1、基因表达检测。人类基因组编码大约10万个不同的基因，仅掌握基因序列信息资料，要理解其基因功能是远远不够的，因此，具有监测大量mRNA（信使RNA，可简单理解为基因表达的中介物）的实验工具很重要。有关对芯片技术检测基因表达及其敏感性、特异性进行的研究实验表明芯片技术易于监测非常大量的mRNAs并能敏感地反映基因表达中的微小变化。利用基因芯片技术人们已比较成功地对多种生物包括拟南芥、酵母及人的基因组表达情况进行了研究，并且用该技术（共157,112个探针分子）一次性检测了酵母几种不同株间数千个基因表达谱的差异。2、寻找新基因。有关实验表明在缺乏任何序列信息的条件下，基因芯片也可用于基因发现，如HME基因和黑色素瘤生长刺激因子就是通过基因芯片技术发现的。3、DNA测序。人类基因组计划的实施促进了更高效率的、能够自动化操作的测序方法的发展，芯片技术中杂交测序技术及邻堆杂交技术即是一种新的高效快速测序方法。如使用美国Affymetrix公司1998年生产出的带有13.5万个基因探针的芯片就可以使人类DNA解码速度提高了25倍。4、核酸突变的检测及基因组多态性的分析。有关实验结果已经表明DNA芯片技术可快速、准确地研究大量患者样品中特定基因所有可能的杂合变异。对人类基因组单核苷酸多态性的鉴定、作图和分型，人线粒体16.6kb基因组多态性的研究等。随着遗传病与癌症相关基因发现数量的增加，变异与多态性分析必将越来越重要。
现在，生物技术的发展更是突飞猛进，这必将促成生物检测方法的不断补充和完善。 下面是我为大家整理的食品生物技术论文，希望你们喜欢。
食品检测中的生物技术分析
摘要：近年来，食品安全问题得到了全社会的关注，食品检测技术得到了更多的重视，生物技术等新兴的食品检测技术也因此而得到了广泛的应用。文章在简要介绍生物技术的基础上，详细阐述了生物技术在食品检测中的应用，以期为生物技术的发展与应用提供新的思路。
关键词：食品检测生物技术应用
食品安全问题是由于食品中含有毒、有害物质，对人体健康产生危害而造成的公共卫生问题。近年来，食品安全问题已成为人们普遍关注的社会热点问题，引起了政府和公众的广泛重视。目前，国内的食品安全问题的产生既有政府监管不严、制度体系不完全的原因，也有食品检测技术不够科学先进的原因。随着食品工业的快速发展，对食品检测技术提出了更高的要求，传统分析方法难以满足当前食品检测的需要，灵敏度高、特异性强、简便快捷的生物技术逐渐在食品检测领域大放异彩，文章将对此进行详细论述。
一、生物技术概述
生物技术是利用生物有机体及其组成部分，或是利用其组织、细胞、酶来合成、转化、降解，从而实现生产产品等目的的技术。生物技术在食品领域的应用已经有几百年的历史，从最初的面包、酱油生产，如今已延伸到食品领域的各个方面，得到了长足的发展和不断的完善。现代生物技术是建立在细胞生物学等学科基础之上的高科技技术，包括细胞工程、酶工程、基因工程、发酵工程等诸多类技术。细胞工程是以动物、植物细胞及细胞融合技术为基础的一类生物技术，主要用于食品生产;酶工程是通过特定细胞酶来控制食品生产过程中的物质转化;基因工程是通过重组基因来改造食品生物特性，起到生产特殊产品的作用;食品发酵技术如今已发展为发酵工程学，用于预定食品及成分的生产。
二、生物技术在食品检测中的应用
生物技术在食品检测中的应用，表现在食品中微生物、转基因成分等对人体有毒有害物质的检测。例如借助细菌学、血清学方法可以检测食品中是否含有致病菌，但是这些传统生物技术方法操作繁琐，耗时较长，目前应用更多的是操作简便、快捷且精准的生物芯片、胶体金免疫层技术、PCR技术、酶联免疫吸附法、基因探针等生物技术。
1.生物芯片的应用
生物芯片技术是建立在现代生物化学、物理化学、计算机科学等诸多学科交叉的基础上的，检测原理是利用生物分子间的抗原、抗体等亲和反应或碱基对互补杂交，检测、分析样品中的成分。由于生物芯片技术可在小面积内对多种生物分子进行并行检测分析，分析量很大，因而检测效率较高，检测结果具有很好的可比性。
生物芯片包括基因芯片和蛋白质芯片。基因芯片是将基因探针固化在检测工具表面，利用软件分析检测工具与样品间发生的基因杂交信息，从而检测出遗传信息。基因芯片可同时进行定性定量检测，能够快速检测分析大量序列的杂交信息。蛋白质芯片的原理则是利用生物分子间的特异性结合来测定样品成分，具体操作与基因芯片技术类似。基于基因芯片和蛋白质芯片的原理及特点，生物芯片技术通常用于转基因食品、原料、病原微生物的检测。
2.胶体金免疫层技术的应用
一直以来，胶体金免疫层技术在医学领域得到了广泛的应用，近年来逐渐应用于食品检测领域。胶体金免疫层技术具有操作简单、耗时较短等优势，一般需要定性分析或半定量分析，主要用于有害微生物、药物残留、违禁药物的检测。该技术用于有害微生物的检测较多，例如检测食品中是否含有大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌等致病菌，较为常见的检测方法是双抗体夹心法;用于药物残留的检测是通过制得的抗体抗原与药物残留反应来分析食品中是否含有黄曲霉毒素、磺胺类药物、氯霉素等残留;用于违禁药物的检测一般是利用竞争免疫层析法来分析食品中是否含有罂粟碱、吗啡等物质。目前国内应用胶体金免疫层技术仍处于初级阶段，尚未投入广泛的应用，还有待新型免疫层析产品的开发、研制。
3.PCR技术的应用
PCR技术是上世纪八十年代产生的一种技术，借助体外扩增DNA来实现转基因食品以及病原微生物的检测。传统PCR技术早于1992年便用于病原菌的检测，但直到近年来才得到广泛应用，目前可用于检测沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。但在实际应用中，传统技术存在一些缺陷，无法定量检测，而且存在死细菌的环境下检测结果不准确，难以检测微生物毒素，因此在传统技术的基础上经过一系列改进和技术融合产生了多种改进的PCR技术，包括实时定量的PCR技术、PCR―DGGE技术、巢式及半巢式PCR技术等。定时定量的PCR技术是在传统技术中加荧光基团来实现实时检测，能够做定量分析，主要应用于检测外源基因污染、病原微生物、掺假量等，例如检测葡萄中的曲霉菌、肉骨粉中的牛羊源成分。PCR―DGGE技术在传统PCR技术基础上结合变性梯度凝胶电泳技术，不仅特异性强，而且敏感度高。巢式及半巢式PCR技术通过设计两对或1对半引物来降低假阳性结果的产生，使检测下限大幅度下降，检测结果通常无需其他方法再验证。
4.酶联免疫吸附法的应用
酶联免疫吸附法是利用免疫或酶促反应来进行食品检测，具有操作简便、特异性强、耗时短、灵活、可批量检测的优势。酶联免疫吸附法用于有毒有害物质的检测比常规培养法耗时少三至四天，而且无需特殊设备支持，结果易于观察辨别，样品易于保存，例如有研究用该法检测牛奶中的沙门氏菌敏感性100%、特异性99.7%，检测时间不超过3天，因而广泛应用在黄曲霉毒素等毒素检测、残留药物检测、过敏原检测、生理活性物质检测、转基因食品检测等领域。
5.DNA探针技术的应用
DNA探针技术利用碱基对结合原理制成DNA探针，能够检测样品中的碱基序列，从而判定样品基因序列。由于该技术操作简便，而且检测结果精确度高，应用十分广泛，通常用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等检测。DNA探针技术主要有异相杂交和同相杂交两种技术，其关键在于针对检测目标构建相应的DNA探针，只有DNA探针的基因序列具有针对性和特异性，方能取得理想的检测结果。
三、结语
近年来，随着生物技术的发展和进步，其在食品安全领域发挥了越来越重要的作用，在食品检测的各个方面得到了广泛的应用。然而虽然生物技术普遍具有成本低、操作简便、效率高、特异性高等优势，但是在实际应用中各种生物检测技术均存在自身的局限性，需要结合实际需要灵活选择、搭配。为了更好的提高食品检测水平，解决食品安全问题，还需要开发新的生物检测技术和方法，对现有技术方法不断进行优化，这需要相关领域的专家学者持续不懈的努力
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偏振光（ polarized light ），光学名词。光是一种电磁波，电磁波是横波。而振动方向和光波前进方向构成的平面叫做振动面，光的振动面只限于某一固定方向的，叫做平面偏振光或线偏振光。应用汽车车灯汽车夜间在公路上行驶与对面的车辆相遇时，为了避免双方车灯的眩目，司机都关闭大灯，只开小灯，放慢车速，以免发生车祸。如驾驶室的前窗玻璃和车灯的玻璃罩都装有偏振片，而且规定它们的偏振化方向都沿同一方向并与水平面成45度角，那么，司机从前窗只能看到自已的车灯发出的光，而看不到对面车灯的光，这样，汽车在夜间行驶时，既不要熄灯，也不要减速，可以保证安全行车。摄像机镜头自然光在玻璃、水面、木质桌面等表面反射时，反射光和折射光都是偏振光，而且入射角变化时，偏振的程度也有变化。在拍摄表面光滑的物体，如玻璃器皿、水面、陈列橱柜、油漆表面、塑料表面等，常常会出现耀斑或反光，这是由于反射光波的干扰而引起的。如果在拍摄时加用偏振镜，并适当地旋转偏振镜片，让它的透振方向与反射光的透振方向垂直，就可以减弱反射光而使水下或玻璃后的影像清晰。LCD液晶屏LCD技术是把液晶灌入两个列有细槽的平面之间。这两个平面上的槽互相垂直（相交成90度）。也就是说，若一个平面上的分子南北向排列，则另一平面上的分子东西向排列，而位于两个平面之间的分子被强迫进入一种90度扭转的状态。由于光线顺着分子的排列方向传播，所以光线经过液晶时也被扭转90度。但当液晶上加一个电压时，分子便会重新垂直排列，使光线能直射出去，而不发生任何扭转。LCD是依赖极化滤光器（片）和光线本身。自然光线是朝四面八方随机发散的。极化滤光器实际是一系列越来越细的平行线。这些线形成一张网，阻断不与这些线平行的所有光线。极化滤光器的线正好与第一个垂直，所以能完全阻断那些已经极化的光线。只有两个滤光器的线完全平行，或者光线本身已扭转到与第二个极化滤光器相匹配，光线才得以穿透。
荧光偏振法快速、准确、高通量检测IgG和含Fc段衍生物 Dr. Carolanne Doherty Valitacell, NIBRT, Fosters Avenue, Blackrock, Dublin, Ireland BMG多功能酶标仪可应用于定量IgG的新技术Valita™TITER 采用荧光偏振法直接在细胞培养上清液中检测IgG 酶标仪预设检测程序和数据分析模板提高研究速度 简介 准确、快速和高通量检测IgG对于大多数治疗性抗体的开发和生产来说是必不可少的。单克隆抗体正在生物药物领域大显身手，大量的样本正等待着进行筛选以进一步得到开发。这里我们介绍一种在细胞培养上清中直接定量IgG的全新的筛选技术：Valita™TITER。 现有的技术，包括蛋白A高效液相色谱（HPLC protein A）、ELISA技术、 蛋白A表面干涉法以及HTRF（均相时间分辨荧光）都具有明显的缺点，包括价格昂贵、耗力以及耗时。 Valita™TITER方法是一种全新的非常精确、低成本的检测IgG的方案，检测范围在2.5-80mg/L。Valita™TITER采用荧光偏振技术检测IgG的Fc段与蛋白G的结合（图1）。分析在96孔板中进行，操作简单、高通量、快速且可自动化完成。分析可以在很少量的细胞培养基中进行且没有繁琐的准备过程。 在这个应用指引中，我们介绍了在PHERAstar®，POLARstar® Omega以及CLARIOstar®多功能酶标仪上使用Valita™TITER试剂盒定量检测IgG的方案。荧光偏振可以有效地分析分子大小的改变。“不动”的荧光基团在偏振光的激发下会发出与激发光相同偏振方向的荧光。然而，转动的荧光基团的荧光偏振方向与激发光偏振方向相比会有一定的改变。在溶液中小分子比大分子转动更快，因此，连接有荧光基团的分子大小的改变，可以通过荧光去偏振程度的大小来进行测定。所以，当标记有荧光的蛋白G在没有结合其它分子时，其转动快，去偏振更多，而结合了IgG则相反（大5倍）（图2）。这种偏振的改变应用于检测溶液中的IgG。荧光偏振（FP）通过用平行偏振方向的激发光照射溶液并在平行方向和垂直方向上测定发射荧光。FP就是这两个偏振荧光的归一化后的差别，通常用mP表示。 材料和方法 Valita™TITER分析试剂盒 Valita™TITER APP软件（试剂盒里提供） IgG标准品（从人血清中获得IgG） PHERAstar, POLARstar Omega和CLARIOstar多功能酶标仪 (BMG LABTECH) 实验过程 样品的准备遵照试剂盒说明书的相应要求。标准曲线的绘制采用每个相对荧光值对应一个IgG标准品的方法。在Valta™TITER微孔板的每个孔中加入60µl重建缓冲液以及60µl标准品或样品。混匀后避光孵育30分钟。然后在POLARstar Omega、PHERAstar或CLARIOstar多功能酶标仪（BMG LABTECH公司）中，采用预置的检测程序进行读数（参数的设定详见下表）。在MARS分析软件中将获得的Raw Data转化成.csv格式文件，再用Valita™APP软件进行分析。 仪器设定结果与讨论 图3的标准曲线（2.5-80mg/L）是在BMG LABTECH公司具有荧光偏振检测功能的多功能酶标仪（POLARstar Omega、CLARIOstar和PHERAstar）上用Valita™TITER试剂盒绘制的。所有酶标仪所获得的结果都具备很高的稳定性。最后，我们用不同条件培养的样品，用Valita™TITER定量IgG的结果与用常规方法HPLC的结果进行对比。图4显示两种方法测定结果的相关性，显示两种定量方法都有很好的准确性，而Valita™TITER分析速度更快因其不需要繁琐的样本准备过程。结论 在研发和生产此类生物药物中对混合样本进行快速IgG浓度测定非常重要。这里我们介绍了一种基于荧光偏振法的快速、简单的进行高通量IgG和Fc段衍生物测定全新技术——Valita™TITER分析法。Valita™TITER分析法可以直接对待测样本中的IgG进行定量测定而无需繁琐的样本准备或纯化过程。CLARIOstar， PHERAstar和POLARstar Omega应用于Valita™TITER分析时现实出卓越的性能。与其它IgG的定量方便相比，Valita™TITER具有高通量、简单、准确、快速的特点。 推荐阅读 >> BMG酶标仪，世界第一台实现自动离体的缺氧、缺血再灌注 >> Cell Reports：缺氧，让T细胞抗癌功能更强大 >> MetaCell-TM在海德堡EMBL研讨会上隆重介绍细胞代谢金标准检测平台 >> 经久耐用， BMG酶标仪经得起数十年的考验 >> 德国BMG多功能酶标仪客户评价 >> BMG在线公开课视频：细胞代谢之胞内氧浓度实时检测 >> 细胞能量代谢三“简”主义：细胞内氧含量实时监测解决方案 >> 英国Sygnature Discovery采用德国BMG PHERAstar FSX进行高端药物研发 >> Nature Methods亮点推荐细胞代谢胞内氧检测技术 >> BMG PHERAstar FSX 高通量超灵敏HTS多功能酶标仪入选Selectscience杂志 2016最佳药物研发产品十强 想了解更多BMG多功能酶标仪的应用，在伯齐官方公众号（微信号：Bio-Gene）输入BMG酶标仪相关的关键词（不用输入序号）：1、细胞代谢；2、钙流；3、朊病毒；4、HTS； 5、FRET和BRET；6、BMG；7、BMG操作; 8、蛋白聚集 香港伯齐科技有限公司 Bio-Gene Technology Ltd. 广州伯齐生物科技有限公司 香港 北京 上海 广州 成都 武汉 济南
物理课本上都有概念的吧,偏振光就是震动方向一致的光,偏振面就是和光的震动方向垂直的面
20世纪后期,生物工程迅速发展,给人类生活带来了巨大的变化。有人说,生物工程给人类带来了更大的希望,也有人说,它也会相应给人类带来灾难。学者们众说纷纭,褒贬不一。其中,植物转基因工程更是如此。植物转基因工程就是指通过基因枪等基因工程手段,将一种或几种外源基因转移到原本不具有这些基因的植物体内,并使之有效表达,产生相应性状,这种具有相应性状的植物称之为转基因植物。1983年,第一例转基因植物———转基因烟草问世。从此,转基因植物的研究就以惊人的速度发展,人类看到了更大的希望。1986年,抗虫和抗除草剂的转基因棉花首次进入田间实验,此后转基因植物在全球范围内飞速发展,种植面积不断扩大,给人类带来了非常明显的经济效益。在这同时,人类也注意到了它可能潜在着的一系列危害,即可能对环境产生不利影响,影响到生物多样性的保护和持续利用,并且对人类健康也可能有潜在的危害。1转基因植物的利用植物转基因工程的目的旨在通过导入有用的外源基因,获得转基因植物,用于植物的改良和有效成分的生产。目前在抗除草剂、抗虫、抗病、控制果实成熟以及植物生物反应器等方面已获得了一系列令人鼓舞的成果。1.1抗除草剂的转基因植物化学除草剂在现代农业中起着十分重要的作用,理想的除草剂必须具有高效、广谱的杀草能力,而对作物及人畜无害。但这样的除草剂成本越来越高,通过转基因技术,在作物中导入抗除草剂基因,获得抗除草剂作物,就能有效地解决这些问题,提高经济效益,使除草剂的应用更加方便。据报道,现已成功地获得了转aro A基因的番茄、油菜、大豆、杨树等,在田间试验中表现出对除草剂的良好抗性。1.2抗虫的转基因植物虫害对农业生产的危害非常严重,如能在植物体内转入抗虫基因,使植物获得抗虫性,增加对虫害的抵抗力,将对农业生产具有重要意义。基于这个目的,人们现已成功地将苏云金芽孢杆菌(Bacillusthurigiensis)的B.t毒蛋白基因转入了烟草、番茄、马铃薯、甘蓝、棉花、杨树等植物,使这些植物获得了抗虫性。1.3抗病的转基因植物据报道,将烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯X和Y病毒(PVX和PVY)、大豆花叶病毒(SMV)、苜蓿花叶病毒(AIMV)等病毒的外壳蛋白基因导入不同的植物体后,这些植物均获得了对相应病毒的抗性,这有望应用于农业生产。1.4抗逆的转基因植物68小分子化合物(如脯氨酸、甜菜碱、葡萄糖等)与植物忍受环境渗透胁迫的能力有关,人们若能将与脯氨酸或甜菜碱等合成有关的酶的基因克隆后转入植物,有望提高植物对干旱和盐碱等逆境的抗性。有报道说,人们现已成功地将相关基因转入了烟草、苜蓿、马铃薯等植物,使它们获得了对不同逆境的抗性。1.5植物生物反应器生产药物蛋白生物反应器(bioreactor)是指利用生物系统大规模生产有重要商业价值的外源蛋白质,用于医疗保健和科学研究。将不同的基因转入植物,可使转基因植物产生植物抗体、口服疫苗、植物药物和人类蛋白质等。据报道,到目前为止,人们已成功地获得了4种具有潜在医疗价值的植物抗体。2转基因植物存在的潜在风险2.1转基因作物对生态环境的潜在风险在耕地上栽种那些实验室里培育出来的转基因植物可能会对生态环境造成许多负面影响,转基因植物对非目标生物可能造成危害,转基因植物通过基因漂变对其它物种也可能产生有害影响。2.2对人类健康的潜在危害转基因食品里的新基因可能对消费者造成健康威胁,因为转基因植物是在传统植物接受了动物、植物、微生物的基因的基础上形成的,所以很可能对人类健康产生影响。人们正在关注这样一些问题:毒性问题、过敏反应问题、对抗生素的抵抗作用问题、营养问题等。3展望20世纪末生物技术取得了突飞猛进的发展,其涉及面之广、进展之快乃前所未有。从1986年美国批准第一个转基因作物进行大田试验,至1999年4月,已有4987个转基因作物被批准进行大田试验。自1994年至1999年五年间转基因农作物的种植面积增加了23倍多。美国的转基因抗虫棉花的种植面积已占其棉花总种植面积的13%。从发展趋势看,转基因植物将向多元化发展,例如品质改良、高产、抗逆(抗旱、抗寒、抗低光照、耐盐碱、耐瘠薄等)的基因工程发展。随着转基因技术的深入发展,人们也将把转基因植物应用到医药化工领域,建立基因工厂,从而利用转基因植物生产各种化工原料和药品,摆脱传统化工厂对日益短缺的化工原料的依赖和生产过程中对环境的严重污染。在21世纪,科学技术更加透明,更加公平,人们需要更多、更大的知情权,所以,国际社会对这个问题给予了极大关注,各国政府也高度重视。争论本身就是推动社会前进的动力。通过争论,弄清是非,避免破坏性后果的发生,这将推动科学技术沿着健康的道路发展前进。任何科学技术都不应该滥用,但也不能扼杀能给人类和社会创造巨大财富的技术成果。在应用植物转基因工程技术中,人类应该像对待其它科学技术一样,扬长避短,全面、理性地看问题,把握尺度,使植物转基因工程更加健康地发展,造福全人类。
Synthesis of optically pure ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoateby Escherichia coli transformant cells coexpressingthe carbonyl reductase and glucose dehydrogenase genes由共表达碳酰还原酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌转化细胞合成纯光学（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯Abstract The asymmetric reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate (COBE) to ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate((S)-CHBE) was investigated. Escherichia coli cells expressing both the carbonyl reductase (S1) gene from Candida magnoliae and the glucose dehydrogenase (GDH) gene from Bacillus megaterium were used as thecatalyst. In an organic-solvent-water two-phase system,(S)-CHBE formed in the organic phase amounted to 2.58 M (430 g/l), the molar yield being 85%. E. coli transformant cells coproducing S1 and GDH accumulated 1.25 M (208 g/l) (S)-CHBE in an aqueous monophase system by continuously feeding on COBE, which is unstable in an aqueous solution. In this case, the calculated turnover of NADP+ (the oxidized form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) to CHBE was 21,600 mol/mol. The optical purity of the (S)-CHBE formed was 100% enantiomeric excess in both systems. The aqueous system used for the reduction reaction involving E. coli HB101 cells carrying a plasmid containing the S1 and GDH genes as a catalyst is simple. Furthermore, the system does not require the addition of commercially available GDH or an organic solvent. Therefore this system is highly advantageous for the practical synthesis of optically pure (S)-CHBE.本本篇文献研究了利用COBE不对称合成（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（CHBE）。大肠杆菌细胞作为催化剂同时表达了来自念珠菌属magnoliae的碳酰还原酶和来自巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因。在水/有机溶剂两相体系中，(S)-CHBE在有机相中的浓度可以达到2.58M（430g/l），摩尔产率达到85%。大肠杆菌的副产物S1和GDH也达到了1.25M（208g/l），COBE在水相中不稳定，所以(S)-CHBE可以在水单相中不停的生成。在这种情况下，适当的从NADP+到CHBE的转变达到了21,600 mol/mol。所形成的CHBE的旋光度在这种体系中100%对映体过量。在水相中用携带含有S1和GDH基因质粒的E. coli HB101作为催化剂不对称还原是比较简单的。并且，这种体系并不额外需要商业GDH或者有机溶剂。因此，这种体系对于实际合成纯光学活性的(S)-CHBE是非常方便的。Optically active 4-chloro-3-hydroxybutanoic acid esters are useful chiral building blocks for the synthesis of pharmaceuticals. The (R)-enantiomer is a precursor of L-carnitine (Zhou et al. 1983), and (S)-enantiomer is an important starting material for hydroxymethylglutaryl- CoA (HMG-CoA) reductase inhibitors (Karanewsky et al. 1990). Many studies have described the microbial or enzymatic asymmetric reduction of 4-chloro-3-oxobutanoic acid esters (Aragozzini and Valenti 1992; Bare et al.1991; Hallinan et al. 1995; Patel et al. 1992; Shimizu et al. 1990; Wong et al. 1985) based on the reduction by baker’s yeast (Zhou et al. 1983).We have previously showed that Candida magnoliae AKU4643 cells reduced ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate (COBE) to (S)-CHBE with an optical purity of 96% enantiomeric excess (e.e.) (Yasohara et al. 1999). As this yeast has at least three different stereoselective reductases (Wada et al. 1998, 1999a, b), the (S)-CHBE produced by this yeast was not optically pure. From among these three enzymes, an NADPH-dependent carbonyl reductase, designated as S1, was purified and characterized in some detail (Wada et al. 1998). We cloned and sequenced the gene encoding S1 and overexpressed it in Escherichia coli cells. This E. coli transformant reduced COBE to optically pure (S)-CHBE in the presence of glucose, NADP+, and commercially available glucose dehydrogenase (GDH) as a cofactor generator (Yasoharaet al. 2000). Here, we describe the construction of three E. coli transformants coexpressing the S1 from C. magnoliae and GDH from Bacillus megaterium genes and analyze the reduction of COBE catalyzed by these strains. Previous reports on the enzymatic reduction of COBE to (R)-CHBE with an optical purity of 92% e.e. (Kataoka et al. 1999; Shimizu et al. 1990) recommended an organic- solvent two-phase system reaction for an enzymatic or microbial reduction, because the substrate (COBE) is unstable in an aqueous solvent and inactivates enzymes. We examined the reduction of COBE to optically pure (S)-CHBE by E. coli transformants in a water monophase system reaction and discuss the possible use of this type of reaction system in industrial applications。具有旋光性的（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯在药物制剂的合成中是重要的手性化合物。其右旋体是L-卡尼汀的前体，其左旋体是羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂的起始材料。许多研究描述了以面包酵母为基础微生物或者酶的COBE的不对称还原。我们先前已经知道利用来自念珠菌属magnoliae AKU4643 细胞催化COBE生成光学纯度96%的CHBE。这种酵母至少有三种立体选择性的还原酶，这种酵母产生的CHBE并非纯光学的，在这三种酶之中，NADPH-依赖碳酰还原酶，我们克隆并测序编码S1的基因，并在大肠杆菌中过表达。大肠杆菌转化细胞在葡萄糖，NADP+和商业化的葡萄糖脱氢酶作为辅酶因子的启动子催化COBE生成纯光学的CHBE。我们构建这三种大肠杆菌转化细胞共表达来自的S1和来自巨大芽孢杆菌的GDH，并分析COBE被这几种菌株催化还原的反应机理。先前的报道表明，利用酶催化还原COBE生成CHBE光学纯度可达92%，也提到了因为底物（COBE）在水相中不稳定，并且酶容易钝化，所以利用酶或者微生物在有机溶剂/水两相体系中催化反应。我们研究了在水单相体系中由COBE还原生成纯光学的CHBE，还讨论了这种反应体系在工业应用中可能的用途。Materials and methodsBacterial strain and plasmids The E. coli strains used in this study were JM109 and HB101.Plasmid pGDA2, in which the GDH gene from B. megaterium is inserted into pKK223-3, was kindly provided by Professor I. Urabe, Osaka University (Makino et al. 1989). Plasmids pSL301 and pTrc99A were purchased from Invitrogen (USA), and Amersham Pharmacia Biotech (UK), respectively. Plasmids pUC19 and pSTV28 (Homma et al. 1995; Takahashi et al. 1995) were purchased from Takara Shuzo (Japan).材料和方法菌株和质粒本次实验中使用的大肠杆菌是JM109 and HB101。来自B. megaterium的GDH基因插入到Pkk233-3质粒中，而带有GDH基因片段的pGDA2质粒由到由大阪大学的urabe教授提供。质粒pSL301和 pTrc99A是由美国的Invitrogen公司和英国的公司分别购买的。质粒pUC19和pST28是由日本takara公司购买的。The recombinant plasmid used in this study was constructed as follows (Fig. 1): Plasmid pGDA2 was double-digested with EcoRI and PstI to isolate a DNA fragment of about 0.9 kilobase pairs (kb) including the GDH gene. This fragment was inserted into the EcoRI-PstI site of plasmid pSL301 to construct plasmid pSLG. Plasmid pSLG was double-digested with EcoRI and XhoI to isolate a DNA fragment of about 0.9 kb including the GDH gene.这次实验使用的重组质粒构建如下：质粒pGDA2 被EcoRI 和 PstI双酶切从而分离出一个大小约为0.9kb的包含有GDH基因的DNA片段。这个片段被插入到质粒Psl301的EcoRI-PstI酶切位点从而构建出质粒pSLG。质粒pSLG被EcoRI和XhoI To construct plasmid pNTS1G, this 0.9-kb fragment was inserted into the EcoRI-SalI site of pNTS1, which was constructed to overproduce S1 as described previously (Yasohara et al. 2000). To construct plasmid pNTGS1, plasmid pNTG was first generated. Two synthetic primers (primer 1, TAGTCCATATGTATAAAGATTTAG,and primer 2 TCTGAGAATTCTTATCCGCGTCCT) were prepared for polymerase chain reaction (PCR) using pGDA2 as the template. The PCR-generated fragment was double- digested with NdeI and EcoRI and then inserted into the NdeI EcoRI site of plasmid pUCNT, which was constructed from pUC19 and pTrc99A, as reported (Nanba et al. 1999), to obtain pNTG. To construct plasmid pNTGS1, two synthetic primers (primer 3, GCCGAATTCTAAGGAGGTTAATAATGGCTAAGAACTTCTCCAACG, and primer 4, GCGGTCGACTTAGGGAAGCGTGTAGCCACCGTC) were prepared using pUCHE, which contains the S1 gene as the template. The PCR-generated fragment was double-digested with EcoRI and SalI and then inserted into the EcoRI-SalI site of pNTG to obtain pNTGS1. Plasmid pNTS1G, pNTGS1 or pNTG was transformed into E. coli HB101.构建pNTS1是为了过表达前文所提到的S1，这个0.9kb大小的片段被插入到pNTS1的EcoRI-SalI酶切位点从而构建pNTS1G。为了构建质粒pNTGS1，首先需要构建pNTG。两个合成引物（引物1，TAGTCCATATGTATAAAGATTTAG和引物2，TCTGAGAATTCTTATCCGCGTCCT）和作为模板的pGDA2是PCR反应需要的。PCR得到的片段是由NdeI 和EcoRI双酶切和并插入到质粒pUCNT的NdeI EcoRI酶切位点来得到pNTG。根据报道，pUCNT是由pUC19和 pTrc99A构建而来。为了构建质粒pNTGS1，两个合成引物(引物 3, GCCGAATTCTAAGGAGGTTAATAATGGCTAAGAACTTCTCCAACG, and 引物 4, GCGGTCGACTTAGGGAAGCGTGTAGCCACCGTC)，包括了S1基因作为模板。Pcr产物片段被EcoRI和SalI双酶切然后被插入到pntg的EcoRI-SalI酶切位点得到pntg1.质粒pNTS1G, pNTGS1或者 pNTG都是导入大肠杆菌HB101.Plasmid pGDA2 was double-digested with EcoRI and PstI to isolate a DNA fragment of about 0.9 kb including the GDH gene. To construct plasmid pSTVG, this fragment was inserted into the EcoRI-PstI site of plasmid pSTV28. Plasmid pSTVG was transformed into E. coli HB101. 质粒pGDA2被EcoRI 和 PstI双酶切得到包含GDH基因的0.9kb大小的DNA片段。为了构建pSTVG质粒，这个片段被插入到pSTV28质粒的EcoRI-PstI的酶切位点。pSTVG质粒被导入到E. coli HB101。Medium and cultivationThe 2×YT medium comprised 1.6% Bacto-tryptone, 1.0% yeastextract, and 0.5% NaCl, pH 7.0. E. coli HB 101 carrying pNTS1,pNTG, pNTS1G, or pNTGS1 was inoculated into a test tube containing2 ml 2×YT medium supplemented with 0.1 mg/ml ampicillin,followed by incubation at 37 °C for 15 h with reciprocal shaking.This preculture (0.5 ml) was transferred to a 500-ml shakingflask containing 100 ml 2×YT medium. The cells were cultivatedat 37 °C for 13 h with reciprocal shaking. E. coli HB101 carryingpNTS1 and pSTVG was similarly cultivated in 2×YT mediumsupplemented with 0.1 mg/ml ampicillin and 0.1 mg/ml chloramphenicol.培养基和培菌2*YT培养基 包含有1.6%细菌用胰蛋白胨，1.0%酵母提取物，0.5% NaCl，pH7.0.携带有pNTS1,pNTG, pNTS1G, 或 pNTGS1的大肠杆菌HB101被接种到有0.1mg/ml氨苄青霉素的2ml的2*YT培养基，37°C摇床15小时。将0.5ml菌液接种到100ml2*YT培养基的500ml烧瓶中。在37°C摇床培养13小时。携带有pNTS1 和 pSTVG质粒的大肠杆菌HB101在2*YT培养基中培养方法相似，只是培养基中要加入0.1 mg/ml的氨苄青霉素和 0.1 mg/ml的氯霉素。Preparation of cell-free extracts and the enzyme assay Cells were harvested from 100 ml of culture broth by centrifugation, suspended in 50 ml of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), and then disrupted by ultrasonication. The cell debris was removed by centrifugation; the supernatant was recovered as the cell-free extract. Carbonyl reductase S1 activity (COBE-reducing activity) was determined spectrophotometically as follows: The assay mixture consisted of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 0.1 mM NADPH, and 1 mM COBE. The reactions were incubated at 30 °C and monitored for the decrease in absorbance at 340 nm. The assay mixture for GDH activity consisted of 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), 100 mM glucose, and 2 mM NADP+. The reactions were incubated at 25 °C and monitored for the increase in absorbance at 340 nm. One unit of S1 or GDH was defined as the amount catalyzing the reduction of 1 μmol NADP+ or oxidation of 1 μmol NADPH per minute, respectively. Protein concentrations were measured with a proteinassay kit containing Coomassie brilliant blue (Nacalai Tesque, Japan),using bovine serum albumin as the standard (Bradford 1976).无细胞抽提液和酶鉴定将100ml培养液离心收获菌体，用50ml0.1mol/LpH为6.5的磷酸缓冲液悬浮，然后超声粉碎。细胞碎片通过离心可以去除，收集上层清液就是无细胞抽提物。碳酰还原酶S1的活性由分光光度计测量如下：测定的混合物包括：0.1mol/LpH6.5的磷酸二氢钾缓冲液，0.1mMNADPH和1mMCOBE。反应在30°C条件下反应，并且随时监测其在340nm处的吸光值。测GDH混合物包括：1M pH 8.0的Tris-HCl的缓冲液，100mM的葡萄糖，2mM的NADP+。反应在25°C下进行，监测其在340nm处的吸光值。一个单位S1或GDH被定义为每分钟催化还原1μmol NADP+或氧化1 μmol NADPH的量。蛋白质的测定通过含有考马斯亮蓝的蛋白质测定试剂利用牛血清白蛋白作为标准进行测定。Study of enzyme stabilityOne milliliter of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) containing the cell-free extracts of E. coli HB101 carrying pNTS1 (S1: 20 U/ml) was mixed with an equal volume of each test organic solvent in a closed vessel. After the mixture was shaken at 30 °C for 48 h, the remaining enzyme activities in an aqueous phase were assayed as described above. The mixture, containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), S1 (20 U/ml), and various concentrations of CHBE, was incubated at 30 °C for 24 h in order to study the enzyme’s stability in the presence of CHBE.The remaining enzyme activities were assayed as described above.酶稳定性的研究一毫升含有含有pNTS1质粒的E. coli HB101的无细胞抽提液的100mM磷酸氢二钾缓冲液（pH6.5）与等体积的有机溶剂混合。混合物在30 °C震摇48小时后，水相中残留的酶活力即是上述的酶活力。COBE reduction with E. coli cells expressing the S1 gene and E. coli cells expressing GDH genes in a two-phase system reaction The reaction mixture comprised 15 ml culture broth of E. coli HB101 carrying pNTG, 17 ml culture broth of E. coli HB101 carrying pNTS1, 1.6 mg NADP+, 4 g glucose, 2.5 g COBE, 25 ml n-butyl acetate, and about 25 mg Triton X-100. The pH of the reaction mixture was controlled at 6.5 with 5 M sodium hydroxide. At 2 h, 1.25 g COBE and 2.5 g glucose were added to the reaction mixture. To compare the reaction by E. coli transformant coexpressing the GDH and S1 genes, 30 ml culture broth of E. coliHB101 carrying pNTS1G was used instead of culture broth of E. coli HB101 carrying pNTG and E. coli HB101 carrying pNTS1. Other components and the procedure were the same as described above.表达S1基因和GDH基因的大肠杆菌细胞在两相反应体系中的还原反应混合物包含有带有pNTG质粒的大肠杆菌HB101的菌液15ml，pNTS1质粒的大肠杆菌HB101的菌液17ml，1.6 mg NADP+，4 g葡萄糖，2.5g的COBE，25ml的n-butyl acetate丁酰醋酸盐和大约25mg的聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100。用5M的NaOH溶液将pH控制在6.5。在反应两小时后，加入1.25gCOBE和2.5g葡萄糖到该混合物中。比较大肠杆菌转化细胞共表达GDH和S1基因，携带有pNTS1G质粒的大肠杆菌HB10130ml菌液取代了携带有pNTG和pNTS1质粒的大肠杆菌HB101菌液。其他的成分和步骤和上述的方法相似。 COBE reduction to (S)-CHBE in a two-phase system reaction The reaction mixture contained 50 ml of culture broth of an E. coli HB101 transformant, 3.2 mg NADP+, 11 g glucose, 10 g COBE, 50 ml n-butyl acetate, and about 50 mg Triton X-100. The reaction mixture was stirred at 30 °C, and the pH was controlled at 6.5 with 5 M sodium hydroxide. Five grams of COBE/5.5 g glucose and 10 g COBE/11 g glucose were added to the reaction mixture at 3 h and 7 h, respectively; 3.2 mg NADP+ was added at 26 h.COBE在两相系统中还原生成（S）-CHBE反应混合物包含50ml E. coli HB101转化细胞的培养液，3.2mgNADP+,11g葡萄糖，10gCOBE，50ml丁酰醋酸，和大概50mg聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100.在30°C温度下将其混合均匀，并用5M的NaOH溶液将pH控制在6.5。在第3小时加入5gCOBE和5.5g葡萄糖或者在第7小时加入10gCOBE和11g葡萄糖，分别在第26小时加入3.2gNADP+。 COBE reduction to (S)-CHBE in an aqueous system reaction The reaction mixture was made up of 50 ml of culture broth of an E. coli HB101 transformant, 3.1 mg NADP+, 11 g glucose, and about 50 mg Triton X-100. The reaction mixture was stirred at 30 °C. Fifteen grams of COBE was fed continuously by means of a micro-feeding machine at a rate of about 0.02 g/min for about 12 h. The pH of the reaction mixture was controlled at 6.5 with 5 M sodium hydroxide. The reaction mixture was extracted with 100 ml ethyl acetate. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and then evaporated in vacuo. COBE在水相中还原成(S)-CHBE的反应反应的体系是由50ml大肠杆菌HB101转化细胞的菌液，3.1mgNADP+，11g葡萄糖和大约50mg聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100。反应混合物在30°C15mg的COBE通过微量添加机器以0.02 g/min的速率连续12小时恒定的加入到体系中。用5M的NaOH溶液将pH控制在6.5。反应混合物用100ml乙酸乙酯萃取。有机层用无水硫酸钠吸干，并在真空中脱水。Analysis The organic layer was obtained on centrifugation of the reaction mixture and was assayed for CHBE and COBE by gas chromatography. Optical purity of CHBE was analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC), as described previously (Yasohara et al. 1999).Enzymes and chemicals Restriction enzymes and DNA polymerase were purchased fromTakara Shuzo (Japan). COBE (molecular weight: 164.59) was purchasedfrom Tokyo Kasei Kogyo (Japan). Racemic CHBE (molecularweight: 166.60) was synthesized by reduction of COBE withNaBH4. All other chemicals used were of analytical grade andcommercially available.分析离心反应混合物得到的有机层通过气相色谱法测定其CHBE和COBE。COBE的光学纯度如前所述通过高效液相色谱法进行分析。酶和化学试剂限制性内切酶和DNA聚合酶由takara公司购得，COBE（分子量：164.59）由东京Tokyo Kasei Kogyo公司购得，消旋体CHBE（分子量166.6）通过COBE及NaBH4合成。所有其他化学试剂都是分析等级和商业化的试剂。Construction of E. coli transformants overproducing S1 and GDHTo express the carbonyl reductase S1 and GDH genes in the same E. coli cells, four expression vectors were constructed (Fig. 1). Plasmids pNTS1G and pNTGS1 contain the S1 gene from C. magnoliae, the GDH gene from B. megaterium, the lac promoter derived from pUC19, and the terminator derived from pTrc99A. Plasmid pNTS1 contains the S1 gene, the lac promoter derived from pUC19, and the terminator derived from pTrc99A. The enzyme activities in cell-free extracts of the E. coli transformants are shown in Table 1. E. coli HB101 cells carrying the vector plasmid pUCNT had no detectable S1 or GDH activity. E. coli HB101 carrying either pNTS1G or pNTGS1 showed S1 and GDH activity without isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) induction. The S1 activities of these two transformants were lower than the GDH activities. To obtain a transformant whose S1 activity was equal to or greater than the level of GDH activity, we used a lower copy vector, pSTV28 (Homma et al. 1995; Takahashi et al. 1995), to express the GDH gene. It may be possible to raise the S1 activity by lowering the GDH activity. Plasmid pSTVG contains the GDH gene, the lac promoter, the chloramphenicol resistance gene, and the replicative origin derived from pACYC184 for compatibility with the plasmid pNTS1. In E. coli HB101 carrying pNTS1 and pSTVG, the S1 activity was higher than the GDH activity, but this GDHlevel may be too low to regenerate in a COBE reduction reaction as described below.过产生S1和GDH的大肠杆菌转化细胞的构建为了在同一大肠杆菌细胞中表达碳酰还原酶S1和GDH基因，要构建四个表达型载体。质粒pNTS1G 和 pNTGS1包含有来自C. magnoliae的S1基因，来自B. megaterium的GDH基因，来自pUC19的LAC启动子，从pTrc99A的来的终止子，质粒pNTS1包含有S1基因，来自pUC19的LAC启动子，从pTrc99A的来的终止子。在大肠杆菌转化细胞的无细胞抽提物的酶活力如表一所示。携带有运输质粒pUCNT的大肠杆菌细胞无法检测到其S1和GDH活性。携带有pNTS1G 或 pNTGS1质粒在没有IPTG的诱导下有S1和GDH的活性。在这两个转化菌种中，S1的活力小于GDH的活力。为了得到S1活性等于或者大于GDH的大肠杆菌转化菌株，我们使用低拷贝的载体pSTV28，来表达GDH基因。它可能可以通过降低GDH的活性从而提高S1的活性。质粒pSTVG包含有GDH基因，lac启动子，和氯霉素抗性基因，以及与pNTS1具有相容性的从pACYC184得来的复制起始位点。在携带有pNTS1和pSTVG的大肠杆菌转化细胞中，S1的活性要高于GDH的活性，但是GDH的活性可能会太低而在COBE还原反应中不能再生。 太长了，字数有限制，所以不能发完。分数我无所谓啦，我很少登录的。这应该算是基因工程的吧，是我以前自己翻的，不是很好。如果你要的话可以联系我的邮箱。
基因工程技术的现状和前景发展 【摘要】从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。【关键词】基因工程技术；前景；现状一、基因工程应用于植物方面 农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学家协同作战，耐涝、耐盐碱、耐旱和耐冷的转基因作物新品种(系)也已获得成功。植物的抗寒性对其生长发育尤为重要。科学家发现极地的鱼体内有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增长，从而免受低温的冻害并正常地生活在寒冷的极地中。将这种抗冻蛋白基因从鱼基因组中分离出来，导入植物体可获得转基因植物，目前这种基因已被转入番茄和黄瓜中。随着生活水平的提高，人们越来越关注口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明，利用基因工程可以有效地改善植物的品质，而且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域，近几年利用基因工程改良作物品质也取得了不少进展，如美国国际植物研究所的科学家们从大豆中获取蛋白质合成基因，成功地导入到马铃薯中，培育出高蛋白马铃薯品种，其蛋白质含量接近大豆，大大提高了营养价值，得到了农场主及消费者的普遍欢迎。在花色、花香、花姿等性状的改良上也作了大量的研究。二、基因工程应用于医药方面目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。 目前，应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段；专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。由中国、美国、德国三国科学家及中外六家研究机构参与研制的专门用于治疗乙肝、慢迁肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的体细胞基因生物注射剂，最终解决了从剪切、分离到吞食肝细胞内肝炎病毒，修复、促进肝细胞再生的全过程。经4年临床试验已在全国面向肝炎患者。此项基因学研究成果在国际治肝领域中，是继干扰素等药物之后的一项具有革命性转变的重大医学成果。三、基因工程应用于环保方面工业发展以及其它人为因素造成的环境污染已远远超出了自然界微生物的净化能力，已成为人们十分关注的问题。基因工程技术可提高微生物净化环境的能力。美国利用DNA重组技术把降解芳烃、萜烃、多环芳烃、脂肪烃的4种菌体基因链接，转移到某一菌体中构建出可同时降解4种有机物的“超级细菌”，用之清除石油污染，在数小时内可将水上浮油中的2/3烃类降解完，而天然菌株需1年之久。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢杆菌、且表达成功。它能钉死蚊虫与害虫，而对人畜无害，不污染环境。现已开发出的基因工程菌有净化农药的DDT的细菌、降解水中的染料、环境中有机氯苯类和氯酚类、多氯联苯的工程菌、降解土壤中的TNT炸药的工程菌及用于吸附无机有毒化合物(铅、汞、镉等)的基因工程菌及植物等。90年代后期问世的DNA改组技术可以创新基因，并赋予表达产物以新的功能，创造出全新的微生物，如可将降解某一污染物的不同细菌的基因通过PCR技术全部克隆出来，再利用基因重组技术在体外加工重组，最后导入合适的载体，就有可能产生一种或几种具有非凡降解能力的超级菌株，从而大大地提高降解效率。四、前景展望由于基因工程运用DNA分子重组技术，能够按照人们预先的设计创造出许多新的遗传结合体，具有新奇遗传性状的新型产物，增强了人们改造动植物的主观能动性、预见性。而且在人类疾病的诊断、治疗等方面具有革命性的推动作用，对人口素质、环境保护等作出具大贡献。所以，各国政府及一些大公司都十分重视基因工程技术的研究与开发应用，抢夺这一高科技制高点。其应用前景十分广阔。我国基因工程技术尚落后于发达国家，更应当加速发展，切不可坐失良机。但是，任何科学技术都是一把“双刃剑”，在给人类带来利益的同时，也会给人类带来一定的灾难。比如基因药物，它不仅能根治遗传性疾病、恶性肿瘤、心脑血管疾病等，甚至人的智力、体魄、性格、外表等亦可随意加以改造；还有，克隆技术如果不加限制，任其自由发展，最终有可能导致人类的毁灭。还有，尽管目前的转基因动植物还未发现对人类有什么危害，但不等于说转基因动植物就是十分安全的，毕竟这些东西还是新生事物，需要实践慢慢地检验。转基因生物和常规繁殖生长的品种一样，是在原有品种的基础上对其部分性状进行修饰或增加新性状，或消除原来的不利性状，但常规育种是通过自然选择，而且是近缘杂交，适者生存下来，不适者被淘汰掉。而转基因生物远远超出了近缘的范围，人们对可能出现的新组合、新性状会不会影响人类健康和环境，还缺乏知识和经验，按目前的科学水平还不能完全精确地预测。所以，我们要在抓住机遇，大力发展基因工程技术的同时，需要严格管理，充分重视转基因生物的安全性。【参考文献】[1]楼士林，杨盛昌，龙敏南，等.基因工程[M].北京：科学出版社，2002.[2]李庆军，董艳桐，施冰.植物抗虫基因的研究进展[J].林业科技，2002，27(2)：22 26. 这还有一篇
基因工程制药------浅谈摘要： 主要介绍基因工程的概念、基因工程技术开发药物的一般过程及基因工程药物，同时探讨了今后利用基因工程技术进行药物开发、研究的发展方向。正文：1 基因工程概述所谓的基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持续稳定地繁殖。基因工程的第一个重要特征是跨越天然物种屏障的能力，即把来自任何一种生物的基因放置在与其毫无亲缘关系的新寄主生物细胞中去的能力。这表明人们有可能按照主观愿望创造出自然界中不存在的新物种。第二个特征是，它强调了一种确定的DNA小片段在新寄主细胞中进行扩增的事实．才能制备到大是纯化的DNA片断，从而拓宽了分子生物学的领域，使之在生物制药领域有巨大的应用。基因工程自从20世纪70年代初期问世以来，无论是在基础理论研究领域，还是在生产实际应用方面．都已经取得了惊人的成绩。基因组核苷酸全序列的测定与分析，是基因工程技术促进基础生物学研究的一个出色范例。2001年2月12 日，由6国的科学家共同参与的国际人类基因组公布了人类基因组图谱及初步分析结果，这结果为人们提供了约3000 多个基因可用来制药，将推进基因制药产业的快速发展。由于基因克隆技术的发展，已使得基因工程技术在工业生产尤其是制药生产中发挥了重要作用。以前人们利用微生物自身生产有用的产品，如利用青霉菌生产青霉素、利用链霉菌生产链霉素等。但是从这些生物体中分离纯化这些药物，不仅成本昂贵，而且技术上也相当困难。如今将编码这些药物的基因克隆并转移到合适的生物体内进行有效的表达，就可以方便地提取到大量的有用药物。2 基因工程技术开发药物的一般过程利用基因工程技术开发一个药物，一般要经过以下几个步骤：①目的基因片断的获得：可以通过化学合成的方法来合成已知核苷酸序列的DNA片段；也可以通过从生物组织细胞中提取分离得到，对于真核生物则需要建立cDNA文库。 ②将获得的目的基因片断扩增后与适当的载体连接后，再导入适当的表达系统。③在适宜的培养条件下，使目的基因在表达系统中大量表达目的药物。④将目的药物提取、分离、纯化，然后制成相应的制剂。以上方法大部分是以微生物或组织细胞作为表达系统．通过微生物发酵或组织细胞培养来进行药物生产。近年来，通过转基因动物来进行药物生产的"生物药厂"成为目前转基因动物研究的最活跃的领域，也是基因工程制药中最富有诱人前景的行业。转基因动物制药具有生产成本低、投资周期短、表达量高、与天然产物完全一致、容易分离纯化等优势，尤其是适合于一些用量大、结构复杂的血液因子，如人血红蛋白（Hb）、人血白蛋白（HSA）、蛋白C（Protein C）等。英国的爱丁堡制药公司通过转基因羊生产α1-抗胰蛋白酶（α1-AAT）用于治疗肺气肿，每升羊奶中产16g AAT，占奶蛋白含量的 30%，估计每只泌乳期母羊可产70g AAT。另外，转基因植物制药比转基因动物制药更为安全，因为后者有可能污染人类的病原体。目前，已经开发出许多转基因植物药物，例如脑啡肽、α-干扰素和人血清蛋白，以及两种最昂贵的药物即葡萄糖脑苷脂酶和粒细胞-巨噬细胞群集落因子等。3 基因工程药物基因工程药物自20世纪70年代末期以来，有了飞跃的发展。1978年首次通过大肠杆菌生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素，1980年美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以获得专利．1982年第一个由基因工程菌生产的药物--胰岛素．在美国和英国获准使用以来，各种基因工程药物犹如雨后春笋，得到了蓬勃发展。我国的医药技术的研发和产业化也取得了长足的进展。（1） 抗生素类 传统的抗生素生产，主要利用化学合成或微生物发酵来获得，其生产过程中菌种的表达水平比较低，生产成本比较高，而且在使用过程中容易产生耐药菌群。而利用基因工程技术可以对生产菌种进行基因改造，得到表达水平高、产品目的性强的菌株，如大肠杆菌生产青霉素酞胺酶。德国一个科研小组对生产半合成青霉素的材料6APA．用基因工程来增强大肠杆菌的青霉素酰胺酶活性。将大肠杆菌的基因 PBR322的质粒克隆化所形成的菌株，其酶活力比原株提高 50倍．从而提高6APA生产能力。我国王以光利用基因重组技术对螺旋霉素产生菌进行改造，增强了丙酰基转移酶的基因在螺旋霉素产生菌中的表达，并提高了丙酰螺旋霉素的产量。（2） 活性多肽类 在人体中存在一系列含量较低，但生理活性很高，而且在人体代谢过程中起着重要的调节作用的活性多肽类物质如激素等，这些物质在临床上可以作为药物来治疗相应的因此类物质失衡而造成的疾病。此类药物的制剂多来源于各种动物的脏器，生产方法复杂，成本高，个别产品还必须从动物的尸体中进行提取，无法进行大规模工业化生产，自基因工程技术问世以来，通过基因重组技术，可以由微生动进行生产，这是基因工程技术的最大成就之一，以下是这类药物中比较典型的两个。胰岛素： Genentech公司在1978年，由Goeddel等学者应用基因重组技术开发出使用大肠杆菌生产人胰岛素。随着基因工程技术的不断发展，生产胰岛素的工艺和技术也不断得到完善，在临床上已经完全取代了由动物脏器提取得到的产品。目前，我国新疆转基因羊已能够成功表达人胰岛素原，为胰岛素的生产开发了新途径。生长素： 人类生长素临床用于治疗侏儒症和肌肉萎缩症．传统制造方法是由人脑下垂体抽提精制而得，其原料来源困难，产量受到极大限制。全世界侏儒症患者中仅有1%可以得到治疗，原因是生长素价格极其昂贵，达每克5000美元。1979年Genentech公司由Goeddel等学者应用基因重组技术首先开发出使用大肠杆菌生产人生长素．近年来还开发了以酵母菌来生产生长素，其产量可达到1.4×106～4.7× 106分子/细胞。目前，我国基因工程人生长素已研制成功，并投入市场和用于临床使用。除上述药物外，运用基因工程技术生产的这类药物还有神经生长因子（PDGH）、人基底成纤维细胞生长因子、绒毛膜促性腺激素等。（3） 细胞免疫调节因子 基因工程技术用于细胞免疫调节因子的产品较多，临床广泛应用于抗肿瘤和免疫调节等。近年来，由于基因重组和细胞融合两大技术的进步，加上高压液相层析技术、氨基酸序列分拆装置以及蛋白质的精制和解析技术的改进，使一些调节细胞免疫活性物质的研究和开发得到快速发展，如干扰素（INF）、白介素（IL）、集落刺激因子（CSF）和肿瘤坏死因子（TNF）等。干扰素是其中研究较为广泛，技术比较成熟，产业化较早的一个产品。第一代干扰素是从血液中进行提取而得到。据芬兰的K Canted报道，处理23000L血液，所得纯度1%以下的干扰素不足100mg．所以产量很低。而且由于血源质量不能保证，可能造成血源性传染病的传播。第二代干扰素是采用基因工程技术进行生产的，其生产水平可达250000分子/细胞，每升可含2.5亿单位，成本显著下降，产品纯度很高，含量可达90%以上。目前，已经商品化的基因工程干扰素有α、 β、γ三种，而且生产技术也在不断完善。俄罗斯科学家构建了以假单胞菌为载体的表达系统来生产基因工程干扰素．与传统的大肠杆菌表达系统相比其培养周期短，细胞易于破碎便于提取。随着基因重组技术的不断发展，一些研究人员对干扰素基因进行改造，构建靶向干扰素基因及表达载体。夏小兵等利用限制性内切酶分别从含有抗乙型肝炎S抗原（HbSAg）人源单链抗体与人干扰素α质粒中切出目的基因，连接到 pET22b质粒中，构建成单链抗体靶向干扰素表达载体，在大肠杆菌中表达成功。（4） 疫苗传统的疫苗是病源微生物的减毒或灭活物质，但这些疫苗都不理想，有可能发生回复突变，恢复毒性；或者因为灭活不适当引起疾病流行。利用基因工程技术生产的新型疫苗，可以克服传统疫苗价格昂贵、安全性能差等缺点，能为目前尚无有效疫苗的某些特殊疾病如艾滋病，提供有效的治疗手段。第一个商品化的基因工程疫苗是抗人乙型肝炎病毒（HBV）的疫苗。我国大约有10% 的人口受到HBV的侵害， HBV的感染通常还与特殊的肝癌（HCC）有着密切的关系，每年全世界死于HCC的病人有30万左右。HBV具有高度的寄主专一性，只能感染人类和黑猩猩，这意味着只能从肝炎患者身上才能获得有限数量的病毒，供做疫苗使用，而且从患者血液中提取制备的疫苗，还有传染艾滋病的可能。利用基因工程技术生产的抗HBV疫苗克服了传统疫苗的缺点，质量和安全性高，用量极少，一般剂量为10mg以下，接种3次，为普通药品用量的千分之一。1982年P Valenzuela等人将S基因（HBV表面抗原基因）的一个片段克隆在一种载体上，结果在酵母中合成出来HBV表面抗原（HbsAg）颗粒，其产量达25 μg/L，酵母表达系统现在已经能够大规模生产供给人类使用的重组肝炎疫苗。大约20年前，人们发现"裸露"DNA注入体内能够诱发免疫反应，科学家们进行了大量研究，开发出了新型的核酸疫苗。所谓核酸疫苗，是指将编码某种抗原蛋白的外源基因（DNA或RNA）直接转移到动物体内，通过宿主表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主对该抗原蛋白产生免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。现已开发出多种核酸疫苗，例如：流感核酸疫苗、艾滋病疫苗、狂犬病疫苗、结核病疫苗和乙型肝炎疫苗和戊肝疫苗等。（5） 基因治疗制品 基因治疗在1990年开始进行实验， 1993年美国FDA给人类基因治疗下的定义为："基于对活性细胞遗传物质的改变而进行的医学治疗，这种改变可以在活体外进行，然后应用于人体，或者直接在人体内进行"。因此，基因治疗存在两种方式，即间接体内法和体内法。间接体内法主要是通过在体外进行基因转移，筛选可表达外源基因的细胞，然后再转移到体内；体内法则是直接在体内改变与修复遗传物质。随着分子生物学、基因重组技术的发展，有关目的基因的获得方法已趋成熟，但是，目的基因的转移传递系统、目的基因的表达调控以及疗效和安全性还需进一步研究证实。目前，基因转移系统主要是两类：一类是由病毒介导的基因转移系统，主要包括逆转录病毒（Rt）、腺病毒（Ad）、疱疹病毒（HSV）和腺病毒相关病毒（AAV）载体等。Nnldini等开发出一种基于HIV的重组Rt载体，不需要辅助细胞，能广泛感染各种非分裂细胞，同时保留了能整合在宿主染色体上的特点。世界上第一例基因治疗所采用的载体即是Rt载体，治疗腺苷酸脱羧酶缺乏所致的严重联合免疫缺乏症（ADA-SCID）。另外一类是非病毒介导的基因转移系统，包括脂质体、分子偶联载体、基因枪和裸DNA等。另外，反义核苷酸技术也应用于基因治疗，尤其在抗乙肝病毒的基因治疗方面，包括反义DNA、反义RNA和核酶 RNA等。2001年，Robaczewska等首次通过静脉给予反义 DNA，选择性抑制北京鸭HBV在鸭肝脏中的复制和表达，证明了反义DNA在动物实验中的有效性。美国Viagene公司研究出一种被称为"艾滋病毒免疫制剂"，该药为一种鼠逆病毒与核心蛋白编码的基因序列和HIV表面抗原RNA结合产物，在小鼠和灵长类动物试验中确定该药能诱导出强的 HIV-特异性杀伤细胞。4 结束语基因工程技术使药品开发发生了根本性的转变。传统的药品开发方式是在大量的化学合成物质和微生物代谢产物中进行随机筛选，得到其中的有效成分作为新的药物。采用基因工程技术开发新药，是通过对致病机理的研究，找到那些可用于治疗目的的有效成分以及其编码基因，经过基因重组将其转入适当的载体，大量表达其有效成分作为治疗药物。同时，基因工程技术给药品生产技术带来了革命性变化。过去一些生产困难的产品，如激素、酶、抗体等一些生物活性物质，通过基因工程手段可以高质量、高收率地付诸生产，同时生产成本也大幅度降低，提高了患者的用药水平和生活质量。基因工程技术在传统医药不能有效治疗的一些疾病，如癌症、艾滋病、遗传病等的诊断、治疗和预防等方面提供了有效的新手段，并取得了一些重大的突破。如发现了致癌基因，可使癌症的早期诊断和治疗药物的开发成为可能。随着分子生物学和基因重组技术的发展，我们相信这些严重危害人类生命的疾病，在不久的将来会得到有效的预防和治疗。
基因工程技术的现状和前景发展 【摘要】从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。【关键词】基因工程技术；前景；现状一、基因工程应用于植物方面 农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学家协同作战，耐涝、耐盐碱、耐旱和耐冷的转基因作物新品种(系)也已获得成功。植物的抗寒性对其生长发育尤为重要。科学家发现极地的鱼体内有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增长，从而免受低温的冻害并正常地生活在寒冷的极地中。将这种抗冻蛋白基因从鱼基因组中分离出来，导入植物体可获得转基因植物，目前这种基因已被转入番茄和黄瓜中。随着生活水平的提高，人们越来越关注口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明，利用基因工程可以有效地改善植物的品质，而且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域，近几年利用基因工程改良作物品质也取得了不少进展，如美国国际植物研究所的科学家们从大豆中获取蛋白质合成基因，成功地导入到马铃薯中，培育出高蛋白马铃薯品种，其蛋白质含量接近大豆，大大提高了营养价值，得到了农场主及消费者的普遍欢迎。在花色、花香、花姿等性状的改良上也作了大量的研究。二、基因工程应用于医药方面目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。 目前，应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段；专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。由中国、美国、德国三国科学家及中外六家研究机构参与研制的专门用于治疗乙肝、慢迁肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的体细胞基因生物注射剂，最终解决了从剪切、分离到吞食肝细胞内肝炎病毒，修复、促进肝细胞再生的全过程。经4年临床试验已在全国面向肝炎患者。此项基因学研究成果在国际治肝领域中，是继干扰素等药物之后的一项具有革命性转变的重大医学成果。三、基因工程应用于环保方面工业发展以及其它人为因素造成的环境污染已远远超出了自然界微生物的净化能力，已成为人们十分关注的问题。基因工程技术可提高微生物净化环境的能力。美国利用DNA重组技术把降解芳烃、萜烃、多环芳烃、脂肪烃的4种菌体基因链接，转移到某一菌体中构建出可同时降解4种有机物的“超级细菌”，用之清除石油污染，在数小时内可将水上浮油中的2/3烃类降解完，而天然菌株需1年之久。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢杆菌、且表达成功。它能钉死蚊虫与害虫，而对人畜无害，不污染环境。现已开发出的基因工程菌有净化农药的DDT的细菌、降解水中的染料、环境中有机氯苯类和氯酚类、多氯联苯的工程菌、降解土壤中的TNT炸药的工程菌及用于吸附无机有毒化合物(铅、汞、镉等)的基因工程菌及植物等。90年代后期问世的DNA改组技术可以创新基因，并赋予表达产物以新的功能，创造出全新的微生物，如可将降解某一污染物的不同细菌的基因通过PCR技术全部克隆出来，再利用基因重组技术在体外加工重组，最后导入合适的载体，就有可能产生一种或几种具有非凡降解能力的超级菌株，从而大大地提高降解效率。四、前景展望由于基因工程运用DNA分子重组技术，能够按照人们预先的设计创造出许多新的遗传结合体，具有新奇遗传性状的新型产物，增强了人们改造动植物的主观能动性、预见性。而且在人类疾病的诊断、治疗等方面具有革命性的推动作用，对人口素质、环境保护等作出具大贡献。所以，各国政府及一些大公司都十分重视基因工程技术的研究与开发应用，抢夺这一高科技制高点。其应用前景十分广阔。我国基因工程技术尚落后于发达国家，更应当加速发展，切不可坐失良机。但是，任何科学技术都是一把“双刃剑”，在给人类带来利益的同时，也会给人类带来一定的灾难。比如基因药物，它不仅能根治遗传性疾病、恶性肿瘤、心脑血管疾病等，甚至人的智力、体魄、性格、外表等亦可随意加以改造；还有，克隆技术如果不加限制，任其自由发展，最终有可能导致人类的毁灭。还有，尽管目前的转基因动植物还未发现对人类有什么危害，但不等于说转基因动植物就是十分安全的，毕竟这些东西还是新生事物，需要实践慢慢地检验。转基因生物和常规繁殖生长的品种一样，是在原有品种的基础上对其部分性状进行修饰或增加新性状，或消除原来的不利性状，但常规育种是通过自然选择，而且是近缘杂交，适者生存下来，不适者被淘汰掉。而转基因生物远远超出了近缘的范围，人们对可能出现的新组合、新性状会不会影响人类健康和环境，还缺乏知识和经验，按目前的科学水平还不能完全精确地预测。所以，我们要在抓住机遇，大力发展基因工程技术的同时，需要严格管理，充分重视转基因生物的安全性。【参考文献】[1]楼士林，杨盛昌，龙敏南，等.基因工程[M].北京：科学出版社，2002.[2]李庆军，董艳桐，施冰.植物抗虫基因的研究进展[J].林业科技，2002，27(2)：22 26. 这还有一篇
要的话可以给你PPT第二章 基因工程制药第一节 概述第二节 基因工程药物生产过程第三节 目的基因的获得第四节 基因表达第五节 基因工程菌的生长代谢特点第六节 基因工程菌的稳定性第七节 基因工程菌的中试第八节 基因工程菌的培养第九节 高密度发酵第十节 基因工程药物的分离纯化第十一节 变性蛋白的复性第十二节 基因工程药物的质量控制第十三节 基因工程菌药物的制造实例第一节 概述基因工程在制药中作用基因工程药物的主要类别基因工程生产药物的优点国内外基因工程药物发展简述与国外先进水平的差距基因工程药物的主要类别1.激素：胰岛素，生长激素2.免疫性蛋白：单克隆抗体，疫苗3.细胞因子：干扰素，白细胞介素4.酶类：尿激酶，超氧化歧化酶基因工程生产药物的优点1.收获量大，更有效服务社会。2.生产效率更高3.进一步改良药理活性，例：蛋白质工程4.有利于获得新药：筛选新型化合物5..？基因工程 (genetic engineering)：有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。稀少珍贵的蛋白质药物1982年，美国食品与药物管理局批准了首例基因工程产品—人胰岛素投放市场——它标志了基因工程产品正式进入到商业化阶段。人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、a-干扰素、纤维素酶、抗血友病因子、红细胞生成素、尿激酶原、白细胞介素-2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等畜牧业中的应用动物疫苗、生长激素等例：从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA种植业中的应用用携带外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生质体，使外源DNA与植物染色体DNA整合，通过原生质体的培养分化成愈伤组织，最后发育成具有新性状的完整植株—转基因植物种植业中的应用抗化学除草剂基因转基因西红柿固氮酶基因人类DNA……环境保护等等第二+三节重组DNA技术1 重组DNA技术是基因工程的核心技术2 获得需要的目的基因（外源基因）3 构建重组质粒和基因克隆4 转化受体细胞和转化子的筛选5 转化子的分析——Southern杂交重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。1 重组DNA技术是基因工程的核心技术重组DNA操作一般步骤：（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。（1）构建基因文库，然后从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段；（3）聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因片段（4）对旧基因的改造（5）化学合成（短）基因2 获得目的基因基本方法细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建细胞内总DNA的提取分离程序基因文库的构建 将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。反转录人工合成互补DNA构建基因文库获取目的基因存在的问题— 费时费事 内含子序列反转录人工合成互补DNA方法的优势—— 获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因聚合酶链式反应（PCR）PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。加入4种物质： （1）作为模板的DNA序列；（2）与被分离的目的基因两条链 各自5’端序列相互补的 DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。聚合酶链式反应（PCR）变性、退火、延伸三步曲变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链聚合酶链式反应（PCR）每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得—— 230（1.07×109)个基因片段获得目的基因基本方法（续）4.改造旧基因——蛋白质工程5.化学合成（短）基因基因重组和克隆操作最重要的工具是限制性内切酶、载体和宿主菌。微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后，才能实现进一步的重组、转化和表达等操作。3 构建重组质粒和基因克隆限制性内切酶限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年诺贝尔奖。限制性内切酶已经发现和鉴定了200多种EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段粘性末端T4连接酶载体载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，目前最常用的载体包括细菌质粒、l噬菌体、cosmid质粒等。质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。a．该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。b．进入宿主细菌细胞后，pUC18在每个细胞中可复制形成大约500个拷贝。c．在pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种限制性酶切位点的序列，即多克隆位点细菌质粒pUC18pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG和X-gal，X-gal便会被半乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。 在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆d．利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒e．pUC18还携带了氨卞青霉素抗性基因，可筛选重组质粒。lactose(4-D-glucose--galactopyranoside) and allolactose以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：a．获得目的基因和质粒载体；b．形成重组质粒；c．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；d．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；e．筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。一般克隆基因的检查和鉴定方法琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段： 磷酸基团带负电荷 酶解片段向阳极移动 电场驱动力和凝胶阻力 ——不同迁移率 分子量标准参照物酶切和电泳方法32P标记的DNA分子探针杂交放射自显影法DNA杂交直接鉴定基因克隆获得大量目的基因后，就要使其在合适的宿主细胞中表达，产生需要的基因表达产物或使宿主生物具备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳定遗传。这一过程就是遗传转化。若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对转化的大肠杆菌进行培养使目的基因大量表达和积累。对表达产物分离纯化便可获得想要的产品。通过DNA体外重组技术构建的重组质粒还可以直接用以转化蓝藻等原核生物或其他一些原生生物4 转化受体细胞和转化子的筛选遗传转化常用的方法载体法转化——农杆菌介导法基因的直接转移（1）高压电脉冲电激穿孔（2）基因枪法（3）微注射法纪念发明者Edward Southern（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转移到滤膜（5）变性解链（6）DNA探针及杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析5 转化子的分析——Southern杂交Southern杂交分析示例A. DNA体外重组实验 B. 抗生素筛选转化子细胞 C. 培养突变株细胞 D. Southern杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA体外重组，一举打开了基因工程学大门。第四节 基因表达宿主细胞的选择大肠杆菌中的基因表达酵母中的基因表达动物细胞中的基因表达一、表达宿主菌宿主细胞的必备条件：7要点基因表达宿主菌可分为2大类别常见的宿主菌 1. 原核细胞：3种 2. 真菌：2种以上各宿主的特点是什么？二、大肠杆菌中的外源基因表达1. 真核基因在大肠杆菌表达载体的6个必备性质2. 2个表达载体——pBV220 & pET system3. 影响目的基因表达的5大因素4. 真核基因在大肠杆菌的3种表达形式E.coli 表达载体的6个必备性质1.独立的复制子2.多克隆位点3.强启动子4.强终止子5.阻遏子6.Shine-Delgarno sequence & AUG影响目的基因在E.coli表达的5大因素1.基因的剂量2.表达效率3.表达产物的稳定性:a 转录的强度，b 翻译效率（核糖体结合，SD序列，condon bias）4.宿主E.coli的代谢负荷5.工程菌的培养条件真核基因在 E.coli 3种表达形式1.融合蛋白2.分泌型表达3.普通表达三、外源基因在酿酒酵母中的表达1.载体：4大类，YEp, YRp, YCp, YIp克隆载体与穿梭载体表达载体：普通表达载体和精确表达载体。2.影响目的基因在酵母表达的因素1.外源基因的剂量2.外源基因的表达效率①启动子的来源②终止子的有效性③分泌信号的效率3.外源蛋白质的糖基化4.宿主菌株的影响第五节 基因工程菌株的生长代谢菌体生长与能量的关系 关键词：供氧/能量/副产物/菌体生长菌体生长与前提供应的关系 关键词：前提物/基因工程菌株的不稳定性菌株的稳定性与质粒的稳定性提高质粒稳定性的6种方法第六节 基因工程菌株的不稳定性第七节 基因工程菌株中试中试的目的中试的流程第八节 基因工程菌株的培养1. 基因工程菌株的培养（发酵）方式基因工程菌株的发酵工艺的七要素基因工程菌株的发酵设备第九节 高密度发酵高密度：概念与作用影响高密度发酵的因素如何达到高密度发酵建立分离纯化工艺的必要性分离纯化的基本步骤分离纯化的技术 1. 如何选择合适的分离纯化工艺 2. 细胞破碎和固液分离 3. 目标产物的分离纯化选择分离纯化工艺的依据 1. 根据产物的表达形式 2. 根据分离单元之间的衔接 3. 根据分离纯化工艺的基本要求第十节 基因工程药物的分离纯化第十一节 变性蛋白的复性包含体及其形成原因包含体的分解和溶解包含体复性的方法原材料的质量控制培养过程中的质量控制纯化工艺过程中的质量控制目标产品的质量控制1.产品的鉴别2.纯度分析3.生物活性测定4.稳定性5.产品的一致性产品的保存第十二节 基因工程药物的质量控制干扰素---人的IFNα2b的制造人粒细胞集落刺激因子人白细胞介素-2第十三节 基因工程药物制造实例
基因工程技术的现状和前景发展 【摘要】从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。【关键词】基因工程技术；前景；现状一、基因工程应用于植物方面 农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学家协同作战，耐涝、耐盐碱、耐旱和耐冷的转基因作物新品种(系)也已获得成功。植物的抗寒性对其生长发育尤为重要。科学家发现极地的鱼体内有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增长，从而免受低温的冻害并正常地生活在寒冷的极地中。将这种抗冻蛋白基因从鱼基因组中分离出来，导入植物体可获得转基因植物，目前这种基因已被转入番茄和黄瓜中。随着生活水平的提高，人们越来越关注口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明，利用基因工程可以有效地改善植物的品质，而且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域，近几年利用基因工程改良作物品质也取得了不少进展，如美国国际植物研究所的科学家们从大豆中获取蛋白质合成基因，成功地导入到马铃薯中，培育出高蛋白马铃薯品种，其蛋白质含量接近大豆，大大提高了营养价值，得到了农场主及消费者的普遍欢迎。在花色、花香、花姿等性状的改良上也作了大量的研究。二、基因工程应用于医药方面目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。 目前，应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段；专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。由中国、美国、德国三国科学家及中外六家研究机构参与研制的专门用于治疗乙肝、慢迁肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的体细胞基因生物注射剂，最终解决了从剪切、分离到吞食肝细胞内肝炎病毒，修复、促进肝细胞再生的全过程。经4年临床试验已在全国面向肝炎患者。此项基因学研究成果在国际治肝领域中，是继干扰素等药物之后的一项具有革命性转变的重大医学成果。三、基因工程应用于环保方面工业发展以及其它人为因素造成的环境污染已远远超出了自然界微生物的净化能力，已成为人们十分关注的问题。基因工程技术可提高微生物净化环境的能力。美国利用DNA重组技术把降解芳烃、萜烃、多环芳烃、脂肪烃的4种菌体基因链接，转移到某一菌体中构建出可同时降解4种有机物的“超级细菌”，用之清除石油污染，在数小时内可将水上浮油中的2/3烃类降解完，而天然菌株需1年之久。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢杆菌、且表达成功。它能钉死蚊虫与害虫，而对人畜无害，不污染环境。现已开发出的基因工程菌有净化农药的DDT的细菌、降解水中的染料、环境中有机氯苯类和氯酚类、多氯联苯的工程菌、降解土壤中的TNT炸药的工程菌及用于吸附无机有毒化合物(铅、汞、镉等)的基因工程菌及植物等。90年代后期问世的DNA改组技术可以创新基因，并赋予表达产物以新的功能，创造出全新的微生物，如可将降解某一污染物的不同细菌的基因通过PCR技术全部克隆出来，再利用基因重组技术在体外加工重组，最后导入合适的载体，就有可能产生一种或几种具有非凡降解能力的超级菌株，从而大大地提高降解效率。四、前景展望由于基因工程运用DNA分子重组技术，能够按照人们预先的设计创造出许多新的遗传结合体，具有新奇遗传性状的新型产物，增强了人们改造动植物的主观能动性、预见性。而且在人类疾病的诊断、治疗等方面具有革命性的推动作用，对人口素质、环境保护等作出具大贡献。所以，各国政府及一些大公司都十分重视基因工程技术的研究与开发应用，抢夺这一高科技制高点。其应用前景十分广阔。我国基因工程技术尚落后于发达国家，更应当加速发展，切不可坐失良机。但是，任何科学技术都是一把“双刃剑”，在给人类带来利益的同时，也会给人类带来一定的灾难。比如基因药物，它不仅能根治遗传性疾病、恶性肿瘤、心脑血管疾病等，甚至人的智力、体魄、性格、外表等亦可随意加以改造；还有，克隆技术如果不加限制，任其自由发展，最终有可能导致人类的毁灭。还有，尽管目前的转基因动植物还未发现对人类有什么危害，但不等于说转基因动植物就是十分安全的，毕竟这些东西还是新生事物，需要实践慢慢地检验。转基因生物和常规繁殖生长的品种一样，是在原有品种的基础上对其部分性状进行修饰或增加新性状，或消除原来的不利性状，但常规育种是通过自然选择，而且是近缘杂交，适者生存下来，不适者被淘汰掉。而转基因生物远远超出了近缘的范围，人们对可能出现的新组合、新性状会不会影响人类健康和环境，还缺乏知识和经验，按目前的科学水平还不能完全精确地预测。所以，我们要在抓住机遇，大力发展基因工程技术的同时，需要严格管理，充分重视转基因生物的安全性。【参考文献】[1]楼士林，杨盛昌，龙敏南，等.基因工程[M].北京：科学出版社，2002.[2]李庆军，董艳桐，施冰.植物抗虫基因的研究进展[J].林业科技，2002，27(2)：22 26. 这还有一篇