[摘要] 目的 探讨活化notch2信号对高糖条件下核因子κb受体活化因子配体（rankl）诱导破骨细胞分化的影响，
初步明确notch2信号在高糖条件下破骨细胞分化中的作用。方法 体外培养小鼠破骨前体细胞，在高糖条件下采用rankl刺激破骨前体细胞。实验分为葡萄糖和甘露醇等渗对照组，每组设5个浓度（0、5、10、20、40 mmol·l-1），
通过实时定量聚合酶链反应检测notch2基因的表达水平，抗酒石酸酸性磷酸酶（trap）染色检测破骨细胞分化情况。构建含notch2细胞内片段（icn2）的病毒载体（pmx-icn2），转染包装细胞，收获病毒上清液感染破骨前体细胞；将病毒载体分为icn2-oe（icn2过表达）和empty（仅感染pmx载体）两组，通过蛋白质印迹法检测icn2蛋白的表达水平；并在高糖条件下（20、40 mmol·l-1）用rankl刺激icn2-oe和empty组，设甘露醇等渗对照组，用trap染色检
测破骨细胞分化情况。结果 rankl诱导破骨细胞分化过程中，葡萄糖浓度为20、40 mmol·l-1时，破骨细胞数分别为110.3±6.8和72.0±8.0，notch2相对表达量分别为1.65±0.23和1.10±0.11；20、40 mmol·l-1甘露醇组的破骨细胞数分别为152.7±7.0和157.0±12.5，notch2相对表达量分别为2.82±0.28和2.42±0.27，组间差异有统计学意义（p<0.05）。
活化notch2信号后，葡萄糖浓度为20、40 mmol·l-1时，icn2-oe组破骨细胞数分别为206.7±7.8和178.3±11.5，empty组分别为102.3±8.7和76.0±10.1，组间差异有统计学意义（p<0.05）。WWW.133229.COm结论 活化notch2信号可促进高糖条件下破骨
细胞的分化。
[关键词] notch2信号； 高糖； 破骨细胞分化
[中图分类号] q 25 [文献标志码] a [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.007
研究[1-2]发现：破骨细胞不仅是唯一能进行骨吸收的细胞，而且是参与牙槽骨组织改建的主要功能细胞。破骨细胞来源于骨髓造血干细胞，由单个核前体细胞融合而成。在破骨前体细胞向破骨细胞分化过程中，不仅受到包括核因子κb受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor kappa b ligand，rankl）激活的notch2在内的多种信号传导通路的调控[3-4]，而且受到包括血糖浓度在内的多种微环境因素的调控[5]。目前，有关notch2信号在高糖条件下对破骨细胞分化情况的影响还不清楚。因此，探讨高糖条件下活化notch2信号对破骨细胞分化的影响，不仅可以明确notch2信号在糖尿病状态下牙槽骨改建中的作用，并且可以为寻找糖尿病性牙周炎的治疗方法提供新思路。
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
293t细胞；α-mem、dmem、特级胎牛血清、聚凝胺（polybrene）（sigma公司，美国），rankl、巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，m-csf）（peprotech公司，美国）；pmxs（cell biolabs公司，美国）；lipofectaminetm 2000、trizol试剂（invitrogen公司，美国），sybr green试剂盒（takara公司，日本），notch2细胞内片段（intracellu-lar fragment of notch2，icn2）抗体（cell signaling公司，美国），t-per组织蛋白提取试剂和bca蛋白分析试剂（pierce公司，美国）；聚偏二氟乙烯（polyviny-lidene difluoride，pvdf）膜（millipore公司，德国）。
1.2 细胞培养
取4周龄sd雄性大鼠，断颈处死，无菌条件下分离完整的股骨和胫骨，暴露髓腔后用α-mem培养基（含10%胎牛血清）冲洗骨髓腔数次至骨干发白为止，然后接种于10 cm大小的培养皿中，在标准条件（饱和湿度、5%co2、37 ℃）下培养12 h后收集非贴
壁细胞，1 500 r·min-1（离心半径15 cm）、37 ℃离心
5 min，弃上清液，视为破骨前体细胞[3]，加入m-csf
（20 ng·ml-1）和rankl（30 ng·ml-1）诱导其向破骨细胞分化。293t细胞用dmem培养液培养。
1.3 高浓度葡萄糖刺激
按照浓度依次增高的顺序，设置0、5、10、20、
40 mmol·l-1共5个葡萄糖梯度，同时设置相对应的0、5、10、20、40 mmol·l-1甘露醇梯度，作为等渗对照。
1.4 含icn2基因的逆转录病毒载体pmx-icn2载体
的构建
设计引物5’-cgggatccggtcatcatggccaa-
3’和5’-gcgaattccacctgcatgttgctgtg-3’，
通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，pcr
扩增针对小鼠notch2基因细胞内片段icn2的dna片段，经双酶切（bamh ⅰ和ecor ⅰ）后连接到pmx载体，构建pmx-icn2载体，并行xba ⅰ酶切以及dna测序鉴定。
1.5 体外基因转染和病毒感染
以每毫升5×105个细胞的密度接种293t细胞于
6 cm培养皿内，培养12 h。用lipofectaminetm 2000分别将pmx-icn2或pmx载体转染293t细胞，转染24 h后更换新鲜培养基，加g418（400 μg·ml-1）进行抗性筛选。2周左右形成抗性集落后收集病毒上清液，用0.45 μm滤器过滤，分装后于-70 ℃冻存备用。破骨前体细胞（每孔3×106个细胞）接种于6孔板培养12 h，加入重组逆转录病毒上清液和完全培养基，并加入聚凝胺至终质量浓度为8 μg·ml-1，然后用icn2抗体进行蛋白质印迹检测以测定icn2蛋白表达水平，其中icn2高表达组为notch2信号活化组，命名为icn2-oe，而感染pmx组为对照组，命名为empty。
1.6 抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid pho-
sphatase，trap）染色
将在高糖或等渗甘露醇培养条件下受rankl诱导的破骨前体细胞、icn2-oe及empty，用pbs洗2次，4%甲醛固定液室温固定10 min，pbs洗2次，甲醇和丙酮混合液（体积比1∶1）固定3～5 min，pbs洗2次，37 ℃条件下用trap染色液染色10 min，双蒸水洗3次，光镜观察并计数破骨细胞。多核（细胞核数目≥3个）且trap染色阳性的细胞视为破骨细胞。
trap染色液配方：n，n-二甲基甲酰胺500 μl、磷酸萘酚5 mg、trap缓冲液50 ml、固红紫色lb磷酸盐30 mg；其中trap缓冲液配制方法为：醋酸1 ml、三水合乙酸钠6.8 g、酒石酸钠二水11.5 g，加双蒸水溶解至1 000 ml。
1.7 rna的提取、cdna制备及实时定量pcr分析
将高糖或等渗甘露醇培养条件下，受rankl诱导的破骨前体细胞，用trizol试剂一步法抽提细胞总rna，紫外分光光度计测定rna260 nm/rna280 nm吸光度值以检测rna样品的纯度和浓度；然后按fermen-tas逆转录试剂盒标明的操作步骤进行实时定量pcr，cdna合成在42 ℃进行60 min，70 ℃灭活5 min。用sybr green试剂盒进行实时定量pcr分析。利用primer express 2.0设计针对notch2基因与内参照β-
actin的引物如下：小鼠notch2正义链5’-ccccttgc-cctctatgtacca-3’，反义链5’-ggtaggtggga-aagccacact-3’，扩增产物长度为67 bp；β-actin正义链5’-tgagagggaaatcgtgcgt-3’，反义链
5’-gctggaaggtggacagtgag-3’。利用2-δδct公式计算notch2相对于β-actin的基因表达量。
1.8 icn2表达的蛋白质印迹法分析
用细胞裂解液[含1 mmol·l-1苯甲基磺酰氟化物
（phenylmethyl sulfonylfluoride，pmsf）]裂解icn2-oe和empty细胞，冰上孵育20 min后，10 000 r·min-1离心（半径10 cm）5 min，保留上清液。测定蛋白质质量浓度后，每种样品以20 μg上样，进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（sodium dodecyl sul-fate-polyacrylamide gel electrophoresis，sds-page），然后转移到pvdf膜上，在含5%脱脂奶粉的tbs（含
20 mmol·l-1 tris、100 mmol·l-1 nacl，ph值为7.6）中封闭1 h。icn2多克隆抗体一抗于4 ℃下孵育12 h，二抗于室温下孵育1 h，ecl试剂盒显影，行光密度扫描作为蛋白质的定量指标。
1.9 统计学分析
采用spss 13.0统计软件包进行统计，各组数据采用x±s表示，采用单因素方差分析进行多个样本均数间比较，组间比较用snk方法。检验水准为单侧α=0.05。
2 结果
2.1 高浓度葡萄糖抑制rankl诱导的破骨细胞分化
破骨细胞的trap染色情况见图1，其计数情况见表1。图1中箭头所示为多核且trap染色为阳性的破骨细胞。从表1中可以看出：随着甘露醇浓度的升高，各组间破骨细胞数量的差异无统计学意义（p>
0.05）；葡萄糖浓度分别为5、10 mmol·l-1时与等渗甘露醇组间的差异无统计学意义（p>0.05），随着葡萄
糖浓度的继续升高，破骨细胞数目减少，葡萄糖浓度为20、40 mmol·l-1时与等渗甘露醇组间的差异具有统计学意义（p<0.05）。该结果提示，高糖环境可
以抑制rankl诱导的破骨细胞分化。
2.2 高浓度葡萄糖抑制notch2受体表达
实时定量pcr分析notch2受体mrna的表达情况见表2。从表2中可以看出：随着甘露醇浓度的升高，各组间n
notch2受体表达的差异无统计学意义（p>0.05）；葡萄糖浓度分别为5、10 mmol·l-1时与等渗甘露醇组间表达的差异无统计学意义（p>0.05），随着葡萄糖浓度的继续升高，notch2受体表达逐渐降低，葡萄糖浓度为20、40 mmol·l-1时与等渗甘露醇组间的差异具有统计学意义（p<0.05）。该结果提示高糖环境可以抑制rankl诱导的notch2受体表达。
2.3 活化notch2信号促进高糖环境下rankl诱导的
破骨细胞分化
pmx-icn2表达载体经xba ⅰ酶切，得到预期大小分别为1 587、2 619、4 299 bp的片段，结果如图2所示，初步表明逆转录病毒载体pmx-icn2构建成功。对dna测序结果进一步分析表明此重组表达载体构建正确。从图3中可看出：与empty组（感染pmx空载体病毒上清液）细胞相比，icn2-oe的icn2表达水平升高，该结果提示notch2信号被活化。从表3中可以看出：活化notch2信号后，甘露醇浓度为20、40 mmol·l-1时，icn2-oe组破骨细胞数量多于empty组，两组间的差异有统计学意义（p<0.05）；
葡萄糖浓度为20、40 mmol·l-1时，icn2-oe组破骨细胞数量多于empty组，两组间的差异具有统计学意义（p<0.05）；但是在20、40 mmol·l-1时，icn2-oe组破骨细胞数量少于对照组（等渗甘露醇浓度组），且二者间的差异具有统计学差异（p<0.05）。该结果提示
活化notch2信号不但可以促进高渗状态下rankl诱导的破骨细胞分化，而且可以促进高糖环境下rankl诱导的破骨细胞分化，但活化notch2信号不能够完全阻止高糖对破骨细胞分化的抑制作用，说明可能有多种信号途径参与了高糖抑制破骨细胞分化的过程。
3 讨论
国内外有关高糖刺激对体外破骨细胞分化影响的研究结果仍不一致。一方面，有研究[5]表明高浓度
葡萄糖通过提高破骨前体细胞表面核因子κb受体（re-ceptor activator of nuclear factor kappa b，rank）的表达水平，从而促进rankl诱导破骨细胞的分化及其骨吸收功能；另一方面，也有研究[6]表明高浓度
葡萄糖通过降低细胞核因子κb（nuclear factor kappa b，nf-κb）的活性而抑制破骨细胞分化。
破骨前体细胞在向破骨细胞分化的过程中，受到多种信号通路的精确调控以及所处微环境的综合影响。破骨前体细胞向破骨细胞分化及其骨吸收过程中，需要葡萄糖作为基本的能量代谢物质。根据预实验结果和以往的文献报道[7]，人体内正常血糖浓
度大约为5.5 mmol·l-1，本实验选择葡萄糖浓度为5、
10、20、40 mmol·l-1的α-mem培养基培养破骨前体细胞。从本实验的研究结果可以看出，各组均有破骨细胞形成，随着葡萄糖浓度的升高，多数实验组破骨细胞的数量少于等渗对照组，二者间差异具有统计学意义。这说明rankl能诱导破骨前体细胞向破骨细胞分化，而高糖环境可以抑制破骨细胞分化，并且呈现出浓度依赖性，总体趋势是浓度越大，抑制破骨细胞分化的能力越强。
破骨细胞分化的机制是一种复杂的多水平调控机制[8-9]，多因素相互作用可以促进或抑制破骨细胞的分化。对破骨细胞分化调控机制的探讨是国内外的研究热点。notch信号是细胞与细胞之间直接作用的主要信号通路之一，参与调控细胞的增殖、分化等生物学过程。经典notch信号通路由受体配体相互作用后，导致notch受体胞内段icn从膜上释放，icn进入细胞核，将与dna结合的抑制蛋白转化为转录激活因子，激活下游靶基因的表达[10]。notch信号通路的关键核转录因子rbp-j和nf-κb通过竞争性与活化t细胞核因子1（nuclear factor of activated t-cell 1，
nfatc1）启动子区域结合，在rankl诱导破骨细胞分化过程中发挥重要的调控作用[3]。利用γ-分泌酶抑
制剂阻断notch信号或是通过shrna干扰阻断notch2信号可抑制rankl诱导的破骨细胞的分化过程，而活化notch2信号可促进rankl诱导的破骨细胞分化过程。由于破骨前体细胞主要表达notch2受体[3]，提
示notch信号的综合效应可能为正向调控rankl诱导破骨细胞分化过程。本实验结果提示，随着葡萄糖浓度的升高，实验组细胞表面notch2受体的表达水平低于对照组，二者之间差异具有统计学意义。这说明rankl能提高细胞表面notch2受体的表达水平，而高糖环境可以抑制notch2受体的表达，提示notch2信号可能参与调控高糖环境下rankl诱导的破骨细胞分化过程。
前，notch2信号在高糖状态下，对破骨细胞分化的调控作用还少有研究。已有研究表明，外源性notch分子胞内区组成性活化形式icn的表达与notch配体激活notch受体后对靶细胞的作用相类似，外源性icn基因在靶细胞持续表达导致notch信号过度活化[11-12]。因此，本实验研究通过逆转录病毒系统将具
有notch2活性的胞内片段icn2导入破骨前体细胞，观察高糖条件下，活化notch2信号对破骨细胞分化的影响。本实验结果提示，活化notch2信号后，在相同的葡萄糖浓度下，实验组破骨细胞的数量多于对照组（转染空载体），二者间差异具有统计学意义。
该结果说明激活notch2信号能促进高糖条件下破骨细胞的分化，提示notch2信号可能正向调控高糖环境下破骨细胞的分化过程。结合考虑高糖抑制nf-κb活性的研究结果，notch2信号可能与nf-κb具有协同作用，可见高糖作用下破骨细胞的分化机制相当复杂，除上述因素外，还有其他信号参与其中。
致谢：感谢日本福冈齿科大学分子生物学系冈部幸司教授在本课题实施中给予的大力帮助！
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