大肠菌群的毕业论文

这是个大学生的还是中学生的？什么类型的论文？本科毕业论文还是职称论文

活大肠杆菌最清晰结构图现已发布，活大肠杆菌有何作用？

近日，伦敦大学学院的一组研究人员发布了非常清晰的活大肠杆菌的结构图，揭示了这些细菌的外膜的复杂结构，以及它们很难被药物杀死的原因。外膜是一种强大的抗生素屏障，是这些细菌的保护层，也是这些细菌对药物产生抗药性的重要因素。随着进一步的研究，这张“最清晰”的图像可以帮助我们加深对细菌的理解，并帮助我们找到对抗细菌抗生素耐药性的新方法。

大肠杆菌通常生活在健康人和动物的肠道中，大多数类型的大肠杆菌是无害的，但也有少数的菌株如O157:H7，会导致严重的胃痉挛、血性腹泻和呕吐。你可能会从受污染的水或食物中接触到大肠杆菌，比如生蔬菜、未经高温消毒的牛奶、未煮熟的牛肉等。与许多其他致病细菌不同，即使只摄入少量大肠杆菌，也可能会引起感染。大肠杆菌很容易在人与人之间传播，幼儿和老年感染大肠杆菌引起并发症的风险更高。为减少接触大肠杆菌的机会，平时应该经常洗手，注意饮食和用水安全。

一方面，人类肠道的大肠杆菌能够合成维生素B和K，供人体吸收和利用，还有竞争性抑制其他肠道致病菌的生长繁殖，对机体是有利的。另一方面，大肠杆菌也是早期用于研究遗传密码的生物之一，对它的研究加深了我们对DNA工作原理的理解。此外，大肠杆菌还被用作微型工厂，它可以被修改以快速生产数百种基因或特定蛋白质等物质，比如人胰岛素。

修改:相关网站:我给你提供一些大肠杆菌的资料,比较乱,自己去整理.三凉食品这个术语没有听说过,如果可以解释一下,或许我会知道.大肠杆菌O157: H7实验诊断研究进展 大肠杆菌O157: H7感染临床表现出血性肠炎：鲜血样便，腹部痉挛性疼痛，低热或不发热。 溶血性尿毒综合征（HUS）：主要发生在儿童，常出现在腹泻后数天或1-2周。病死率一般在10%，各别可高达50%。血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：主要发生在成年人，尤其老年人。病人主要表现为发热、血小板减少、溶血性贫血、肾功能异常等症状，病情发展迅速，病死率高，有时可出现70%的病人死亡。大肠杆菌O157: H7传染源和传播途经大肠杆菌O157: H7基本上是一种食源性病原菌，可通过食用大肠杆菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等感染,也可通过人与人、人与动物密切接触传播。在实验室，大肠杆菌O157: H7可以感染小鼠、鸡、兔、猪、牛等动物。大肠杆菌O157: H7的感染已成为世界性的问题我国情况也不容乐观一、细菌培养与鉴定 1．分离培养早期培养对确定病原有重要意义。 培养的对象首先是急性血性腹泻患者，其次是HUS、TTP等住院病人，再其次是高危接触者。培养基：山梨醇麦康凯琼脂、胰胨大豆琼脂改良的伊红美兰 、改良的SD-39（MSD）琼脂 添加了头孢克肟 和 亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）添加了头孢克肟和鼠李糖（)的山梨醇麦康凯琼脂（CR-SMAC）“科玛嘉”大肠杆菌O157: H7显色培养基四溴荧光亚甲基兰琼脂H7抗血清—山梨醇发酵培养基 增菌液：含10mg/L 新生霉素的EB肉汤或肠道增菌液含10mg/L 新生霉素或10mg/L盐酸-吖啶黄的胰蛋白胨大豆肉汤新生霉素MEC肉汤月桂基胰蛋白胨肉汤加入下例任何一种抑制剂均可增加培养基的选择性头孢克肟 亚碲酸钾 新生霉素10mg/L 万古霉素40mg/L2．免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法是将特异性抗体吸附于一种能被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样品中的大肠杆菌O157: H7富集起来。方法:1.增菌;2.取样品1ml加大肠杆菌O157: H7免疫磁珠20ul;3.轻轻混合10分钟;4.将试管插入磁架上;5.吸取上清;6.加PBS,重复3-5过程;7.取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨醇麦康凯琼脂(C-头孢克肟,T-亚碲酸钾)等选择性培养基。37℃培养6-24小时，挑取可疑菌落进行鉴定。Chapman等 共检测大便标本690份, 免疫磁珠分离法检出25 。用免疫磁珠分离法分离的l2株大肠杆菌O157: H7中,直接培养阳性仅5株。Wright等将接种大肠杆菌O157: H7的碎牛肉标本置加有万古霉素和头孢克肟的缓冲蛋白胨水培养,然后直接或用大肠杆菌O157抗体包被的磁珠分离细菌后,接种于CT-SMAC,结果直接次培养检出量为200cfu/g,而免疫磁珠分离法仅需 2cfu/g 。Chapman等先用EC肉汤增菌,然后用免疫磁珠分离法富集牛粪便大肠杆菌O157: H7菌株,再用选择性培养基分离，并与CR-SMAC和CT-MAC直接培养作比较。用前者检测接种12株不同大肠杆菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。 Cubbon等用免疫磁分离法（IMS）检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157: H7。在一起经牛奶传播的大肠杆菌O157: H7爆发中,用IMS、粪便培养和多聚酶链反应(PCR)检测Vero毒素基因的携带,用三种方法对粪便大肠杆菌O157: H7的分离率作比较结果,在受检的142份粪便标本中,直接培养和IMS均阳性20 份,另13份仅IMS阳性。因此,IMS提高了大肠杆菌O157: H7感染病例的检出率,与PCR符合率高。目前，污染的肉、家畜，甚至饮用水均面临大肠杆菌O157: H7的卫生威胁。检测食品和水源中肠道病原体使用传统的培养法,结果不理想。IMS和其它检测的研究表明,对快速检测食品和环境标本似乎前景良好,Yu检等以IMS结合电化学发光检测法(ECL)检测食品和污染物中的大肠杆菌。结果显示,在原缓冲液检出大肠肠菌的范固为100－1000 cfu/lm,在食品检出的范围为1000－2000cfu/lm ，检测时间十分快,一般不到1小时。菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。在监测牛群的4个月间,从牛采集1024份直肠标本,其中检出大肠杆菌O157: H784份（）84份中有23份（）由直接培养和IMS分离。23份中15份由两种培养基、5份仅由CT-SMAC、3份仅由CR－SMAC分离,其余61份()仅IMS分离。用含吐温－20 的PBS洗涤磁珠可减少其它微生物与磁珠的非特异性结合。用无关的抗体包被磁,则大肠杆菌O157: H7不结合。IMS具有快速、操作简单、特异性高,在流行病学调查中有价值。 3．生化反应 目前许多国家使用的O157和 H7特异性抗体与极少数细菌具有不同程度交叉反应。因此用生化试验确定为大肠杆菌是必须的。典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下：动力试验（+） 葡萄糖（+） 麦芽糖（+）甘露醇（+） 蔗糖（－/+） 硫化氢（－） 尿素（－） 靛基质（+） 甲基红（+） V-P试验（－）枸橼酸盐（－）苯丙氨酸脱羧酶（－）赖氨酸脱羧酶（+/－）鸟氨酸脱羧酶（ +/ －）氧化酶（－）氰化钾（－）与O157有鉴别意义的生化反应见表1。MUG即4-甲基伞形化内酯-β-葡萄糖醛酸苷。大多数大肠杆菌具有葡萄糖醛酸酶,可水解MUG产生荧光, 但O157: H7中大多数菌株则不水解MUG。Thompson等建立了一种快速MUG试验,取 MUG试剂置试管中,以无菌棉签挑取待检菌纯培养物混匀于其中,℃置20min,暗室内高强度光源下观察结果,产生蓝色荧光者为阳性。 二．血清学检测1．玻片凝集试验2. 胶体金免疫技术3. ELISA 4．免疫荧光技术5．胶乳凝集 6. 间接血凝分析(IEHA)7. 全自动抗原抗体检测系统8. 免疫印记法1．玻片凝集试验玻片凝集试验是鉴定O抗原最经典的方法,实验中如果凝集反应不明确，但根据临床表现和生化反应等菌株高度可疑时,可100℃加热菌液30min再行玻片凝集试验。这样可去除K抗原的影响。为排除交叉反应引起的凝集造成假阳性,应继而做试管凝集反应,所测得的效价不应低于诊断血清原标定效价的一半。鉴定H抗原也应同时做玻片和试管凝集试验,并应先对待检菌做动力试验,在动力活泼时取培养物做H抗原鉴定。2. 胶体金免疫技术胶体金免疫技术特点是以胶体金作为标记物进行的抗原抗体反应。这一技术最初用于免疫电镜技术。至今，在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的一种简便、快速的血清学检验方法。胶体金的制备多采用还原法，氯金酸是主要还原材料。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。胶体金免疫层析试验时以硝酸纤维膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一样。中国预防医学科学院微生物研究所利用胶体金技术、双抗体夹心法和显色反应等特点，研制了大肠杆菌O157: H7病原体快检金卡，通用于定性检测粪便、食品、水等样品中的O157: H7大肠杆菌。显色程度与样品中细菌含量成正比，最低测菌量为少于100个菌细胞，主要特点是敏感性高，可用于待检样品初筛，阳性样品可进行细菌分离，减少工作量。3. ELISA 大肠杆菌O157: H7的常用检测方法是粪便培养后作细菌分离,然后用生物化学和免疫学方法鉴定,一般需72 小时。Dylla等用一种快速ELISA直接检测粪便中大肠杆菌O157: H7,并与标准培养方法加以对照。结果显示,ELISA检测183份粪便标本,检出大肠杆菌O157: H7 9份。常规培养法阴性176份,而ELISA阴性174份。总特异性为。该法与其它非O157: H7大肠杆菌无交叉反应,是一种准确、敏感、特异、易观察结果的筛选方法，尤其适用于中、小实验室及大量粪便标本的流行病学调查。Padhye等用单克隆抗体进行直接ELISA反应检测O157: H7,除O26 ：H11外，未发现与沙门氏菌、结肠炎耶氏森菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯民菌等有交叉反应。单克隆抗体用于检测大肠杆菌O157: H7有明显特异性，可作为一种免疫试剂用于临床和食物标本的快速检测。Clark 等近一步对单克隆抗体的研究发现,此种单克隆抗体识别的物质是LPS,这种LPS抗原决定簇用全细胞ELISA同样可以在其它血清型大肠杆菌和产生或不产生Vero毒素的大肠杆菌中检测到, 而且易受到胆盐、吖啶黄和温度的影响,但可以通过结合免疫捕获的修饰方案来提高ELISA的特异性。4．免疫荧光技术 DEFT 与Ab-DEFT： 直接荧光技术（DEFT）与抗体定位荧光技术(Ab－DEFT)的主要特点是,显微镜下直接计数样品菌细胞。由于无需培养或分离过程,因此检测非常快速。DEFT的基本原理为:对样品进行过滤,用荧光染料(如吖啶橙)对留在滤膜上的菌细胞染色后,用荧光显微镜观察计数。但由于荧光染料的非特异染色,不但被检菌被染色,本底杂菌也可染色,从而影响了结果的精确性。Ab-DEFT则克服了这一缺点,过滤后的菌细胞与荧光标记的特异抗体作用,然后用荧光显微镜观察计数。 固相荧光毛细管免疫分析此方法高度敏感，具有快速、试剂用量少、易于操作等优点。Czajlu等用热杀死的O157: H7菌包被玻璃毛细管作固形支持物。 样品中加入结合了生物素的O157: H7多克隆抗体,作用一段时间,然后将此样品/抗体混合物与标记了Cy5 (一种荧光花青染料)的亲和素加入到毛细管,孵育2min,冲洗、吹干,由激光传感器系统发射650nm波长激发光激发花青染料,之后用光学传感器系统测定荧光发射密度。直接免疫荧光抗体染色 Park等对粪便样品进行离心后,用免疫荧光抗体对粪便涂片进行标记,可检测到所有培养法证实的菌株,检测时间<2h。5．胶乳凝集 该方法是以胶乳颗粒作载体,以O157: H7特异性抗体致敏,制成特异的胶乳试剂,将标本乳化于玻片或有色烧盘上，滴加胶乳试剂,呈明显凝集而对照胶乳不凝集时即为阳性。 6．间接血凝分析(IEHA)该法多用于对LPS、可溶性本体抗原、未加热抗原的抗体检测,对检测H抗原的抗体效果不佳。Morooka等检测了溶血性尿毒综合征(HUS)病人血清LPS抗体,虽然甲醛化羊红细胞(SRBC)有低水平非特异性吸附,但不影响该方法作为一种有效、快速（<3h）的诊断方法。因为感染病人血清的滴度明显高于非特异性吸附。7. 全自动抗原抗体检测系统VIDAS是一种全自动抗原抗体检测系统。可直接从感染性疾病患者标本中检测细菌、病毒、弓形虫、衣原体和螺旋体等微生物的抗原、抗体或毒素。基本原理：采用酶联免疫（夹心法）原理，并在底物中掺入荧光物质，最终产生荧光产物4-甲基-7-羟刀豆素，荧光强弱与标本中被测物浓度相关，经扫描样本读数与标准比较计算出标准值，并根据阴性和阳性临界值判定结果。 8.免疫印记法目的是检测大肠杆菌O157: H7感染者血清中的O157脂多糖和溶血素特异性 抗体。基本原理是将提纯的脂多糖或溶血素用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，通过转移电泳转移到硝酸纤维膜上，然后用抗原抗体进行免疫检测。包括SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移电泳、免疫检测三部分。特点是具有比较高的特异性和敏感性 。免疫检测 将封闭好的硝酸纤维素膜按梳子齿的宽度剪成每一个泳道一条，依次编号。1) 每条加入1毫升用PBS稀释的病人血清，室温震荡2小时，同时设阳性对照和阴性对照；2) 用毫升／条PBST震荡洗涤3次，每次5分钟；3) 加入用1毫升用PBS稀释的II抗，室温震荡1小时；4) 用毫升／条PBST震荡洗涤2次，每次5分钟，再用PBS洗涤一次； 5) 将膜放入12毫升显色液中显色，室温震荡15-30分钟，至阳性对照出现满意的蓝紫色 ；6) 将膜放入蒸馏水中终止显色反应，照相；7) 当显色的条带和溶血素的分子量或0157脂多糖的条谱一致时，结果判断为阳性。二．分子生物学检测 分子生物学的出现，为更快诊断微生物提供了许多分子学工具。 这一新的研究是用基因型而不是表型因子来鉴定特异性病原体。因此其特异性更好。加之 操作程序自动化使得DNA分析在实验室应用中已成为常规操作。自动化DNA提取仪，聚合酶链式反应仪(PCR仪)，DNA序列分析仪，脉冲凝胶电泳仪(用于分离DNA大片段，如完整的染色体) 在疾病诊断中都是很有用的。 1．DNA探针探针(probe)标记：放射性核素 、非放射性物质标记 。探针的来源 ：①克隆的基因组DNA探针；②cDNA探针；⑧RNA探针；④寡核苷酸探针。标本处理：根据标本来源和量的不同而处理不同 。杂交方法：斑点杂交 、southern印迹 、原位杂交 、Northern印迹 等。杂交信号检测 ： (1)测量放射性核素射线脉冲数 (2)放射自显影 (3)显色法 (4)发光法。 O157: H7特异噬菌体上的sltⅠ、Ⅱ基因、大质粒溶血素基因及染色体上eae基因等都已制成了可杂交检测的特异探针。Beutin等曾用VT1(750bp,)、VT2(850bp)、溶血素()等探针进行流行病学调查。Thomas等用地高辛标记的VT2B亚单位基因、VT2C基因探针检测不同噬菌体型O157: H7菌。Huck等筛选了O157: H7大质粒上限制性片段,发展了一种的Sma I片段探针,认为此探针对O157: H7血清型最为特异,可与所有O157: H7试验菌杂交。2. PCR技术 聚合酶链式反应技术（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。具有特异性强、敏感性高、快速、简便、可扩增RNA或cDNA、对起始材料质量要求低等优点。PCR技术扩增体系的基本成分引物: PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应充分考虑引物特异性。引物长度一般为15-30个碱基,G+C含量为40- 60%,浓度 。TaqDNA聚合酶：浓度为1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异DNA扩增 。模板DNA：应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制备方法有加热法、冻溶法、超声波粉碎法、碱变性法、SDS裂解法等多种。 4×dNTPs ： dNTP储存液pH应为，在反应体系中，4种dNTP的浓度应相同，每种dNTP的浓度以50-200 umol/L为宜。缓冲液及其他成份：PCR反应体系中，一般采用Tris-HCl缓冲液。适宜的Mg2+浓度为高于dNTP总浓度 mmol/L。 PCR技术循环参数PCR扩增是由变性、退火和延伸三个步骤反复循环而实现的。确定正确的循环参数是PCR成功的保证。循环参数1．变性温度和时间 模板DNA和PCR产物的变性不完全，是PCR反应失败最常见的一个原因,在变性步骤，使温度达到双链DNA完全分离的变性条件是95 ℃ ，30s。对GC含量高的靶DNA序列，宜用较高的变性温度。在解链温度下，DNA的变性仅需几秒。但是，使反应管内达到解链温度需要一定的时间。原则上变性步骤应高温、短时，即要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。循环参数2．引物退火 引物退火的温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应体系中的浓度 。对GC含量约50％，长20个碱基的典型寡核苷酸引物而言，最佳的退火温度为55 ℃ 。在温度较高的条件下退火，可提高PCR的特异性。 循环参数3．引物延伸 ：引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地加到引物的3’一OH末端，引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。如用TaqDNA聚合酶，一般取70-75 ℃ ，常用72 ℃ 。 延伸步骤的时间则取决于目标序列的长度、浓度和延伸温度。目标序列越长、浓度越低、延伸温度越低，则所需的延伸时间越长；反之，目标序列越短、浓度越高、延伸温度越高，所需的延伸时间则越短 一般而言，每1000个碱基的序列，延伸时间1分钟便足够了。对于扩增100—300个碱基的短序列片段，可省去延伸温度这一步骤，而采用快速简便的变性、退火双温循环。这是因为TaqDNA聚合酶即使在退火温度下仍保持很强的活性，而延伸过程可在退火温度转变为变性温度的过程中完成。 循环参数扩增产物长度 100bp 500bp 1000bp 2000bp94℃变性时间（秒） 30 30 60 6055℃复性时间（秒） 30 30 60 6072℃延伸时间（秒） 30 38 120 180一般作25-30个循环即可，进行最后一次循环时间、延伸时间增加5分钟。PCR扩增产物的检测方法PCR反应混合物经过循环扩增后，所需做的工作就是检测反应液中是否存在预期扩增产物及产物的特异性。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法。包括凝胶电泳、高压液相色谱、核酸探针杂交、探针捕获酶免疫分析、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析。PCR技术类型 免疫PCR技术 原位PCR技术 不对称PCR技术 巢式PCR技术 反向PCR技术 逆转录PCR技术 复合PCR技术 彩色PCR技术 抗原捕获PCR技术增敏PCR技术 酶标PCR技术 二温式PCR技术 锚定PCR技术 定量PCR技术 毛细管PCR技术 多重PCR技术 巢式或套式PCR技术PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用(1)简单PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段为基础设计了一对引物,扩增产物为633bp的DNA片段。其退火温度为60℃－63℃, 应用煮沸法与基因释放法,大肠杆菌O157: H7检出限分别为25与38CFU/ml,检测时间为3h。Thomas等用PCR扩增了slt基因片段。引物：正链5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3',反链5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’ 其PCR产物由凝胶电泳测定,检测时间为ld 。徐建国等根据O157: H7 特有的hlyA、B基因序列设计了PCR引物,产物为338bp。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（2）多重PCR:由于鉴定O157: H7血清型不能仅仅依靠简单PCR,近年来国外学者对多重PCR方法在大肠杆菌O157: H7的诊断价值方面进行了研究。Meng等同时扩增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其长度分别为633、210、484bp。此引物设计可有效区别O157: H7血清型与O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一个单一反应中同时扩增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa质粒保守序列,其产物分别为1087、227、224、166bp。严笠选用针对大肠杆菌O157: H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157: H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果复合PCR方法较单一PCR方法具有较高的特异性，12株O157: H7取得了稳定、可靠的阳性结果。能迅速、有效地与其它致病性大肠杆菌及沙门氏菌、志贺菌相鉴别。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（3）原位PCR:kurokawa等不用培养过程,直接用原位PCR技术结合落射显微镜,在单细胞水平快速检测O157: H7 。在大肠杆菌O157: H7分型、检测中的应用传统的细菌分类方法主要依赖于细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等特征。随着现代分子生物学理论和技术的迅速发展，微生物检测进入了基因时代，以核糖体核糖核酸序列为基础的分类方法为微生物的鉴别提供了新的分子生物学方法。如16srRNA、 23srRNA、 16-23srRNA区间序列分析等等，它完全不同于传统方法，具有快速、简便、敏感和特异等优点。23SrRNA基因特征：原核生物的核糖体有三种大小（分别为23S、16S、 5S）的rRNA。目前已知23SrRNA基因全长序列的菌种数目已达250种。长度大约为3000pb。对许多细菌的23SrRNA基因序列分析发现，其序列的可变性比16SrRNA基因要明显，特别是亲源关系近的种系。利用这些可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分类鉴定。同时对已知23SrRNA基因序列分析也发现，在最初的520pb中有6个保守区域（5-10区域），并发现，这6个保守区域中6区段和10区段最保守，该序列在14个菌种中完全一致。应用：检测临床感染性疾病的病原菌 首先，将两条引物设计在保守区，成为通用引物，而在变异区中选择序列作为特异性探针，先用通用引物作PCR扩增，可筛选出含有病原菌的样本，再用特异性探针与扩增产物进行杂交，对目的细菌作出鉴定，达到诊断病原体及分型的目的。鉴定特定细菌种属 目前认为，已发现的23SrRNA基因的IVSs具有种属特异性，可利用IVSs（插入序列）进行PCR扩增达到对某一种属细菌的诊断。在流行病学方面的应用利用可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分析。为流行病提供依据。除以上介绍的各方法外,常用的有效检测方法还有脉冲场电泳、随机扩增多态性DNA指纹分析、细胞毒试验等,在此不一一赘述。 大肠杆菌O157: H7的检验程序 样品 增菌6小时 磁珠浓缩 可疑菌落 山梨醇麦康凯琼脂G染色 生化反应 血清学 毒力基因 大肠杆菌O157: H7实验室诊断依据 有下列情况之一具有实验室确诊意义： 1) 从腹泻病患者的粪便标本中分离出大肠杆菌O157: H7 ；2) 经PCR或DNA杂交试验证实具有溶血素基因 及志贺样毒素基因；3) 腹泻病患者恢复期血清抗O157LPS IgG抗体呈4倍升高；4) 具有血性便的腹泻患者的急性期血清或恢复期血清，蛋白印记试验证实含有和O157LPS、EHEC溶血素或志贺毒素的特异性抗体．小结自从O157: H7被认识以来,对其基因的研究越来越细,已经探明了许多结构与功能基因,对其病因学、病理学及临床治疗方面均有很大促进作用。由于引起感染所需的O157: H7剂量很低,有必要发展一些灵敏度高的方法,用于快速有效地检测。另外,现已发现存在许多变异株,单用一种方法来检测往往是不够的。如发酵山梨醇的变异株用SMAC即不能检测到;由于许多非EHEC(EPEC、霍乱弧菌、志贺菌等)也可产生SLT,故单纯检测SLT也会产生假阳性结果。因此对一个样品的检测需结合使用多种方法才能获得准确的结果。 第三章 大肠菌群测定 一、大肠菌群检验(一)检验方法(二)培养基 (三)检验时应注意事二、大肠菌群的卫生学意义 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。 在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国内常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。一、大肠茵群检验(一)检验方法 1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。 2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时

很多细菌的外膜是抵御抗菌素的强劲天然屏障，是细菌对药品造成耐药性的主要要素。据25日发布在《美国国家科学院院刊》上的毕业论文，科学研究工作人员统计了迄今为止最明确的活细菌图像，揭露了其外膜的构造。

科学研究表明，革兰氏阳性菌阳性菌的防御性外膜表面很有可能有斑块。外膜包括高密度的蛋白质搭建块互联网，由没有蛋白质的斑块更替排序构成。这种斑块含有糖链(糖脂)分子结构，使外膜维持密切。

这也是一项关键的发觉，由于革兰氏阳性菌阴性菌坚毅的外膜阻拦了一些药品和抗菌素渗入体细胞。专家觉得，包含鲍曼不动杆菌，铜绿假单胞菌及其沙门氏菌和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌以内的一类细菌，其耐药性比耐药性橙黄色链球菌(如耐甲氧西林橙黄色链球菌)等革兰氏阳性菌威胁更高，一部分原因就取决于外膜。

为了更好地能够更好地了解这一构造，专家用一根针头仅有几纳米技术宽的细微的针在活大肠埃希菌上划了一道。从而获得的细菌表面的分子式图像表明，细菌的全部外膜都摆满了由蛋白质产生的微孔板，这种孔容许营养元素进到而阻拦内毒素进到。

图象还表明，外膜有很多好像没有蛋白质的斑块。这种斑块带有一般在革兰氏阳性菌呈阴性细菌表面发觉的糖脂。科学研究工作人员表明，教材上有关细菌外膜的照片表明，蛋白质以一种混乱的方法遍布在膜上，与膜的别的预制构件非常好地混合在一起。

本次的图像说明，客观事实并不是这样，只是带有糖脂的斑块从含有蛋白质的外膜互联网中提取出来，如同油与水分离出来一样，在某种情形下，会在细菌的外膜上产生间隙。这说明，外膜很有可能并非彻底遮盖了全部细菌，很有可能并不会太难被提升，但也很有可能会产生更强或最弱的色斑，这种色斑能够变成青霉素的靶标。

毕业论文通讯作者，伦敦大学学院专家教授巴特·霍格诺姆表明，这代表着现在可以逐渐探讨这类构造是不是及其怎样危害外膜的作用，一致性和对抗菌素的耐药性。

科学研究团队还推断，这种发觉很有可能有利于表述细菌怎样在维持密切防御性天然屏障的与此同时仍能迅速生长发育：在适合情况下，大肠埃希菌在20分钟内就可开展一次瓦解。她们明确提出，糖脂斑块很有可能比蛋白质互联网容许大量的膜屈伸，使膜更加容易融入细菌持续上升的尺寸。

几十年前大家已发觉，大肠埃希菌等许多细菌都是有一层外膜。具备外膜的细菌，通常对抗菌素有更多的抵抗能力。先前的研究表明，细菌的外膜抗压强度令人震惊，自身也是一面有机化学巨盾。巨盾到底是什么样的构造，它的缺点在哪里？此次，科技人员获得了活细菌的最细致肖像，并观查到它的外膜构造。带有糖脂的斑块从含有蛋白质的外膜互联网中提取出来，并在任何地区产生间隙。这种间隙实际意义，是不是能协助研发出更有特点的“矛”，就得看科技人员的下一步科学研究了。

加强农村生态环境保护与建设□卓吉华重庆农村环境问题同全国一样令人堪忧,传统粗放发展模式在一定程度上已经成为新农村建设的最大约束。特别是农药、化肥、农膜的不合理使用,禽兽和水产养殖污染,农村生活垃圾和生活污水以及乡镇企业污染,不仅直接威胁着人们的生存环境和身体健康,而且制约了农村经济的进一步发展。所有这些问题,都务必引起有关方面的关注和解决。一、重庆农村生态环境存在的主要问题(一)畜禽和水产养殖污染较为严重。据调查,全市畜禽养殖规模换算成生猪当量约3570万头,其中,猪年出栏近2000万头,家禽年出栏亿只。年产畜禽粪尿总量近7500万吨,进入水体的COD(化学需氧量)、NH3~N(氨氮)和TP(总磷)分别为万吨、万吨和万吨,其中畜禽粪尿产生的COD(化学需氧量)污染负荷与全市工业和生活废水的COD(化学需氧量)排放量相当。2005年长江、嘉陵江和乌江所有34个监测项目中,只有粪大肠菌群、石油类和总磷3项超标,其中粪大肠菌群超标率为,石油类和总磷仅在个别断面出现超标。目前,畜禽养殖污染在梁滩河、花溪河等已大大超过流域内城镇生活废水的污染负荷,成为这些流域水质恶化的主要原因。肥水网箱、网拦养鱼造成水质下降,并在局部地区超过水环境容量,导致水库富营养化问题日趋严重,成为农村环境质量下降的又一重要影响因素。(二)农药、化肥污染比较突出。大量农药、化肥不合理施用,作物秸秆、畜禽粪便、废旧农膜等农业废物污染,造成农村农业面源污染加重。2004年全市化肥施用量万吨,化肥的增加率远高于粮食的增产率;农药施用量2837吨(其中杀虫类和杀菌剂占),农用薄膜使用量万吨。其中,氮肥施用量为220公斤/公顷,高于全国平均水平,每年约2700吨废旧农膜残留于耕地中。此外,土壤受重金属污染的影响范围也已由过去的城郊区域扩展到农村地区。(三)农村饮用水安全保障程度低。全市农村饮用水安全人口万人,仅占农村饮水总人口的。水质超标和水质污染导致饮水不安全人口高达万人、337万人,其中万人饮用高氟水,万人饮用苦咸水,饮用铁锰及硬度超标人口万人,饮用硫酸盐超标人口万人。水源保证率不达标人口220,63万人,用水量不达标人口万人,用水方便程度低人口万人,无供水设施人口万人。饮用水不安全,使群众身体健康受到严重威胁,甲型肝炎发病率略高于全国平均水平,一些村成为肝病、结石、皮肤病的高发地区。(四)农村环境卫生差,垃圾、生活污水污染突出。居住环境没有实行人畜分离,没有统一的垃圾堆放点和处理场所,也没有得到有效处理。垃圾、污水处理设施跟不上农村居民的集聚发展,环保基础设施建设和环境管理落后于经济和城镇化发展。现有小城镇污水处理和垃圾处理项目单位投资和运行费用高,无法维持正常运行,特别是三峡库区区县多为国家级贫困县,建设污水处理厂,“建不起、更用不起”的矛盾十分突出。(五)乡镇企业环境污染较为普遍。乡镇企业集中程度低,技术落后,大多数缺乏环保处理设施,规模效益差,给农村生态环境带来了严重的污染。根据对三峡库区和渝西地区18个小城镇调查,其企业类型主要是煤矿、水泥、机砖、铸造、皮革、农副产品加工等资源利用型,环境污染和生态破坏十分严重。(六)生态系统功能衰退,水土流失严重。森林资源总量不足,资源分布不均,林种和林龄结构不合理,退耕还林政策中经济林比例较低,林地生态系统脆弱,稳定性差。全市水土流失面积万平方公里,占幅员面积,年土壤侵蚀总量为亿吨,进入江河的泥沙总量达亿吨。水土流失加速了土地退化和“石漠化”。仅渝东南地区石漠化面积3125平方公里,占渝东南地区幅员面积的,加重了旱灾的发生率。(七)生物多样性受到较大威胁。农村人口增加,人地矛盾突出,加大了对资源的掠夺和环境的破坏;使用农药以及大量污染物排放,不少物种的栖息地发生剧烈改变,使生态脆弱区域的物种受到威胁,不少资源逐渐处于濒危状态甚至消失绝迹。而环境的改变,又为外来入侵种的生存和扩展提供了空间。(八)矿产资源开发、交通工程建设加剧农村生态破坏。一方面,地表失稳、地表水资源失衡、水质污染,水土流失与泥石流,以及土地资源的理化结构和生产力造成的严重破坏等。另一方面,公路建设环保措施不到位,造成局部区域植被破坏、水土流失等生态问题。二、重庆农村生态环境问题的原因分析一是农村经济发展水平低。由于基础条件差,基础设施落后,产业发展水平低,粗放型经济发展模式加大了农村环境压力;全市农业人口多,人均收入低,人均国内生产总值只相当于全国平均水平的48%,自我发展能力弱;全市平均垦殖率31%,超过全国平均水平的一倍多,不利的自然环境条件加大了重庆农村环境污染治理的难度。二是农村环境保护缺乏充足资金投入和政策支持。长期以来,农村环境保护社会整体投入不足,大多数乡镇没有生活污水和垃圾处理设施,生活污水直接排入河沟,生活垃圾直接露天堆放,特别是面源污染、畜禽养殖污染防治缺乏投资渠道,政策上缺乏激励机制和优惠政策。加上农村环境保护是公益性强、回报率低的领域,对社会资金缺乏吸引力,而库区多为国家级贫困县,无力投入大量资金用于农村环境保护设施建设。三是农村环境保护和治理难度大。农村环境问题种类繁多、产生量大、分布面广,治理困难。农村环保基础设施建设总体上处于空白,许多农村地区成为污染治理的盲区和死角。如养殖污染、面源污染、土壤污染等方面立法处于空白,现行法律法规的针对性和可操作性不强,给农村环境问题的解决造成了一定的困难。现有的管理体制很难对农村环境实施有效管理,绝大多数乡镇没有环保管理机构和队伍。四是对农村环境问题重视和社会关注度不够。由于没有适当的法律、相应政策和机制帮助农民减轻农村环境污染,现有环保法律、法规、政策、制度很难延伸到农村、农业和农村居民。农业产业发展只注重数量的扩张,不考虑环境容量,忽视产业结构不合理以及过量增长也必然带来环境问题。加上农村环保宣传教育不够,广大农民受教育程度普遍较低,群众的环保意识和自我保护意识都不强,对污染的防范能力明显较弱。三、对策与建议重庆农村环境问题,已经严重威胁到广大农民群众的身体健康,制约了农村经济的进一步发展,也对库区水环境安全构成严重威胁,如果这些问题不能得到及时解决,必将影响到库区移民的稳定和三峡工程的安全运行,影响新农村建设和在西部地区率先实现全面小康目标。(一)加强农村环境保护宣传教育和培训。开展多层次、多形式的农村环境保护宣传教育。要重点加强对各级领导干部的农村生态安全和环保教育,把农村生态环境保护纳入各级社会发展规划及年度计划,牢固树立保护农村生态环境就是保护农村生产力,改善农村生态环境就是发展农村生产力的思想。要把环境与健康意识紧密联系在一起,帮助农村居民了解农村环境存在的问题、发展趋势及其危害,唤起全社会的生态意识和可持续发展意识,增强全民生态环境保护的责任感和使命感。(二)加强城乡发展统筹,加大对三峡库区产业发展指导。帮助破解环境与发展的矛盾,以环境保护优化经济发展,在加快库区经济社会发展、解决库区产业空虚化的同时,积极引导库区农民发展生态经济,切实保障库区水环境安全。鼓励库区发展传统中草药材、生态农业和生态旅游项目,帮助发展库区环湖自行车赛、登山等一批体育与休闲产业,推动库区发展低消耗、低污染、高效益的工业项目。调整现有产业发展政策,如退耕还林中适当增加经济林比例。(三)加大对农村环境保护投入,建立农村环保新机制。国家已实施的农村畜禽养殖污染治理、农村沼气建设、小城镇生活污染治理设施等项目为重庆农村环境污染治理起到了示范和推动作用。建议进一步加大项目和资金投入力度,加快“农村小康环保行动计划”实施,重点开展一批农村环保工程建设,搞好农村人畜饮水工程,保护饮用水源,推进农村环境综合整治。要按照城市反哺农村思路,建立以政府投入为主的农村环保投入机制、引导机制,吸引社会资金投向环境保护。建议将三峡库区列为全国面源污染防治试点地区,以及国家“农村小康环保行动计划”实施的重点地区,重点解决三峡库区农村面源和畜禽养殖污染以及小城镇生活污染问题。(四)加强农村环境保护监管能力,建立健全农村环境管理体系。构建农村生态环境监测和安全预警系统,建立和完善生态监测网络,加强对土壤、水环境、农产品安全等监控,开展减轻面源污染的科学研究和完善有关技术支撑。整合部门资源,建立由环保、农业、林业、水利、国土、建设、市政、卫生等部门分工合作的协调机制。基于重庆在三峡库区水环境保护中的战略地位和库区农村环保基础条件较差实际情况,建议加强库区农村环保能力建设,健全农村环境管理体系。(五)加强对小城镇生活污染治理的全面指导。小城镇生活污染整治是社会主义新农村建设的一项重要内容,也是保护三峡库区水环境的必然要求。建议根据小城镇污染的实际情况,全面加强对农村环保政策和技术上的指导,研究污染防治对策;并尽快制定出台小城镇生活污染治理的标准,推荐一批符合小城镇实际的生活污水和生活垃圾处理技术,确保小城镇生活污染治理项目的实施是:建得起、运行费用低、便于管理、处理效果好的先进而又实用环境保护工程。(六)加快农村环保法规和政策建设,建立长江流域生态环境补偿机制。制定畜禽和水产养殖污染控制,面源污染防治,资源开发利用等方面的标准和管理规章,加快推进《畜禽养殖污染防治条例》的立法进程。结合社会主义新农村建设,制定新的环保政策与相关要求,包括制定有机肥生产、使用,农业废弃物综合利用等方面的激励政策。鉴于三峡库区对于三峡工程的长期安全运行、长江中下游防洪与生态安全、南北水资源的跨区域调配具有特殊重要的战略意义,而且面临移民安置和维护社会稳定的巨大压力和困难,建议国家按照“谁利用谁补偿、谁受益谁付费”的原则,建立长江流域生态环境补偿机制,设立长江流域生态环境补偿基金。