检测酶活力的论文

下面是我查到的一个方法：柠檬酸合成酶测定缓冲液配制：样品缓冲液PH 100tris/HCl 50 mM gKCl 100mM gEDTA 1mM g储存液1 10mlacetyle-COA mM mg储存液2 10mloxaloacetate(OAA)5 mM mg储存液3 10mlDTNB mM mg步骤：520ul样品缓冲液+20ulDTNB+20ul acetyle-COA+20ul待测酶液，25℃温浴5min。加入20ulOAA立刻放入25℃恒温的分光光度计，在波长412nm测定3min(每30秒记录一次光密度)光密度变化值。在25℃作双份测定，取其均值为测定值，酶活力单位用U/min/g表示，其计算：U/min/g＝(Amin-A0)/min/mg（protein）。这个计算公式读得不太明白。该方法来自《缺氧及缺氧复合运动大鼠心肌_骨骼肌的适应性变化及机制》（博士论文，2005年，第三军医大学）

1、冰水浴研磨与液氮研磨的优缺点 （1）冰水浴研磨： 冰水浴研磨容易出现因温度控制不好而导致的酶失活的现象 冰水浴研磨因为研磨时间长，细胞破碎更加充分，因此研磨效率高 （2）液氮研磨： 当植物样本很难进行冰水浴研磨时可以采用这种方法 液氮研磨由于研磨时间短，因此容易出现细胞破碎不够充分的情况。（因此在进行研磨时可以在研磨成粉末时，再用研磨杵大范围研磨。在吸胀的胚变成接近白色粉末时为止） 在研磨之后注意与提取液混合时使用漩涡振荡器进行振荡。为了防止在振荡过程中温度升高导致酶的失活和蛋白质的分解，可以几组进行切换轮着进行漩涡振荡。（共振荡400s的效果就是可以的） 尽量用差值法记录最终称取的样本的重量 2、使用蛋白质计量酶活性的意义 由于每次研磨样品，无法保证蛋白质的提取效率相同。因此需要用蛋白质浓度计量酶活性 3、蛋白质和酶提取时间 在进行实验时，蛋白质要同时进行提取。（比如都是上午进行提取） 4、用文献数据初步核实测量时是否出现问题 用自己的数据与文献进行比较。在相同的情况下，自己的数据应当与文献的数据差异不大。（如文献数据是个位数的酶活力，如果自己出现小于0或者上千的酶活力，就需要进行复查是否在测量时出现了问题。） 5、酶活体系可能出现的问题以及可能原因 （1）差值过小 对照两组的酶含量都过低 反应体系不适合，无法进行充分反应 （2）差值过大 反应体系太小，即使是活力较低的组别，反应体系也无法承载（因此在进行实验之前，要确定反应体系能否承载自己的反应） 6、测量酶活时的实验步骤顺序 先测量样品的蛋白质浓度，若浓度相近时，才可以进行下一步实验。 在有些对实验更加严格的实验中，要首先确定蛋白质浓度，然后把蛋白质浓度统一后，才能再进行酶活力测量。 （？）稀释蛋白的浓度和稀释酶活的浓度应该是相同的（？） 7、测量时应注意的事项 在检测酶活时应尽量使用相同的体系。 在使用如96孔板进行测量时，应设置空白对照以及测量空白板的数据进行校正。 在使用比色皿用分光光度计进行测量时，注意空白对照组应与测量组使用相同的比色皿以减小误差。