素色研究的论文

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【关键词】 树突状细胞；绿色荧光蛋白；RNA；转染 Effect of dendritic cells transfected with total RNA of HepG2 cell line using GFP marker in vitro 【Abstract】 AIM: To investigate the feasibility of GFP as a marker to observe the dendritic cells (DCs) transfected with total RNA of tumor cells and the feasibility of the transfected DCs serving as a vaccine for potential immunotherapy. METHODS: Plasmid pGFPC3 was transfected into HepG2 stably. Total RNA was extracted from the HepG2GFP using Trizol; DCs were induced by liver cancer patients peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and transfected with the total RNA. The effect of transfection was observed by a fluorescence microscope, the changes of phenotype were detected by flow cytometry, and the change of IL12 secretion in the supernatant of DCs was detected by ELISA assay. The cytotoxic effect of CTLs was assessed by MTT assay. RESULTS: GFP was expressed stably in the HepG2GFP cells that presented green fluorescence under a fluorescence microscope, so did DCs transfected with total HepG2GFP cell RNA. After transfection, the expression of membrane molecules such as CD80 ( to ), HLADR ( to ), CD83 ( to ), CD86 ( to ) was increased dramatically, IL12 secretion in the supernatant was elevated significantly 〔(±) ng/L to (±) ng/L, P＜〕. The CTLs activated by DCs transfected with total HepG2GFP RNA showed a potent specific lysis to HepG2 cells. CONCLUSION: GFP could be used as a marker to observe the effect of transfection of DCs with total tumor cell RNA. DCs transfected with total tumor cell RNA may serve as a promising vaccine of immunotherapy. 【Keywords】 dendritic cell；green fluorescent protein；RNA；transfection 【摘要】 目的：探讨GFP作为标记观察肝癌细胞RNA转染DCs效果的可行性及肿瘤细胞RNA转染DCs制备疫苗的可行性. 方法：绿色荧光蛋白质粒载体 pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2，Trizol法提取筛选后细胞HepG2GFP总RNA；分离肝癌患者外周血单核细胞体外诱导DCs细胞，总RNA转染DCs，荧光显微镜下观察转染效果，流式细胞仪检测转染前后DCs表型变化；ELISA法检测转染前后上清中IL12变化情况；MTT法检测效应细胞对靶细胞的杀伤率. 结果：pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2后可得到稳定表达GFP的细胞HepG2GFP，荧光显微镜下呈绿色荧光；总RNA转染的DCs荧光显微镜下呈绿色荧光，CD80(上升至)，HLADR(上升至)，CD83(上升至)，CD86(上升至)表达明显升高，上清IL12分泌量ng/L显著增高(±→±，P＜)；诱导的CTL能够对肝癌细胞株HepG2起特异性杀伤作用. 结论：GFP可以作为肿瘤细胞RNA转染树突状细胞的观察标记，肿瘤细胞RNA转染DCs可作为一种有效的肿瘤疫苗. 【关键词】 树突状细胞；绿色荧光蛋白；RNA；转染 【中图号】 0引言 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种常见的恶性肿瘤，适合手术治疗的患者只占一少部分，具有较高的复发率，预后很差，严重威胁人类健康〔1〕. DCs(dendritic cells, DCs)是体内功能强大的专职性抗原提呈细胞，它能够高效的摄取、处理抗原，并将处理后的多肽呈递给静息型T细胞，引起针对该抗原的特异性免疫反应〔2〕. 国内外类似的研究中，都没有明确的可以观察肿瘤RNA转染DCs效果的指标，我们应用绿色荧光蛋白质粒载体 pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2，提取筛选后细胞HepG2GFP总RNA转染DCs，观察转染后DCs绿色荧光蛋白表达及特异性表面标志及功能相关分子表达，检测其上清细胞因子分泌，探讨其作为肿瘤疫苗的可行性. 1材料和方法 材料肝癌患者外周血单个核细胞来源于我科造血干细胞移植患者；HepG2肝癌细胞株由我科常规传代培养. 流式细胞仪（BD），DG3022A型酶联免疫检测仪（华东电子管厂），荧光显微镜Optiphot XIF（Nicon）等均为我院常备. FITCCD80，FITCHLADR，PECD83，PECD86抗体购自BD公司；rhGMCSF，rhIL4购自Peprorotec公司；TNFα购自我校生物技术中心；绿色荧光蛋白载体pGFPC3由陕西省肿瘤医院贾军博士惠赠；脂质体Transfection2000，Trizol Reagent购自Invitrogen；RPMI 1640培养基、胎牛血清、G418购自Gibco公司，Xvivo无血清培养基购自BioWhittaker；IL12 ELISA检测试剂盒购自Bioscience公司；MTT购自Sigma公司. 方法参照Transfection2000说明书，pGFPC3转染HepG2，G418筛选2 mon. 筛选细胞命名HepG2GFP，荧光显微镜下观察. Trizol试剂提取HepG2GFP总RNA，紫外灯下观察，-80℃冻存备用. 同样方法提取HepG2总RNA. 取肝癌患者造血干细胞分离液，贴壁法分离单核细胞，贴壁细胞在细胞因子rhGMCSF，rhIL4作用下，诱导DCs. 倒置显微镜、电子显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表型. 转染树突状细胞收集培养4 d的DCs，转入6孔板，转染HepG2GFP总RNA. 另设转染HepG2总RNA及空白对照组. 继续培养48 h. 荧光显微镜下观察. 细胞因子分泌的测定48 h后，收集各组DCs上清，ELISA法检测转染前后各组细胞上清中IL12分泌量. 效应收集各组DCs，30 Gy 60Co照射后与复苏冻存的非贴壁细胞按20∶1比例混合接种于24孔板，培养5 d，收集的细胞即为效应细胞. 收集对数生长期的HepG2细胞作为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按20∶1比例混合接种于96孔板. 同时设单一靶细胞组、单一效应细胞组. 培养24 h后，MTT法检测.以下述公式计算杀伤效率.CTL杀伤效率=〔1-（效靶A490-效应细胞A490）/靶细胞A490〕×100%.统计学方法：结果采用SPSS 统计软件分析.2结果 总RNA转染DCs稳定转染及筛选后得到的HepG2GFP细胞，能够稳定的表达GFP，荧光显微镜下所有细胞都呈现绿色荧光（图1），传代20次以上仍无消失. 与对照细胞相比，GFP基因修饰细胞在形态、生长等特性上均无显著改变，也未见GFP表达对靶细胞的毒性. 使用Trizol提取HepG2GFP细胞总RNA后，取2 μL总RNA进行凝胶电泳，可见5 s，18 s和28 s条带（图2）. 单个核细胞贴壁后，贴壁细胞在细胞因子GMCSF，IL4的作用下，培养第2日出现细胞集落，但细胞集落较小. 5 d后，集落明显增加、变大，出现具有毛刺状突起的细胞. 至7 d，集落开始减少，产生大量具有树枝状突起的细胞（图3A，B）. 荧光显微镜下，HepG2GFP总RNA转染DCs组细胞呈绿色荧光，而HepG2总RNA转染组及空白对照组则无明显荧光表达（图4A，B，C）. 图1荧光显微镜下pGFPC3稳定转染后HepG2胞浆荧光阳性 ×250（略） 图2HepG2GFP细胞的总RNA电泳（略） 图3树突状细胞形态(第7日)（略） 流式细胞仪检测细胞表型诱导d 7，DCs表达CD80 ，HLADR ，CD86 ，CD83低表达，仅；转染后上述分子表达明显升高，分别为CD80 ，HLADR ，CD86 ，CD83 ，提示转染后细胞具有成熟DCs特征. 图4总RNA转染DCs×250（略） 检测IL12分泌HepG2GFP总RNA转染DCs组上清中IL12分泌明显增加，显著高于转染前〔（±) ng/L vs (±) ng/L； n=6，P＜〕. 介导细胞毒效应HepG2GFP总RNA转染DCs刺激的CTL对HepG2细胞杀伤率为（±）%，未转染的DCs刺激的T细胞对HepG2的杀伤作用为(±)%，无DCs刺激T细胞对HepG2的杀伤作用为(±)%，总RNA转染DCs刺激的CTL对HepG2细胞杀伤率明显高于两个对照组（n=6，P＜）. HepG2GFP总RNA转染DCs刺激的CTL对SMMC7721和K562细胞杀伤率分别为(±)%和(±)%，对HepG2细胞杀伤率明显高于SMMC7721和K562细胞（n=6，P＜）. 3讨论 DCs是体内功能最强大的专职性抗原提呈细胞，它在T细胞免疫中发挥着极其重要的作用〔2〕. 应用各种肿瘤抗原致敏DCs制备疫苗是近年来研究的热点 〔3-8〕. 肿瘤细胞总RNA转染DCs制备疫苗与其他方法相比，具有如下优越性：首先，它不受已知肿瘤抗原的限制，可诱导出多克隆的CTL；其次，转染所需的RNA可以通过扩增方法得到，很少量的肿瘤组织样本即可扩增得到大量的RNA〔8〕. 但目前国内外的研究中，尚未有可以明确观察总RNA转染DCs效率的方法. 我们应用稳定表达GFP的HepG2GFP总RNA转染DCs，以GFP为标记观察总RNA转染DCs的效率，探讨其作为肿瘤疫苗的可行性，为肝癌临床治疗提供实验基础. 本试验中，HepG2GFP总RNA转染后的DCs在荧光显微镜下观察，胞质呈现绿色荧光，证实GFP mRNA可以在DCs胞质内正常表达，同时说明肿瘤细胞总RNA同样也可以在DCs胞浆内进行翻译表达. 转染后CD83，CD80，CD86，HLADR表达明显升高，IL12分泌明显增加，说明RNA转染，促进了DCs的体外成熟. 成熟DCs主要通过MHCI类途径，将肿瘤细胞总RNA在DCs胞质内进行翻译表达的肿瘤抗原呈递给T淋巴细胞. 此途径诱导的T淋巴细胞主要为CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）. 本试验中，诱导的CTL对HepG2的细胞毒效应明显高于对照组T细胞，证实诱导的T淋巴细胞为肿瘤特异性的. 因此，在当前仍未发现肝癌特异性抗原情况下，应用肝癌细胞总RNA转染DCs制备瘤苗，诱导针对肝癌细胞的多克隆CTL，可以作为肝癌DCs疫苗的一个发展方向. 【参考文献】 〔1〕 Qin LX, Tang ZY. The prognostic molecular markers in hepatocellular carcinoma 〔J〕. World J Gastroenterol, 2002, 8(3):385-392. 〔2〕 张红梅,任军,张利旺,等. 外周血造血干细胞体外定向诱导树突状细胞及功能鉴定〔J〕. 第四军医大学学报,2003, 24(1):83-85. 〔3〕 Kaplan JM, Yu Q, Piraino ST, et al. Induction of antitumor immunity with dendritic cells transducted with adenovirus vector encoding endogenous tumorassociated antigens 〔J〕. J Immunol,1999, 163(2): 699. 〔4〕 Schnurr M, Galambos P, Scholz C, et al. Tumor cell lysatepulsed human dendritic cells induce a Tcell response against pancreatic carcinoma cells: An in vitro model for the assessment of tumor vaccines 〔J〕. Cancer Res, 2001, 61(17):6445-6450. 〔5〕 Barbuto JA, Ensina LF, Neves AR, et al. Dendritic celltumor cell hybrid vaccination for metastatic cancer 〔J〕. Cancer Immunol Immunother, 2004, 53: 1111-1118. 〔6〕 Heiser A, Maurice MA, Yancey DR, et al. Induction of polyclonal prostate cancerspecific CTL using dendritic cells transfected with amplified tumor RNA 〔J〕. J Immunol, 2001, 166: 2953-2960. 〔7〕 Heiser A, Coleman D, Dannull J, et al. Autologous dendritic cells transfected with prostatespecific antigen RNA stimulate CTL responses against metastatic prostate tumors 〔J〕. J Clin Invest, 2002, 109(3):409-417. 〔8〕 Kalady MF, Onaitis MW, Emani S, et al. Dendritic cells pulsed with pancreatic cancer total tumor RNA generate specific antipancreatic cancer T cells 〔J〕. J Gastrointest Surg, 2004, 8(2):175-181.

“改革开放”这不仅仅是经济领域的专用名词，在政治、军事、文化、教育等其它各个方面都实用。特别对教育而言“改革开放”显得犹为重要。在思想上，我们必须认识到，很多自然科学是没有阶级、民族、区域之分的。“进化论”、“相对论”、“牛顿定律”等等，这些都是全人类共同的财富。同时，必须意识到，在当今知识爆炸的信息时代，旧的教育体制已经不再适应我国社会的发展，诚然在那种教育体制下，在上个世纪曾为我国培养了大批的高、精、尖的技术人才，但那已是昨日黄花了，现在是21世纪，事变时移，现在需要更大规模且能力更强的综合性人才，因此教育体制的改革迫在眉睫。 素质教育应运而生，它肩负起我国新一代教育的重任。可是，虽然“素质教育”口号喊了十几年，但什么是“素质教育”呢？假期，我进行了调查，结果令人心寒啊！ 当我问小学生什么是素质教育时，他们的回答五花八门“素质教育呀！听过，不过我也不知到是什么意思。”；“素质教育，电视里看过，就是没有家庭作业。”；“得高分，让老师、家长满意。”；大多数老师和家长都说“管它什么教育，只要考高分，准没错”。接着我对初中生进行了调查“唱歌、跳舞、打球就是素质教育”；“拉小提琴、画画，就是素质教育。”。家长却说“素质教育，电视里听说过，就是减轻学生负担吧！”；“素质教育，就是不考试的教育吗。”也许这个家长以前就怕考试吧！·那么高中又怎样呢？虽然很多高中都办了体育特长班、美术特长班、音乐特长班。不可否认这也是素质教育的体现之一。但他们的主要目的不是素质教育而是为了提高升学率，大多数高中生还是不得不在书海中遨游。有位老师说的好“无论是应试教育还是素质教育，你不能考高分，考上大学，你就别想再受教育”。 任何一种革新，它都必须依旧的体制为基础，对其进一步改进，完善，但并不能完全脱离。一旦完全脱离，就失去了基础，新的东西也只不过是空中楼阁。革新就是改掉不好的一面，追求好的一面。因此素质教育要注意以下几个误区： 一：实施素质教育，就要完全放弃应试教育。在国外，即使发达的国家（美、日、法、英、德）也都保留了笔试（这一考查手段）作为升学的重要依据。在中国就更不用说了，在没有找到一种新的考查途径之前“应试”手段在相当长的时期内还将仍然存在。直到一种能适应“素质教育”的考查手段的建立。否则，我们的教育工作就会出现混乱，就会停滞。 二：不能因为“素质教育”是为了减轻学生负担就可以不再动笔、不做作业，就可以放下书本，素质教育并不是懒人避难的港湾。该背的还是要背，该练的还是要练，毕竟，世界上没有不劳而获的东西，世界上根本就没有不看书就能成材的人。“素质教育”是为了培养更高要求的人才，并不是培养一批豪门阔少。 三：不能因为有某项特长，（比如音乐、美术、体育等）就放弃文化课，这是绝对错误的，那样只能使你四肢发达头脑简单。记住今后社会需要的是综合人才。 四：素质教育倡导德、智、体、美、劳全面发展，同时也允许有所偏重，发挥自己的特长。 五：明白理论与实践的重要性，不要因为前人实践过的就不再去做，这也是错误的，作学问就要有怀疑精神，除非自己动手否则都不要轻易相信。 六：素质教育应落实在行动上，而不仅仅是口号而已由调查可以看见，要人们从根本上接受素质教育还有很长一段路要走。 七：坚决禁止某些人，打着“素质教育”的旗号，干的却是“应试教育”的老套。 八：“素质教育”所谓的减负，并不是要求降低了，而是更加的高了，它注重学生的综合能力，创造更具有适应力的新一代人才。

对于素质教育，目前许多人仍有模糊甚至错误的认识，最有代表性、也最浮浅的一种观点是，素质教育就是德、智、体、美全面发展，就是教师要解放，学生要放松，不再坚持过去的“一切为了好成绩”就行了。其实不然，素质教育不单纯是为了打破旧的、不适合学生发展的教学模式，更重要的是为了对学生进行一种综合能力的培 养，包括言语、能力、性格、体质等多方面。它是从人本身的天赋出发，以全面发展学生的潜在素质，培养学生成为全面发展的完整人格为目的，以传输以往文化的精华和对学生进行适当的引导为操作途径的教育训练活动。 素质教育有着自己的特征。首先，它是一种个性教育。它的出发点和人的生成的出发点是一致的，即人是确定和非确定性相同的生命体，所以首先要正视受教育者具有不同的先天身心素质这个事实，在学生的教育培养活动中对学生的塑造不能完全相同。素质教育是一种针对不同个体采取不同教育方式的个性教育，只有这样才能充分的发挥学生天赋，使其得到更好的发展。其次，它是一种主题性教育。人的本质是在文化创造中不断生成的，文化也是在这个过程中不断丰富和发展的。所以，主体的创造性和主动性对于人本身和社会文化的发展都有着不可比拟的重要性。素质教育充分弘扬人的主体性，注重开发人的智慧潜能，注重形成人的精神力量。它强调学生作为教育主体的独立性和自主性，从而唤起学生的主体意识，形成学生的主动精神，帮助学生创造蓬勃向上的人生。 一提起素质教育，不少家长就想尽早为孩子培养一技之长，认为孩子拥有一技之长才能立足于社会，于是各种形式的“兴趣班”如雨后春笋。事实上，他们把素质教育与特长教育混为一谈了。社会上的特长教育着眼于传授某种系统知识，而素质教育着眼于学生能力的培养和人格的健康发展。当今社会的学习更多的是为了让孩子掌握知识的手段，而不是获得经过分类的系统知识，因为在知识经济时代，知识的更新速度极为迅速，所以，帮助孩子掌握学知识的手段，掌握科学的学习方法，比具体学一门知识更为重要和有效。素质教育把育人看成头等大事，先成人后成材。因为一个学业上的缺陷并不一定会影响他的一生，而道德、人格上的缺陷却可能贻害他的一生。因此健全的人格，良好的社会适应性是孩子们走向成功的必备素质，应避免把素质教育、特长教育简单地划上等号。 教育是人的活动，素质教育要求教育观念要转变，教育手段要更新，需要新型的师生关系与之相适应。为此，要改变学生被动地接受教育的状况，争取主动学习的机会，给学生创造一个良好的情感氛围。这样，易于师生沟通、互相了解，有助于师生共同发挥潜能，活跃思维，达到良好的教学效果。如果一位教师只知道学生的姓名，不了解其家庭、性格、习惯等，那么他就不能做到因材施教，更谈不上发挥学生的潜质了。教育任务的完成，教育目的的实现都离不开良好的师生关系。教师有爱心、热心和耐心，自然得到学生的信任和尊重，把学生当成朋友，去了解学生的内心世界，达到直线交流，发掘学生身上的闪光点，适当表扬并使其适时表现。通过谈话，集体活动等课外形式增进感情，但并非纵容学生，没有是非界线。由于学生自制力较差，所以教师要把握、调整师生关系，促进学生个性最大限度地发展。师生间的情感交流以及由此产生的心理氛围是促进师生积极互动的必要条件，教师把对学生的爱化为一个温柔的眼神、一个会意的微笑、一个体贴入微的动作，都会使学生感到老师的关心、赏识，心理上就会产生一种说不出的愉悦和满足，这无疑能促进他们积极上进，激发他们的求知欲，增添他们的勇气，鼓起他们的自信。同时教师要善于表露自己的情感，以情染情，优化学生的心情。 脱离实际需要，片面追求高分，造成高分低能，这是应试教育的后果。但素质教育也决非不要考试，而是要进一步改进和改善教育评估制度，使教育考核与评估更具科学性、合理性，更有利于学生的自我完善、自我发展，以更好地调动学生的学习主动性，使其向着自己的目标不断努力，实现自身潜在素质的最完美的展现。要在素质教育的大旗下，严格课程开设计划，抓好每一学科。要真正重视健全学校的教育教学制度，把眼光放得远一点，为学生的全面健康发展着想。学校要重视艺术类科目师资力量的培养，同时加强教育多元化建设，使素质教育形成自下而上的软硬环境。我们必须改变传统的教育观点和教学方法，将教学内容和学生创新意识的培养融为一体，这也是新教材的要求。要注重培养适应社会需要的实用型人才。教师应当充分运用各种教学手段，针对中学生的特点，尽量让教学内容具体化形象化，让教学形式丰富多彩，不断使学生提高综合素质。