草鱼的养殖论文

要注意饲料的选择，还要注意饲养的方式，注意饲养方面的情况，也要注意饲养的问题，注意饮食的搭配，要定时喂养。

一定要注意饲养的方式，注意水的干净卫生，注意光照，注意里面的氧含量，注意品种的选择，这样才可以养出味道更好的草鱼。

在饲养的时候一定要选择合适的饲料，然后也应该选择合适的养殖场，一定要及时的更换水源，还需要定期的进行打扫，做好消毒的工作，及时的去除水中的杂草。

中草药在水产养殖疾病防治上的应用前景概述萧峰西南大学11111111111 1111111摘要：用中草药防治鱼病具有价廉、绿色、环保、无残留等优点，符合无公害养殖要求。中草药的有效成分和作用机制。渔用中草药的水产养殖上存在的问题及未来的发展前景。关键词：中草药、无公害养殖、发展前景随着全球淡水资源和海洋水域环境的恶化，渔业资源量和质量持续下降，此外，水产养殖业也存在水体污染与滥用各种渔药与添加剂等情况，因而环境保护与鱼产品安全成为捆饶人类并亟待解决的问题。正如国际法院法官所说：“通观历史，人类由于经济的或其他的原因一直不断地干扰自然，由于我们的科学知识和日益认识到一欠考虑和未减缓的速度从事这种干扰对人类的危险，可持续发展概念充分表明经济发展与环境保护相协调的需要”。中国是渔业大国，水产品总量占世界总量的1/3，水产养殖量居世界首位，占全世界的2/3，2002年全国水产品总量达4570万吨，养殖量达2600多万吨，且养殖方式趋向于集约化、现代化，但是伴随经济腾飞的同时，各种弊病也接踵而至，如2006年的多宝鱼事件，鳜鱼体内的孔雀石绿残留超标等等问题的出现，让人们更重视食品的安全，自身的健康，不仅如此，抗生素等药物导致的一系列副作用也严重影响着我国水产品的出口，如1998年和1999年的中国出口日本的部分鳗鱼因药物残留超标而被退货，2002年中国出口给欧盟的小龙虾因检出氯霉素而被退货。水产品被拒事例既给国家带来了经济损失，同时也损害了中国水产品的国际形象。1、 中草药的发展随着绿色无公害养殖技术的推广，使水产养殖业健康、可持续发展，开发毒副作用小，无残留，病原体不易产生抗药性的中草药成为当前水产药物研究的重点，在养殖和饲料中使用中草药具有许多化学物质不能媲美的优点，既能改善水体环境，提高药效，控制病原微生物，从而减少疾病的发生，近年来，中草药制剂得到了日益广泛的应用，有望成为将来水产养殖病虫害防治的一个新方向。2、 中草药的有效成分和作用机制 总草药的有效成分中草药是中药和草药的总称，重要是中医常用的药物，草药是指民间所应用的药物，是一种理想的天然、环保的绿色药物，其来源广，成本低，同时其疗效慢，作用时间长。中草药的化学成分极为复杂，一种中草药中往往含有多种化学成分，一般来说，除含有免疫物质外，还含有一些未知促生长活性物质及一定量的蛋白质、氨基酸、糖类、矿物质、维生素、脂肪、植物色素等。这些成分可增强食欲，促进机体代谢和消化酶的分泌，提高营养物质的利用率，从而加速水产动物的生长发育，增强其体质，进而提高机体的免疫力和抗应急能力，降低饲料系数，改善水产品品质。根据中草药添加剂饲喂黄颡鱼试验表明，黄颡鱼在在食用了中草药添加剂后，不仅增重效果明显，而且经济效益高，尤其是当党参，甘草等回味中草药的组成，不仅增重比例高出饲料系数降低了.，蛋白质效率也提高了。增重率=（试验终末重—初始重）/初始重*100%饲料系数=饲料摄食量/净增重蛋白质效率=（试验终末重—初始重）/（总投饲量*饲料中蛋白质的含量）*100%而且益气补血，保肝利胆，清热解毒的作用。 中草药的作用机制中草药提取于自然并保存了其自然结构和生物活性的天然物质，已具有多种营养成分和生物活性物质，低残留、毒副作用小、多功能性、能全面调解机体的生理功能，兼具营养物质与药物的双重作用。其含有的免疫活性物质是多糖、有机酸、疳类，生物碱及其一些挥发性物质，但每一种有效成分对肌体的免役系统的调节方式都不一样，多糖具有刺激网状内及系统，诱导淋巴细胞，脾脏细胞再生，增加巨噬细胞的功能，提高从细胞杀伤活力，诱导产生干扰素等作用，能提高机体的免疫反映能力，有机酸能增强巨噬细胞的吞噬功能，增强机体的免疫功能。疳类可诱导细胞产生干扰素、白细胞介素-Ⅱ及淋巴毒素，增加体细胞的数量，提高巨噬细胞的吞噬功能，大多数清热解毒类中草药含有的生物碱、黄酮、香豆精等抑制或杀灭病原微生物，黄连素可与DNA形成复合物，抑制DNA合成，黄酮能影响细菌的呼吸，抑制起RNA的合成。金银花可作用于细菌的细胞壁，抑制细胞壁的合成，黄芪可刺激细胞产生干扰素，直接抑制或破坏病菌的繁殖能力。作为免疫增强剂，中草药在水产动物机制处于病理状态时还具有双向的调节作用，双向调节作用是指对同一器官组织的不同功能状态（促进和抑制）均衡调整，直至起正常为止，即时于亢进的状态，同时对其进行抑制直至降低至最低水平，既可使异常高的DNA合成亢进状态降低至生态状态，又可将DNA的合成抑制状态调至兴奋，直至处于正常状态，这是中草药的多功能性的独特表现之一，每种中草药均含有多种成分，其中有的含有对某一器官组织起兴奋的作用，又有对这一器官起抑制作用的成分，虽然有的中草药含有二种作用相反的成分，但有的成分对某器官组织的不同系统进行调节，起到反向的调节作用。.防治水产养殖疾病的几种常用的中草药大黄。又名锦纹、黄良，别名将军、生军、马蹄黄等，系多年生草本植物，以根及根状茎入药。本品抗菌作用强，抗菌谱广，其有效成分为蒽醌衍生物，其中以大黄酸、大黄素及芦荟大黄素的抗菌作用最好，有收敛、泻下、增加血小板、促进血液凝固等作用。用于烂鳃病、出血病及白头白嘴病等。使用方法：全池泼洒，常用量为～，临用前，先将池水需用的大黄量，用的氨水按1∶20比例，在室温浸泡下经12～24小时，取药液均匀洒入水中，可有效防治鱼粘细菌病。本品与硫酸铜合用，即大黄1～与浓度的硫酸铜联用，可提高疗效。内服，5～10克/公斤体重鱼，大黄碾成细粉末混入饲料内，每天1次，连用3天，可防治粘细菌病；连用7天，再泼洒硫酸铜()，对草鱼出血病效佳。也可按每公斤鱼重用大黄、克黄柏、1克黄芩、5克食盐与饵料混匀制成药饵投喂， 每天1次，连服3天。此外，肠炎病、细菌性烂鳃病、白头白嘴病也可用大黄治疗，有一定效果。 大蒜。为百合科、葱属植物，以鳞茎入药，具特异的辛辣味和蒜臭，其有效成分为大蒜类。大蒜素具有广谱抑菌止痢、驱虫及健胃作用，常用于防治鱼类肠类病。使用方法：每100公斤鱼用大蒜～1公斤拦入饲料中投喂，6天为一疗程，若加入等量食盐，可提高其作用，用于防治烂腮病、肠炎病；取大蒜晒干加水煎汁，以 10～30ppm浓度浸洗鱼体1小时，可杀死锚头鳋，防治鲤鱼竖鳞病。.地锦草。红茎草，为大戟科一年生草本，折断茎杆后有乳白色奶汁状液体流出。地锦草含黄酮类化合物及没食子酸，有较强的抑菌作用，抑菌谱较宽，并有止血和中和毒素的作用。主治鱼类肠炎、烂腮病。使用方法：每100公斤鱼用干地锦草500克(或鲜地锦草2000～2500克)煮汁，连渣拦入饵料中投喂，一日二次，3天为一疗程。 在投药前，用20ppm石灰乳全池泼洒，疗效更佳。.水菖蒲。名水敛草、石菖蒲、石蜈蚣、 白菖蒲，系多年生草本。 本品含芳香挥发油～，油中主要为油辛醇、细辛酸、甲基丁香酚、倍丰萜烯类等，含有非结晶性苦味。可防治肠炎、赤皮、烂腮、水霉病等。使用方法：每亩水深1米，用切碎的菖蒲4～5公斤，用蓖麻叶4～5公斤，裹在10公斤左右的松树叶上，扎成 2～3捆，放置于食场及上风口进水处， 浸没在水中，每天翻动一次，促使其腐烂。每亩水深1米的水体用菖蒲～公斤，加食盐～1公斤，全池遍洒，可治愈水霉病。.苦楝。名楝树，为楝科落叶乔木，高15～20米。喜野生于田野、林边等处，本品含川楝树、生物碱、岩藻糖、萘酚等，有杀虫、杀菌作用，用于防治寄生虫性鳃病，以及锚头鳋、中华鳋、毛细线虫、车轮虫、隐鞭虫病等。使用方法：每亩水深1米用马尾松、苦楝树叶、皮或果各10～公斤，切碎熬汁成12～25公斤，全池遍洒，每日一次，连用2～3天。 取苦楝树枝叶30～40公斤，直接在池中堆沤，5～7天后捞出残渣，能有效防治上述各病。3. 6.五倍子。又名倍子、百药煎、百虫仓等，为漆科植物盐肤本的叶上的干燥虫瘿， 由五倍子的蚜虫寄生而成，含大量鞣酸，能凝固蛋白质，有较强的杀菌能力，对革兰氏阳性和阴性细菌均有抑制作用，用于防治白头白嘴病、粘细菌病、气单胞菌病、假单胞菌病、白皮病、赤皮病、疖疮病等。使用方法：先将五倍子捣碎，用开水冲溶，全部溶解后，用池水稀释全池泼洒，常用量为2～4ppm。.乌桕。名油子树、白乌桕、木梓树等，为落叶乔木。其果、叶有拔毒消肿和杀菌作用，常用于防治细菌性烂腮病、白头白嘴病等。使用方法：每50公斤鱼，用乌桕叶干粉250克混入饵料中制成药饵投喂，连喂3～6天，可防治鱼烂腮病；也可用干叶粉按4ppm计算药量，兑20倍饱和的石灰水液，浸泡6～12小时后，全池泼洒。.黄芩。为唇形科植物黄芩的根，有粘毛黄芩、滇黄芩、川黄芩、丽江黄芩、甘肃黄芩等，含黄芩素、黄芩甙、汉黄芩素、黄芩新素等5种黄酮成分。此外，尚含β-谷甾醇、苯甲酸、黄芩酶等。黄芩有抗炎、镇静、抗菌性病毒的作用。主要用于防治烂腮、疖疮、打印病、出血性败血症、肠炎病、尾柄病等。使用方法：取黄芩粉碎成细粉，按5%的比例加入饵料中自由投喂，5天为一疗程；或将黄芩切细加水浸泡24小时后，煎煮三次，使水溶液浓度为1%，全池泼洒，一日一次，连用3天。、黄连。又名鸡爪连、川连、味连、土黄连，多年生草本植物。以根状茎入药，有抑菌、消炎、解毒功能，主要用于防治细菌性肠炎。、黄柏。又名案木、聚皮、元柏，落叶乔木。以树皮入药，有抑菌、解毒、消肿、止痛等功能，可防治草鱼出血病和细菌性鱼病。用法是将干的黄柏、黄苓、黄连、板蓝根和大黄（合用和单用均可），每千克鱼五克，打成粉后拌盐五克，投喂或制成药饵，每天一次，连喂7天。 生姜。姜科， 多年生草本，高40到100cm，含姜醇、姜烯等挥发油，性微温，味辛，具有杀菌、解毒、杀虫和消炎的作用。将姜汁涂抹于鱼体伤口处即可。 芦苇。 多年高大草本，有清热、利尿、消炎的功效，可防治草鱼肠炎病，按每万尾鱼种用芦苇根5千克，加大蒜千克和食盐千克。打成浆。拌喂或制成药饵，每天2次，连喂4-6天。4、中草药在养殖上存在的问题 中草药本身含有多种有效成分，它对水生动物的免疫增强效果是多种成分综合作用的结果，且不同地区，不同季节和不同时期采集的中草药，其有效成分相差很大，而且对其产品难以进行准确的药萧评价和质量控制。目前尚无严格的质量控制标准。很难保证生产出质量稳定的定型产品， 科技含量低 目前绝大多数中草药，无论是单味还是复味，仍停留在原始的散剂和煎剂上，精制品少，因此产品科技含量不高制约了他向更高层次的发展。 中草药的作用机理的研究大多用传统的中医理论，远远不能解释真正的作用机理，因而有研究一般只限于对中草药饲料效果进行评价，探讨其对水产动物的增重，抗病等方面的影响，而没有深入到其对水产品品质的研究，这还有待于进一步的研究。5.中草药的水产养殖上的应用前景随着水产养殖业的迅速发展，特别是名、特、优水产品的养殖日益增加，中草药也符合人们的安全和环保要求，所以中草药运用也越来越多，今后运用中草药应针对适应水生动物特点，研究药物的离子通道、作用机制、运转规律、转化过程及药物结构和药效关系等，尽快搞清鱼药和中草药的水生动物作用中的吸收、分布很转化和排泄规律及药物对环境规律的影响，提出在重要养殖水产品体内的掺留期及残留量，制定水产品上市前的保留期，研究制定使用方法，随着绿色无公害水产品养殖的推广，对防治有效的绿色中草药的研究必然会越来越多，中草药成为中国的传统魂宝将会成为防治鱼病的主要药物，也必然会走向世界。参考文献1. 李登来 水产动物疾病学 中国农业出版社 2004（5）31-442. 魏清和 水生动物营养和饲料学 中国农业出版社 2004（5）3. 王权 谢献胜 中草药在水产养殖疾病防治上的运用 水产科技情报 2006（4）163-1684. 胡梦红 抗生素在水产养殖上的运用 水产科技情报2006（5） 217-2215. 刘玉林 周永奎 诱食剂在水产饲料中的运用 淡水洋鱼2006（7）62-636. 褚小林 渔业生态标签制度及其启示 水利渔业 2006（5）60-627. 田海军 郑阳 渔用中草药复方疗效等研究概述 水利渔业 2006（6）78-1008. 孙克年 用林产重中药防治鱼吓鱼病 养殖与饲料 2006（9）22-249. 韩庆 马雨林 不同中草药添加剂饲喂黄颡鱼试验 养殖与饲料 2006（12）54-5610. 曹克驹 名特优水产动物养殖学 中国农业出版社 2003（12）

多子小瓜虫感染后草鱼TLR信号通路基因的表达动态2019-12-08农业科技摘要：【目的】明确草鱼Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)信号通路基因在防御多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)感染过程中的免疫作用，为有效防控鱼类多子小瓜虫感染提供理论参考。【方法】以多子小瓜虫感染草鱼后，采用实时荧光定量PCR检测分析在不同时间点(感染后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d)草鱼部分TLRs基因(TLR1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接头蛋白基因(MyD88和TRIF)、信号转导分子(IRAK4和IRAK1)及细胞因子(IL-1β、TNF-α和IFN)在其皮肤和脾脏中的表达动态变化。【结果】草鱼感染多子小瓜虫后，TLR1、TLR2、TLR9、TLR20和TLR21基因在皮肤和脾脏中的表达主要呈上调趋势，TLR4基因在皮肤中主要呈上调表达，在脾脏中则主要呈下调表达;TLR信号通路接头蛋白基因MyD88和TRIF的表达变化趋势明显不同，其中，MyD88基因的表达在感染后第1～3 d均呈显著上调趋势(P<，下同)，而TRIF基因的表达在整个试验过程中绝大多数时间点与对照组无显著差异(P>);IRAK4和IRAK1在皮肤和脾脏中的表达也主要呈上调趋势，但在脾脏中IRAK4在感染后第1 d和IRAK1在感染后第6 h的表达呈显著下调趋势;IL-1β和TNF-α在绝大多数时间点均显著上调，但IFN的表达基本没有变化。【结论】草鱼TLR信号通路中的部分TLRs基因(TL1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接头蛋白基因(MyD88)、信号转导分子(IRAK4和IRAK1)及下游细胞因子(IL-1β和TNF-α)均参与防御多子小瓜虫感染的免疫反应，尤其是在感染早期和中期发挥关键作用。关键词： 草鱼;多子小瓜虫;Toll样受体(TLR);信号通路;基因表达引言【研究意义】Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)属于I型跨膜蛋白，是一类重要的模式识别受体，能特异性识别病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，并通过募集接头蛋白、转导信号及诱导炎性细胞因子等表达而发挥免疫防御作用，既是机体的第一道天然屏障，也是连接先天性免疫和获得性免疫的重要桥梁(何玉洁和潘建平，2017)。因此，研究TLR信号通路基因在病原感染过程中的表达动态，对揭示病原和鱼类间的免疫互作机制及制定有效的防控措施具有重要意义。【前人研究进展】依据接头蛋白的不同哺乳动物TLR信号通路可分为髓系分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)依赖型和β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR domain-containing adaptor-inducing IFN-β，TRIF)依赖型(Yuk and Jo，2011)。TLRs在识别相应的PAMPs后，除TLR3外，其他TLRs均以MyD88为接头蛋白，然后招募白细胞介素-1受体相关激酶4(IL-1 receptor-associated kinase 4，IRAK4)和IRAK1，再将信号转导给肿瘤坏死因子受体相关因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)，TRAF6与转化生长因子β活化激酶1(Transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1)及其结合蛋白(TAK1-binding proteins，TABs)TAB1和TAB2组合成复合物，从而激活下游的NF-κB和AP-1等转录因子，诱导免疫因子表达，最终启动免疫防御反应(Jiménez-Dalmaroni et al.，2016)。其中，TLR2和TLR4识别细菌的脂肽和脂多糖等;TLR3识别病毒的双链RNA;TLR5识别细菌的鞭毛蛋白;TLR7和TLR8识别病毒的单链RNA;TLR9识别非甲基化的CpG-DNA(Tan and Kagan，2017)。目前，有关TLRs与寄生虫感染的相关性研究仍较少，仅发现TLR2或TLR4可识别利什曼原虫(Leishmania major)(Bec-ker et al.，2003)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)(Debierre-Grockiego et al.，2007)和恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)(Zhu et al.，2011)的糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol，GPI)锚定蛋白;TLR9可识别克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)非甲基化的DNA(Bafica et al.，2006);TLR11能识别刚地弓形虫的Profilin-like蛋白(Yaro-vinsky et al.，2005)等。至今，已在哺乳动物中发现15种TLRs，而从鱼类中至少鉴定出20种TLRs(范泽军等，2015)。针对鱼类的研究主要集中在TLRs与细菌或病毒感染的相关性方面(Liao et al.，2017)。Li等(2011a，2011b，2012，2016)研究发现，斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)的TLR2、TLR9、TLR21、MyD88及IRAK1等广泛参与抵御刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)感染的免疫反应，表明鱼类TLR信号通路基因在防御寄生虫的感染过程中发挥重要作用。【本研究切入点】多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)是一种广泛分布的纤毛类寄生性原虫，几乎可感染全部淡水鱼类，引起小瓜虫病(俗称白点病)，导致鱼类死亡或引起细菌、病毒等继发性感染，而造成巨大的经济损失(宋飞彪等，2012;赵飞等，2012)。草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国最重要的水产养殖鱼类之一，约占淡水鱼总产量的20%，但草鱼养殖一直深受小瓜虫病困扰。早期研究发现，草鱼的TRAF6、TAK1、TAB1和TAB2及斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的TLR1、TLR2、TLR9和TLR21等TLR信号通路基因参与了抵御多子小瓜虫感染的免疫应答(Zhao et al.，2013a，2013b，2014)，但草鱼TLR信号通路其他基因是否参与并发挥防御多子小瓜虫感染作用等机理尚不清楚。【拟解决的关键问题】以多子小瓜虫感染草鱼后通过实时荧光定量PCR检测分析草鱼的部分TLRs(TLR1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接头蛋白(MyD88和TRIF)、信号转导分子(IRAK4和IRAK1)及细胞因子(IL-1β、TNF-α和IFN)在其皮肤和脾脏中的表达动态变化，明确草鱼TLR信号通路基因在防御多子小瓜虫感染过程中的免疫作用，为有效防控鱼类多子小瓜虫感染提供理论参考。1 材料与方法1. 1 试验材料草鱼购自广东省佛山市某养殖场，健康活泼，规格整齐，体重约50 g/尾，在养殖过程中未感染过多子小瓜虫。随机挑取10尾草鱼，镜检鱼鳃和体表均未发现多子小瓜虫或其他寄生虫。草鱼在实验室内的循环流水养殖箱中暂养2周，氧气充足，水温控制在(23±1)℃，每日定时投喂商品饲料2次。多子小瓜虫从患病草鱼上分离获得，采用农业农村部渔用药物创制重点实验室建立的以斑点叉尾鮰为宿主的室内传代系统进行保种传代(Zhao et al.，2013a，2013b，2014)。1. 2 多子小瓜虫幼虫准备在多子小瓜虫传代过程中将体表已显现白点的斑点叉尾鮰置于5 L的塑料烧杯中，发育成熟的包囊将从鱼体上自动脱落，分别用孔径250和75 μm的网筛过滤、收集包囊。将包囊轻轻洗净后转入1 L的玻璃烧杯中，添加少量无菌水，23 ℃孵化20 h即发育成幼虫，再以孔径40 μm的网筛过滤，得到活体幼虫滤液。取10份10 μL的幼虫滤液，显微镜下观察计数，换算出总滤液中的多子小瓜虫活体幼虫数量，用于后续的草鱼感染试验。1. 3 感染试验将120尾草鱼随机平均分成感染组和对照组。感染组的60尾草鱼置于60 L的水桶中，按1∶10000的感染剂量加入多子小瓜虫活体幼虫进行体表感染，感染2 h后将草鱼转至250 L的鱼缸中。采用相同方法处理对照组的60尾草鱼，但不添加多子小瓜虫幼虫。于感染后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d时分别从感染组和对照组随机取样6尾草鱼。以灭菌刀片刮去草鱼背部中央的鳞片，使用尖头镊子剥离 cm× cm大小的皮肤，轻轻刮除皮肤内侧肌肉以得到干净的背部皮肤，液氮速冻后-70 ℃保存备用。同时快速采集脾脏冻存备用。1. 4 总RNA提取及cDNA合成采用TRIzol试剂盒(Invitrogen公司)提取草鱼皮肤和脾脏组织的总RNA，以Nanodrop 1000微量紫外分光光度计(Thermo公司)和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。使用RNase-free DNase I(Fermentas公司)去除基因组DNA后，按ReverTra Ace@ Reverse Transcriptase试剂盒(TOYOBO公司)说明反转录合成cDNA，反应程序：42 ℃ 20 min;99 ℃ 5 min;4 ℃ 5 min。合成的cDNA置于-20 ℃冰箱保存备用。1. 5 目的基因片段克隆及测序分析采用Beacon Designer 设计草鱼TLR信号通路基因的特异性引物(表1)。以草鱼脾脏cDNA为模板进行目的基因PCR扩增，反应体系 μL：cDNA模板 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 μL，10×PCR Buffer(Mg2+) μL，dNTP Mixture( mmol/L) μL，rTaq DNA聚合酶 μL，ddH2O μL。扩增程序：95 ℃预变性2 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，进行35个循环;72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，采用 Gel Extraction Kit(OMEGA公司)进行目的条带回收纯化，然后TA克隆至pMD18-T载体上，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。取 μL菌液凃布于含氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB培养基上，37 ℃培养过夜，挑选3个菌落PCR验证呈阳性的克隆送至广州艾基生物技术有限公司测序。1. 6 实时荧光定量PCR检测分析采用实时荧光定量PCR检测感染多子小瓜虫后草鱼皮肤和脾脏组织中TLR信号通路基因的表达动态，以每个时间点各组织的cDNA为模板、β-action为内参基因，在Roche LightCycler480 Real-time PCR Detection System上进行定量检测分析。反应体系 μL：cDNA模板 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 μL，SYBR Green Real-time PCR Master Mix μL，ddH2O μL。每个样品均设3个重复。扩增程序：95 ℃预变性30 s;95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，进行40个循环，每个循环结束时采集1次荧光信号。采用2-△△Ct法(Livak and Schmittgen，2001)计算目的基因的相对表达量，并以SPSS 进行统计分析。2 结果与分析2. 1 感染多子小瓜虫后草鱼TLRs基因表达的动态变化2. 1. 1 TLR1和TLR2基因的表达动态 草鱼感染多子小瓜虫后，其皮肤和脾脏的TLR1和TLR2基因表达主要呈上调趋势(表2)。在感染后第12 h，TLR1基因在皮肤中开始显著上调表达(P<，下同)，是对照组的倍，至感染后第1和2 d持续上调至对照组的和倍;在脾脏中，TLR1基因在感染后第2和3 d时分别上调和倍，在其他时间点与对照组间无显著差异(P>，下同)。TLR2与TLR1基因的表达变化相似，在皮肤中表现为感染后第1～3 d均显著上调，于感染后第3 d达峰值，为对照组的倍;在脾脏中表现为感染后第2和3 d显著高于对照组，分别是对照组的和倍。2. 1. 2 TLR4基因的表达动态 草鱼感染多子小瓜虫后，TLR4基因在其皮肤和脾脏中的表达变化趋势不同(表2)。在皮肤中，TLR4基因在感染后第12 h上调为对照组的倍，但至感染后第1 d回落到对照组水平，随后其表达又逐渐上调，于感染第3 d达峰值(倍)。而在脾脏中，TLR4基因在感染后第12 h和第1 d的表达量显著下调，仅为对照组的35%和25%;在其他时间点与对照组间均无显著差异。2. 1. 3 TLR9基因的表达动态 草鱼感染多子小瓜虫后，其皮肤中的TLR9基因在感染后第2、3和7 d均呈显著上调表达，于感染后第3 d达峰值(倍);而在脾脏中，TLR9基因除在感染第1 d显著上调倍和感染后第3 d显著下调39%外，其他时间点与对照组间均无显著差异(表2)。推荐阅读：农业经济类论文发表sci难

在饲养的时候一定要选择合适的肥料，然后也应该及时的进行更换水源，还需要及时的去除水中的一些杂草，保持水源的干净卫生，需要学习专业的饲养技术，一定要把蚕豆洗干净再喂养，做好防病的工作。