斑马鱼研究的贡献与意义论文

在国际上，斑马鱼模式生物的使用正逐渐拓展和深入到生命体的多种系统（例如，神经系统、免疫系统、心血管系统、生殖系统等）的发育、功能和疾病（例如，神经退行性疾病、遗传性心血管疾病、糖尿病等）的研究中，并已应用于小分子化合物的大规模新药筛选。我国开展斑马鱼相关的研究无论在规模还是在重视程度上都远远落后于国际形势发展的需要。推动和发展斑马鱼模式生物在我国生命科学研究中的广泛使用是本中心的宗旨。在国家科技部重大科学研究计划的支持下，我们汇集优势，整合我国现有的斑马鱼主要研究力量，在未来几年内逐步建立全国共享的斑马鱼模式动物研究技术和资源库，向国内同行提供斑马鱼资源、信息和技术支撑。本着提高服务效率和质量为原则，我们在上海和北京分别建立国家斑马鱼模式动物南方中心和北方中心。南方中心依托于中国科学院上海生命科学研究院，北方中心依托于北京大学和清华大学。两个中心本着优势互补的原则，共同开发研究技术和资源，以辐射状向国内研究人员提供服务，积极推进我国斑马鱼相关科学研究。主要技术和资源服务内容： 斑马鱼基因表达分析服务：包括抽提斑马鱼基因组DNA和总RNA，核酸原位杂交探针制备和纯化，全胚胎原位杂交技术，显微注射技术，基因过表达（over-expression）和基因下调（morpholino knockdown）技术 斑马鱼转基因技术服务：包括各类斑马鱼非特异性和组织特异性启动子的克隆，基因组BAC文库筛选与修饰，基于Tol2转座子的转基因质粒的构建，以及子一代转基因系的筛选和保存 斑马鱼基因功能活体检测服务：包括清醒斑马鱼在体共聚焦/双光子显微镜成像技术和在体电生理记录技术 动物行为范式分析服务：包括感觉相关的应激行为、视觉运动行为、学习记忆行为和药物成瘾行为等 斑马鱼基因突变技术服务：包括插入诱变和ENU化学诱变技术。 斑马鱼转基因资源库和突变体资源库服务：包括研制、收集和分发各种斑马鱼转基因品系和突变体 信息服务：包括建立斑马鱼资源信息网络数据库和提供斑马鱼基因组生物信息学分析服务。 转基因斑马鱼的制备主要采用两种方法：通过Tol2转座子构建组织特异性表达报告基因的方法；利用特定基因的启动子/增强子驱动报告基因在特定细胞组织中表达的方法。首先构建以Tol2转座子为基础的enhancer trap载体，报告基因选用GFP或RFP，最小启动子来自斑马鱼gata2基因；将上述载体与体外转录得到的Tol2转座酶的mRNA共同注射到斑马鱼的单细胞受精卵中，受精卵长大后成为founder；Founder外交（out-cross）得到F1代胚胎，从中挑选出对于报告基因具有组织特异性表达模式的胚胎，拍照记录后分类培养；F1长大后通过linker-mediated PCR的方法鉴定对应于GFP（或RFP）表达图式的Tol2插入位点，并通过与已知基因组数据比较，对插入位点进行定位与分析；通过外交纯化得到转基因鱼，直至得到只含有单个插入品系的转基因鱼。通过克隆特定基因的启动子/增强子或BAC修饰法构建在特定组织器官或特定胚胎发育阶段表达报告基因的转基因品系。BAC方法如下：在斑马鱼基因组计划网站上通过BLAST将感兴趣的基因定位到已知的contig上，并通过contig信息寻找包含所选基因的BAC ID号；通过同源重组的方法对上述BAC克隆进行修饰，将报告基因引入原有的BAC克隆；将修饰过的BAC克隆通过显微注射的方法引入斑马鱼受精卵，连续观察并挑选具有特异表达模式的转基因鱼；将上述成鱼外交得到F1代，在F1代中筛选具有特异表达模式的成鱼，即得到所需的转基因品系。

斑马鱼是一种常见的热带鱼。 斑马鱼体型纤细，成体长3～4cm，对水质要求不高。孵出后约3个月达到性成熟，成熟鱼每隔几天可产卵一次。卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。发育温度要求在25～31℃之间。斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育，且具许多优点，吸引了众多研究者的注意。经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库里有相关的资料可供查询和下载，方便了研究。斑马鱼的细胞标记技术、组织移植技术、突变技术、单倍体育种技术、转基因技术、基因活性抑制技术等已经成熟，且有数以千计的斑马鱼胚胎突变体，是研究胚胎发育分子机制的优良资源，有的还可做为人类疾病模型。斑马鱼已经成为最受重视的脊椎动物发育生物学模式之一，在其它学科上的利用也显示很大的潜力。由于斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此它受到生物学家的重视。因为斑马鱼的胚胎是透明的，所以生物学家很容易观察到药物对其体内器官的影响。此外，雌性斑马鱼可产卵200枚，胚胎在24小时内就可发育成形，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验，进而研究病理演化过程并找到病因。斑马鱼由于养殖方便、繁殖周期短、产卵量大、胚胎体外受精、体外发育、胚体透明，已成为生命科学研究的新宠。全球范围内有超过1500个斑马鱼实验室。利用斑马鱼，可以研究生命科学的基础问题，揭示胚胎和组织器官发育的分子机理；可以构建人类的各种疾病和肿瘤模型，建立药物筛选和治疗的研究平台；可以建立毒理学和水产育种学模型，研究和解决环境科学和农业科学的重大问题。目前我国有250个以上的实验室利用斑马鱼开展相关科学研究。为进一步加强国内斑马鱼研究人员之间的交流，在2011年广州举办的第二届全国斑马鱼研讨会上，包括孟安明院士在内的全国斑马鱼研究学术集体商定，今后的全国性斑马鱼会议采取“PI大会”和“研究大会”的形式交替隔年举行，并决定自2012年起固定在水生所召开“全国斑马鱼PI大会”。第三届全国斑马鱼研究大会将于2013年10月11日至14日在苏州福朋酒店（江苏省苏州市工业园区月亮湾路8号）举行，并由全国斑马鱼研究联盟主办，苏州大学生物钟研究中心承办。 2012年10月10日至12日，第一届全国斑马鱼PI大会在中国科学院水生生物研究所召开。国家斑马鱼资源中心第一届理事会名誉理事长朱作言院士、理事长孟安明院士、国家自然科学基金委员会生命科学部谷瑞升处长，以及来自中国大陆、香港、台湾和美国等地的斑马鱼相关科研人员共90余人参加了本次大会。大会开幕式由孟安明院士主持。朱作言院士介绍了国家斑马鱼资源中心成立的背景及有关情况。水生所所长赵进东院士致欢迎辞。国家斑马鱼资源中心主任孙永华研究员作中心建设进展报告，并介绍了国家斑马鱼资源中心揭牌仪式暨理事会成立大会的相关情况。本次大会共分为六场报告，37个口头报告。美国加州大学洛杉矶分校的林硕教授作了有关利用斑马鱼构建亨廷顿舞蹈症模型的大会特邀报告。其他研究者分别从早期发育、信号通路、器官发育、疾病模型、环境健康等方面研讨了斑马鱼研究领域的最新进展。 我国现有250多个实验室利用斑马鱼开展相关科研工作，全国斑马鱼研究学者一致呼吁尽快在水生所建立国家级的斑马鱼资源中心，以将国内各位学者构建和保存的各类斑马鱼突变株、转基因品系，以及工具质粒、抗体等集中储存，供国内同行分享，以优化资源、避免重复，促进国内斑马鱼研究的发展和壮大。水生所于2011年初启动斑马鱼资源中心的建设，先后获得了科技部国家重大科学研究计划和中科院重点部署项目的重点支持。此次国家斑马鱼资源中心揭牌成立对于我国斑马鱼研究具有标志性意义。2012年10月10日上午，国家重大科学研究计划斑马鱼资源中心（即国家斑马鱼资源中心，China Zebrafish Resource Center）揭牌仪式暨理事会成立大会在中国科学院水生生物所举行。朱作言院士、孟安明院士、科技部基础司司长张先恩及处长傅小锋、湖北省科技厅厅长刘传铁、中科院武汉分院党组书记陈平平、中科院生命科学与生物技术局副局长苏荣辉、国家自然科学基金委生命科学部处长谷瑞升等有关领导及相关高校和科研单位的专家，以及水生所所长赵进东院士、党委书记兼副所长胡征宇研究员、副所长徐旭东研究员等参加了揭牌仪式。揭牌仪式由徐旭东副所长主持，所长赵进东院士致欢迎辞。名誉理事长朱作言院士宣布国家斑马鱼资源中心理事会成立，并介绍了国家斑马鱼资源中心筹建的相关情况及理事会成员。理事会成员孟安明院士、刘传铁厅长、苏荣辉副局长、张先恩司长分别发言。有关领导分别代表科技部基础司、国家自然科学基金委生命科学部、中科院生物局、湖北省科技厅为国家斑马鱼资源中心揭牌。同时，由朱作言院士任名誉理事长、孟安明院士任理事长的国家斑马鱼资源中心第一届理事会成立，并召开第一届理事会第一次会议。会议由理事长孟安明院士主持，国家重大科学研究计划项目首席科学家彭金荣教授和中心主任孙永华研究员分别向会议作报告。会议审议通过了《国家斑马鱼资源中心章程（试行）》。中心定位为在科技部国家重大科学研究计划支持下建立的非营利性科研服务性机构，中心以斑马鱼研究资源的收集、创制、整理、保藏和分享为主要任务，以服务于全国斑马鱼研究学者为主要宗旨。

斑马鱼是一种常见的观赏性热带鱼，有着娇小可爱的身躯，斑马鱼体长约3-4厘米，由于身上带有的美丽的蓝色条纹而得名。除了具有观赏价值外，斑马鱼在科学研究中也起着非常重要的作用。

图1：雌性斑马鱼（下）与雄性斑马鱼（上）

斑马鱼对早期发育研究的贡献

斑马鱼喜欢生活在温度为℃的水里。斑马鱼在出生后3个月左右达到性成熟，在性激素与光线的刺激下，雄性斑马鱼会猛烈的追求雌性斑马鱼，然后两者分别将精子与卵子排放在水里，精子与卵子在水中可以激活从而结合在一起形成受精卵，之后受精卵逐渐发育成胚胎并进一步长成成体斑马鱼。受精卵主要由外面的卵膜与胚胎构成，卵膜主要起到保护胚胎的作用，胚胎中的卵黄含有丰富的营养物质，胚胎在早期发育过程中主要靠卵黄的营养物质发育长大。斑马鱼一周可以交配一次，一次可以产200-300枚胚胎。斑马鱼的胚胎是透明的而且很大且发育很快，因此深受发育生物学家的喜爱，因为不需要非常复杂的设备就可以直接观察胚胎的早期发育过程。

图2：斑马鱼胚胎观察

虽然斑马鱼与人类再外形上有着巨大的差别，然而在DNA 层面上斑马鱼与人类有着90%的保守性，因此通过研究斑马鱼可以帮助我们了解人类早期发育的秘密。通过对斑马鱼胚胎的研究，我们知道了很多决定早期胚胎发育的基因，并且在人类的很多疾病中发现了这些基因发生了突变，了解到这些基因后，可以有效地对未出生的婴儿进行产前检测，并进一步找到预防与治疗的方法。

图3：斑马鱼的发育模式图

斑马鱼在基因功能研究中的作用

斑马鱼的胚胎体积较大，可以很方便的对其进行操作，比如我们利用特定的技术手段可以实现在斑马鱼体内敲除或者过表达某一个基因从而研究这个基因的功能。当某一个基因突变以后这个基因由于DNA 序列发生了改变而使得这个基因表达的蛋白功能丧失。突变体是研究这个基因功能最有效地方式之一。当某一个基因突变后我们可以通过观察个体发育的形态变化或者利用其他检测手段比如高通量测序的方法检测其影响的所有其他基因的表达变化从而得出这个基因在生物体中的功能。转基因技术是研究基因功能的另一个重要的手段。我们常常会将某一个基因的启动子序列带有某种颜色的荧光蛋白串联表达，通过观察荧光蛋白的表达模式可以直观的看到这个基因在体内的表达分布情况，或者其他功能性研究。

图4：神经相关蛋白的表达模式

斑马鱼在肿瘤研究中的作用

肿瘤是在人身体内产生的一团具有恶性增值能力的细胞团，是人类健康的最致命的杀手之一，长期以来人们对肿瘤研究投入了巨大的精力物力但收效甚微。由于肿瘤常常发生在体内，因此很难直接的观察它们的发生与成长的过程。斑马鱼为我们提供了一个直观的研究手段。我们可以将带有荧光标记的人类的肿瘤细胞移植到斑马鱼的体内，由于肿瘤发生在体内，因此很难直接的观察它们的发生与成长的过程。斑马鱼为我们提供了一个直观的研究手段。我们可以将带有荧光标记的人类的肿瘤细胞移植到斑马鱼的体内，由于肿瘤发生所需要的蛋白因子在斑马鱼体内同样存在，肿瘤细胞可以在斑马鱼体内正常的生长，鉴于斑马鱼的全身透明性，因此我们可以非常直观的去观察肿瘤的发生发展过程。

图5 肿瘤细胞（红色）在斑马鱼（绿色）体内生长

斑马鱼在药物筛选中的作用

在医学上，为了治疗某种疾病而需要对药物进行筛选，然而药物筛选是一个价格昂贵而且周期漫长的过程。直接用于人体是不可能的，因此首先在动物体内进行试验。斑马鱼可以产生大量的后代而且发育又很快，所占的空间小并且对药物吸收能力强，因此已经成为药物筛选的最有利的工具之一。

图6：利用斑马鱼进行药物筛选

近些年，随着斑马鱼研究的优势的不断提现，斑马鱼研究的队伍也越来越壮大，人们对斑马鱼也越来越感兴趣。由此可见，斑马鱼既可以在生活中为我们带来许多乐趣，又可以在科学研究中给我们提供巨大的帮助，为人类的健康研究作出巨大贡献。

出品：科普中国

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