肺腺癌mrd检测论文

MRD（Minimal Residual Disease），即微小残留病灶，指癌症患者在治疗中或治疗后体内仍有残留的恶性肿瘤细胞存在，细胞坏死或凋亡过程中释放出肿瘤循环DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）。同时也有NCCN指南和专家共识将MRD表示为Measurable Residual Disease，即可测量残留病灶[1]。MRD会引起癌症患者术后肿瘤复发，所以癌症患者需要监控MRD，监测术后肿瘤复发风险。基于检测ctDNA的技术因其高灵敏度和无创、便捷等特点，优于传统的临床或影像学方法鉴定出有肿瘤复发的患者。但是ctDNA的检测受大量游离DNA（cell-freeDNA，cfDNA）背景信号影响。因此，MRD检测应使用高灵敏度的检测技术。目前检测MRD的技术众多（详见图2），而最广泛使用的检测技术是其中三种：  1） 多参数流式细胞术（ MFC），是一种快速、定量鉴定癌细胞的方法，其峰值灵敏度为，即1万个正常细胞中的1个癌细胞。6色（或更多）流式细胞术分析是检测异常MRD免疫表型的最常用方法。 2）聚合酶链式反应技术，分为qPCR或RT-qPCR，可以根据其特有的遗传变异，如突变或染色体变异识别恶性肿瘤细胞；本质上是癌细胞的特定DNA片段被复制和扩增，使它们更容易检测和计数，因此即使癌细胞数量非常少，也能通过PCR检测出基因异常； 3）NGS是一种极为敏感的DNA测序方法，其峰值灵敏度为，即100万个正常细胞中有1个癌细胞。NGS可以检测B/T细胞抗原受体基因的克隆性重排，作为新兴的MRD检测方法，已受到国内外专家认可并推荐。2017年版国际临床实践指南（NCCN）、和2017年版《中国多发性骨髓瘤诊治指南》均推荐NGS作为MRD检测方法。 总的来说，临床应用中，应根据不同治疗目的，选择合适的MRD检测方法。qPCR及RT-qPCR检测MRD的灵敏度较MFC高，但更为费时。NGS作为MRD检测的最新技术，进一步提高了MRD检测的灵敏度，对于评价治疗疗效、预测疾病复发、实施精准治疗具有重要的指导意义。 MRD检测最成熟也是最主要的应用是血液肿瘤，已成为NCCN临床标准实践的一部分，FDA唯一批准的MRD检测产品也仅用于血液疾病。但随着很多临床试验的推进，MRD近年也在慢慢扩展到实体肿瘤中，如乳腺癌，肺癌，结直肠癌，前列腺癌等，并以实验室自建方法（LDT）的方式参与临床决策【3-6】。目前实体肿瘤MRD的检测难度较大，主要体现在两方面： 1、不同实体瘤个体化差异大，即每个患者个体中仅携带非常少量、相同的基因突变，对panel的设计要求高。 2、早期实体瘤释放到外周血的ctDNA含量非常少（低于1%），对检测灵敏度要求极高。 针对上述难题有两种解决方案：①使用NGS大panel；②开发个性化的MRD检测panel。也就是目前采用ctDNA检测MRD主要存在两大技术路线：tumor-agnostic（仅基于血浆检测的固定panel）和tumor-informed（基于肿瘤组织测序的ctDNA个性化定制方案)[7]。 由于组织先验（tumor-informed）策略在检测灵敏度上的优势，目前许多肿瘤检测公司基于此进行开发。其技术路线为先检测与肿瘤发生发展相关基因的变异信息，形成每个患者的个性化基因变异图谱，将其纳入MRD检测；最后通过液体活检定向追踪患者血液中的个性化变异。如上图所示，通过采集患者肿瘤组织进行全外显子测序（WES），针对每位患者选取肿瘤特异性的克隆位点进行个性化定制NGS Panel（或使用多重PCR方法)，在监测时提取血浆中的ctDNA进行超高深度测序，通常在术后约四周进行MRD检测。 在一项研究中，相对于固定panel测序策略，可为病人多争取42%的时间采取适合的对策[6] 与此同时，也有研究引入新的方法学进一步升级MRD检测。鉴于甲基化在肿瘤发生早期已有显著变异、变异位点数目丰富，这些表观基因组“标记”在不同患者之间甚至在不同癌症之间更相似，使其成为新MRD检测方法的可能（尤其是针对早期患者）。针对甲基化位点进行设计个性化Panel，这种多组学捕获可以对肿瘤治疗全过程进行精准、高效地全程监测。 1、 Panel 卓越的性能表现 不论是10Kb小Panel还是42Mb WES，伯科液相捕获芯片均展现出卓越的性能：优异捕获效率与均一性。因此能保证个性化的panel检测灵敏度，为MRD检测提供优质的工具。 2、 丰富的引物/探针设计经验，极速定制周期 快速针对患者选取肿瘤特异性的克隆位点设计引物/NGS Panel，最大程度实现MRD检测高特异性的同时，七天极速定制周期能极大满足临床术后约四周进行MRD检测的需求。 3、 不管定制个性化Panel还是Spike in，极大用户客户需求 TRACERx研究发现大约12%的患者复发时是一个新原发肿瘤【9】。部分检测机构为了提高MRD检测灵敏度的同时降低检测成本，采用基础模块（癌症中常见的热点驱动基因突变位点）+个体化模块（个体化突变位点）组合个体化定制panel代替原有大panel进行MRD检测。不论是小区域还是大区间，不论是Spike-in到小Panel还是全外显子，伯科探针体系均能胜任，实现了MRD检测广度和深度上的完美结合。 4、 拥有多组学共捕获Panel开发经验 例如DNA&RNA共捕获技术。随着检测技术的进步，可进一步支撑DNA&Methyl共捕获等技术流程的开发。[1] Minimal Residual Disease (MRD). (.). Minimal Residual Disease (MRD). Leukemia & Lymphoma Society. [2] Chen Xueyan, Wood Brent L., Monitoring Minimal Residual Disease in Acute Leukemia: Technical Challenges and Interpretive Complexities, Blood Reviews (2016), doi: [3] Coakley Maria, Garcia-Murillas Isaac, Turner Nicholas C, Molecular Residual Disease and Adjuvant Trial Design in Solid Tumors. [J] .Clin Cancer Res, 2019, 25: 6026-6034. [4] NCCN Guidelines [5] Abbosh C, Birkbak NJ, Wilson GA, et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution [published correction appears in Nature. 2017 Dec 20]. Nature. 2017;545(7655):446-451. doi: [6] Coombes RC, Page K, Salari R, et al. Personalized Detection of Circulating Tumor DNA Antedates Breast Cancer Metastatic Recurrence. Clin Cancer Res. 2019;25(14):4255-4263. doi: [7] Tie, [8] Shannon chuai，ctDNA Methylation & Mutation — A Two-Dimensional MRD Method Identifies More At-risk Patients and Predicts DFS in NSCLC. [9] Zviran, A. et al. Genome-wide cell-free DNA mutational integration enables ultra-sensitive cancer monitoring. Nat Med 26, 1114–1124 (2020).

ICAN研究背景： 术后肺腺癌患者9年随访研究，以EGFR突变状态以及OS，次要终点DFS，复发时长及影响预后因素 在早期可手术肺腺癌中，携带EGFR基因突变的人群广受肿瘤学家的关注。对于该人群，辅助靶向治疗的疗效、辅助化疗的地位以及如何优选亚群和优化方案是目前讨论热点。近期，有关此问题的多项国际和国内研究发表，让我们对于以上问题有了更为深入的认识。我们在此综合进行讨论。 一、早期可手术肺腺癌EGFR突变状态和生存情况。 ICAN研究是一项肺腺癌完全切除术后全国多中心真实世界前瞻性非干预性研究。研究的目的是调查这些患者的EGFR突变状态、临床结局和复发风险因素。 ICAN研究显示，中国肺腺癌可手术患者EGFR突变率高，达到，最常见的突变类型是外显子19缺失和外显子21 L858R突变。不同病理分期的EGFR突变率没有差别。EGFR 突变是OS的重要独立预测因子。均与既往的报道的晚期肺腺癌相似。ICAN研究显示，可手术肺腺癌术后随访期间的复发和死亡率高。术后5年的复发率达到50%，死亡率30%。提示仍然需要有效的辅助治疗降低复发，提高生存。 二、肺腺癌完全切除术后辅助化疗的地位 在ICAN研究入组的2010年，非小细胞肺癌的辅助化疗，是针对完全性切除术后的Ⅱ期和Ⅲ期患者的标准治疗。多个III期随机对照临床试验和meta分析证实术后辅助化疗能够使5年生存率提高5%，尤其对于Ⅲ期患者提高17%。彼时EGFR-TKI价格昂贵，且在辅助治疗中的证据不足。所以入组ICAN研究的大多数II/III期患者接受了辅助化疗。207例（）接受了辅助化疗，II/III期（125/199），I期30%（82/273）接受化疗，甚至IA期也有（34/152）接受化疗。然而， ICAN的亚组分析显示，无论术后各分期EGFR突变状态如何，辅助化疗的生存结果都没有显着差异。也就是说，在真实世界中辅助化疗并没有使患者获益！在国际多中心EGFR阳性肺腺癌辅助治疗研究ADARUA研究研究中，无论接受是否接受辅助化疗，各分期的辅助奥希替尼组DFS相似，即增加辅助化疗，可能在辅助奥希替尼基础上并无助益，起不到1+1＞1的效果。不过，ADAURA研究亦未显示辅助化疗会导致预后受损。为什么会出现这样的情况？在ICAN研究中我们未能找出确切的原因，但考虑有以下可能的原因： 完全切除术后的肺腺癌辅助化疗本身益处较小，在临床试验中，因为控制了严格的入组条件和方案实施，所以能够体现出差异，但在真实世界中，因为方案执行的强度和患者的全身情况等因素，最终抵销了辅助化疗的益处。 在接受辅助靶向治疗的患者中，与辅助化疗的获益人群效应人群重叠，辅助化疗的益处不能彰显。 三、小结： ICAN研究显示，早期肺腺癌的EGFR基因突变状况与晚期相似。完全切除术后肺腺癌复发率和死亡率均较高。辅助化疗未提高生存。综合ADUARA、CTONG1104（ADJUVANT）和ICAN研究的结果，我们可以初步得出以下结论，在EGFR敏感突变阳性完全切除术后IB-IIIA期肺腺癌中，与辅助化疗相比，辅助EGFR-TKI可改善DFS，不建议联合EGFR-TKI和化疗辅助治疗。I期肺腺癌，无论是否有EGFR基因敏感突变，均不推荐常规接受辅助化疗。」 个人的感觉是想看分层数据，特别是按照分期的分层数据，I期患者比例实在太高了，除去这些患者其他人群的获益情况如何？是否有差异？期待发表的论文

血清肿瘤标志物联合检测在肺癌诊断中的问题综论文

【 摘要 】 目的 探讨血清肿瘤标志物癌胚抗原（CEA）、细胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、鳞状细胞癌相关抗原（SCCA）联合检测在肺癌诊断中的临床应用价值。方法 68例肺癌患者为肺癌组， 65例健康体检者为对照组， 采用微粒子化学发光法检测血清中CEA、CYFRA21-1、NSE、SCCA含量， 并比较肿瘤标志物单独或联合检测肺癌的灵敏度、特异度和准确度。结果 肺癌组血清CEA、CYFRA21-1、NSE、SCCA含量均明显高于对照组（P<）， 4种肿瘤标志物联合检测的灵敏度为81%， 准确度为86%， 明显高于单独检测， 差异具有统计学意义（P<）。结论 血清CEA、CYFRA21-1、NSE、SCCA检测在肺癌诊断中具有临床应用价值， 联合检测可提高诊断的灵敏度和准确度， 且具有较好的特异度， 有助于提高肺癌的检出率。

【关键词】 肺癌；肿瘤标志物；联合检测

目前， 肺癌的发病率和死亡率均位于我国恶性肿瘤之首[1]。肺癌早期发现和治疗具有重要的临床意义。血清肿瘤标志物不仅可用于肿瘤诊断， 并且对肿瘤分期、疗效及预后判断有重要的临床价值[2]， 但单项检测肿瘤标志物具有局限性， 本文通过检测CEA、CYFRA21-1、NSE、SCCA这4种肿瘤标志物在肺癌患者血清中的表达， 探讨肿瘤标志物在肺癌诊断中的应用价值及联合检测的意义。现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选择2011年7月～2013年12月在本院住院治疗的肺癌患者68例为肺癌组， 男39例， 女29例， 平均年龄（±）岁， 经病理组织学检查确诊为鳞癌的27例， 腺癌24例， 小细胞肺癌17例， 同期健康体检者65例为对照组， 男37例， 女28例， 平均年龄（±）岁。两组一般资料比较， 差异无统计学意义（P>）， 具有可比性。

1. 2 检测方法 采集受检者清晨空腹静脉血4 ml， 及时分离血清， 采用微粒子化学发光法， 用深圳新产业PLUS200仪器及配套试剂检测CEA、CYFRA21-1、NSE、SCCA水平， 严格按仪器标准操作规程及试剂说明书操作， 检测当日室内质控均再控。正常参考区间分别为CEA 0～5 ng/ml， CYFRA21-1 0～7 ng/ml， NSE 0～10 ng/ml， SCCA 0～ ng/L。

1. 3 阳性判定标准 单项检测时以结果大于正常参考区间上限为阳性， 联合检测时4种肿瘤标志物中有一项为阳性即判定为阳性。

1. 4 统计学方法 采用统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 组间比较采用t检验；计数资料以百分率（%）表示， 组间比较采用χ2检验。以P<为差异有统计学意义。按照标准公式计算肿瘤标志物对肺癌诊断的灵敏度、特异度和准确度。灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）×100% ；特异度=真阴性/（真阴性+假阳性）×100%；准确度=（真阳性+真阴性）/（真阳性+假阳性+真阴性+假阴性）×100%。

2 结果

2. 1 4种血清肿瘤标志物含量比较 肺癌组血清CEA、CYFRA21-1、NSE、SCCA含量均明显高于对照组， 差异均有统计学意义（P<）。见表1。

2. 2 不同病理组织类型肺癌患者4种血清肿瘤标志物阳性率比较 CEA在肺腺癌中的阳性率高于鳞癌和小细胞肺癌（P<）；cyfra21-1在3种肺癌中的阳性率均较高， p="">）；NSE在小细胞肺癌中的阳性率高于鳞癌和腺癌（P<）；SCCA在鳞癌中的阳性率高于腺癌和小细胞肺癌（P<）。4项联合检测的阳性率均高于单项检测。见表2。

2. 3 4种肿瘤标志物单项和联合检测用于诊断肺癌的灵敏度、特异度和准确度 4种肿瘤标志物单独用于诊断肺癌时， 灵敏度最高的是CYFRA21-1（56%）， 最低的.是CEA （29%）， 4种指标联合检测后灵敏度可达81%， 4种肿瘤标志物联合检测的灵敏度、准确度均明显高于各项单独检测， 差异有统计学意义（P<）。联合检测后特异度略有下降， p="">）。见表3。

3 讨论

肺癌是一种恶性肿瘤。近年来， 虽然临床肿瘤诊断和治疗学有着很大的进展， 但肺癌的死亡率仍然居高不下[3]， 肺癌的诊断除影像学、细胞学和组织病理学以外， 肿瘤标志物的检测也是一种主要方法。肿瘤标志物主要是指在血液、体液及组织中可检测到的与肿瘤相关的物质， 这些物质达到一定的水平时能揭示某些肿瘤的存在， 肿瘤标志物在肿瘤发生明显影像学改变之前就可以通过血清学方法检测出来， 为肿瘤的早期诊断、早期治疗提供了一个新的途径。由于肺癌组织病理的多样性， 同种病理组织细胞的异质性和肿瘤生物学行为的复杂性， 多种肿瘤标志物联合检测不失为一种能有效提高肺癌检出率的手段[4]。

CEA属于非器官特异性肿瘤相关抗原， 也是最早被发现的肿瘤标志物之一， 在肿瘤的发生和转移过程中有十分重要的作用[5]。肿瘤状态时， 癌细胞分泌CEA进入血液和淋巴循环， 因此肿瘤患者血清中CEA含量可见不同程度的升高。本研究表明， 肺癌患者血清CEA水平明显高于健康对照组， 并且在肺腺癌中的阳性率达到75%， 在鳞癌和小细胞肺癌中的阳性率较低， 分别为26%和24%， 因此CEA可作为肺腺癌的辅助性诊断指标之一。

NSE是一种糖酵解酶， 为烯醇化酶的同工酶， 存在于中枢、周围神经组织和神经外胚层起源的恶性肿瘤中， 小细胞肺癌是一种神经内分泌起源的肿瘤， NSE作为小细胞肺癌的血清肿瘤标志物具有较高的敏感度和特异度[6]。本研究结果显示NSE在小细胞肺癌中的阳性率为71%， 在鳞癌和腺癌中的阳性率较低， 分别为22%和25%， 也证明了NSE在鳞癌和腺癌的诊断中意义较低， 可作为小细胞肺癌的辅助性诊断指标之一。

CYFRA21-1是细胞角蛋白19的片段， 为正常及恶性的上皮细胞支架蛋白， 主要分布在单层上皮细胞， 在上皮组织来源的肿瘤组织中的含量明显增高， 是非小细胞肺癌较敏感的肿瘤标志物[7]。本研究观察到CYFRA21-1在肺鳞癌中的阳性率为78%， 其次是肺腺癌， 阳性率为54%， 在小细胞肺癌中的阳性率很低， 与文献报道一致。

SCCA为鳞状细胞癌相关抗原， 是用单克隆技术从肿瘤相关抗原TA4提纯出的一个糖蛋白片段， 本研究观察到SCCA在肺鳞癌中的阳性率为67%， 在腺癌和小细胞癌中的阳性率均较低。

本研究结果显示4种肿瘤标志物在肺癌患者血清中的含量均明显高于健康对照组， 差异具有统计学意义（P<）， 表明这4种肿瘤标志物的检测在肺癌的临床诊断中均有一定的应用价值。但单项检测的阳性率均不高， CEA仅在肺腺癌中阳性率较高， NSE可作为小细胞肺癌的辅助性诊断指标之一， CYFRA21-1在肺鳞癌中的阳性率较高， SCCA是具有较好特异度的鳞癌标志物。而这4种肿瘤标志物联合检测后在各组织类型的肺癌中均具有较高阳性率。研究也表明， 它们作为单一诊断指标应用于临床具有一定的特异性， 但灵敏度和准确度均不理想， 联合检测后提高了灵敏度和准确度， 有利于肺癌的早期诊断和治疗。

参考文献

[1]代敏， 任建松， 李霓， 等.中国2008年肿瘤发病和死亡情况估计及预测 . 中华流行病学杂志， 2012， 33（1）：57-61.

[2]Hu W， Chen H， Shi Z， et al. Dual signal amplification of surface plasmon resonance imaging for sensitive immunoassay of tumor marker. Anal Biochem， 2014， 4（453）：16-21.

[4]陈建忠， 顾利江. 肺癌患者血清CEA、NSE、CA19-9、VEGF检测的临床意义.中国现代医生， 2011， 49（8）：28-29.

[5]Canbay E， Ishibashi H， Sako S， et al. Preoperative carcinoembryonic antigen level predicts prognosis in patients with pesudomyxoma peritonei treated with cytoreductive surgery and hyperthermic intraperitoneal chemotherapy. World J Surg， 2013， 37（6）：1271-1276.

[6]Pujol JL ， Boher JM ， Grenier J， et al. Neuron specitic enolase and prognosisof non-small cell lung cancer： prospective study in 621 patients. Lung Cancer， 2001， 31（3）：221-228.