糖尿病小鼠模型论文

以间充质干细胞 (MSC) 为基础的治疗糖尿病相关代谢紊乱的方法受到细胞存活不足和高葡萄糖应激下治疗效果有限的阻碍。 2021年7月2日，清华大学杜亚楠团队在 Science Advances  在线发表题为“ Exendin-4 gene modification and microscaffold encapsulation promote self-persistence and antidiabetic activity of MSCs ”的研究论文，该研究 使用 Exendin-4（MSC-Ex-4）（一种胰高血糖素样肽 1（GLP-1）类似物）对 MSC 进行基因工程改造，并证明了它们在 2 型糖尿病 (T2DM) 小鼠模型中增强的细胞功能和抗糖尿病功效。 从机制上讲，MSC-Ex-4 通过 GLP-1R 介导的 AMPK 信号通路的自分泌激活实现了自我增强并提高了在高葡萄糖应激下的存活率。同时，MSC-Ex-4 分泌的 Exendin-4 通过内分泌作用抑制胰腺 β 细胞的衰老和凋亡，而 MSC-Ex-4 分泌的生物活性因子（例如，IGFBP2 和 APOM）则通过旁分泌增强胰岛素敏感性并通过 PI3K-Akt 激活减少肝细胞中的脂质积累。此外，该研究将 MSC-Ex-4 封装在 3D 明胶微支架中用于单剂量给药，以将治疗效果延长 3 个月。总之， 该研究结果提供了对 Exendin-4 介导的 MSCs 自我持续性和抗糖尿病活性的机制见解，为 T2DM 提供更有效的基于 MSC 的治疗。 迄今为止，全世界有超过 亿人患有糖尿病，预计到 2045 年这一数字将达到 7 亿。 2 型糖尿病 (T2DM) 约占糖尿病病例的 90%，其特征是胰岛素抵抗和高血糖，这是由肥胖、缺乏运动、不健康饮食和遗传引起的。当肝脏、肌肉和脂肪组织中的细胞对胰岛素无反应并导致葡萄糖摄取失败时，就会发生胰岛素抵抗。胰腺 β 细胞将通过增加胰岛素产生来补偿胰岛素抵抗，最终导致 β 细胞衰竭和不可逆的高血糖。因此， 长期暴露于慢性高血糖会抑制增殖并诱导 β 细胞凋亡，从而导致 β 细胞量减少和 β 细胞功能障碍。 此外， T2DM 与肝功能障碍密切相关，超过 90% 的 T2DM 肥胖患者患有代谢相关性脂肪肝 (MAFLD) 。 肝细胞通过将营养物质以糖原和甘油三酯 (TG) 的形式储存起来，在葡萄糖和脂质稳态中发挥着重要作用。在肝脏胰岛素抵抗状态下，胰岛素不能抑制糖异生，但会加速肝细胞中的脂肪酸合成，从而增加肝脏葡萄糖的产生和 TG 的积累。尽管存在 β 细胞和肝细胞功能障碍，但高血糖和高甘油三酯血症会加剧肌肉和脂肪组织的胰岛素抵抗状态，同时引起其他器官和组织的功能障碍。因此， T2DM 与多种并发症密不可分，包括冠心病、中风和视网膜病变。 除了改变生活方式外，还需应用降糖药物以更好地维持 T2DM 患者的正常血糖水平 。胰高血糖素样肽-1 (GLP-1) 是一种肠促胰岛素激素，通过与 GLP-1 受体 (GLP-1R) 相互作用来增加胰岛素和抑制胰高血糖素分泌，从而帮助控制血糖波动。然而，GLP-1 因其半衰期短而很少用于 T2DM 治疗，它会在几分钟内被二肽基肽酶-4 迅速降解。第一个获批用于 T2DM 治疗的 GLP-1R 激动剂 Exendin-4 是一种 39 个氨基酸的肽，是一种 GLP-1 类似物，半衰期较长，为 小时。它通过抑制细胞凋亡和促进细胞增殖来增强 β 细胞质量，从而增加胰岛素分泌量。此外，已证明 Exendin-4 是一种有效的候选药物，可减轻体重，改善糖尿病和 MAFLD。尽管 Exendin-4 在调节血糖和胰岛素反应方面有所改善，但由于肾脏消除，其血浆半衰期仍然有限。 因此，需要每天给药两次，这会导致血浆浓度的意外波动和 GLP-1R 的间歇性激活。  尽管上述降糖药物治疗带来了益处，但仍有部分患者无法恢复正常血糖或出现低血糖、腹泻、恶心、呕吐等多种副作用。 近年来，基于细胞的疗法已成为对抗包括 T2DM 在内的多种难治性疾病的替代方法。特别是，间充质干/基质细胞 (MSCs) 在一些临床前和临床尝试中已证明其对改善由 T2DM 引起的高血糖、胰岛素抵抗和全身炎症的治疗作用，从而为治疗 T2DM 提供了一种新方案。同时，技术进步仍然迫切需要将基于 MSC 的疗法成功转化为 T2DM 的临床治疗。 要克服的主要障碍之一是体内给药后 MSC 的增殖和存活率降低 。 因此，已 经研究了多种策略，例如生物材料封装、基因工程和 MSC 预处理 ，以提高存活率、延迟清除动力学和维持体内 MSC 分泌因子。 此外，优化 MSCs 的给药途径至关重要，因为静脉内给药的 MSCs 主要滞留在肺部和随后的组织中，导致治疗效果减弱。此外，对 MSCs 在 T2DM 中的治疗机制的全面了解仍然难以捉摸。MSCs 被证明可以促进内源性胰岛素的产生并刺激 β 细胞的增殖。此外， MSC 以其调节免疫反应的能力而闻名，这对于改善由 T2DM 引起的全身炎症至关重要 。 鉴于 Exendin-4 和 MSCs 在治疗 T2DM 方面的上述缺陷， 研究人员已经探索了如何协同 Exendin-4 和 MSCs 的治疗益处。 MSC 也已用 GLP-1 进行基因修饰，在 T2DM 治疗中显示出优于野生型 MSC 的治疗功效。然而，应该强调的是，这些组合疗法继承了许多缺陷。例如，当与 MSC 一起给药时，单剂量游离 Exendin-4 的治疗效果和持续时间是有限的。此外， 考虑到 GLP-1 的半衰期只有 2 分钟，而且治疗 T2DM 需要高有效剂量，预计 GLP-1 修饰的 MSCs 很难显著提高 MSCs 的治疗效果。 在这里，在发现人MSCs表达GLP-1R的基础上，该研究通过慢病毒转导系统构建了Exendin-4基因工程MSCs（MSC-Ex-4）来验证MSC-Ex- 4 分泌的Exendin-4可以通过 GLP-1R 介导的自分泌激活 AMPK 信号通路，从而通过延长其在高糖应激下的存活时间和增强抗糖尿病功效来潜在地促进自我持久性。该研究还探索了有关 MSC-Ex-4 保护胰腺 β 细胞的内分泌作用和 MSC-Ex-4 改善肝细胞功能的旁分泌作用的潜在机制。除了 MSC-Ex-4 分泌的 Exendin-4 外，推测 MSC-Ex-4 的其他分泌组可以减少细胞衰老和凋亡，同时促进胰腺 β 细胞的增殖，以及提高胰岛素敏感性和减少脂质积累。最后，该研究系统地提供了 多剂量的游离 MSC-Ex-4，并用可注射的三维 (3D) 明胶微支架 (GMs) 作为细胞封装和递送载体来辅助 MSC-Ex-4，以实现长效治疗效果单剂量局部给药。  总之， 该研究结果提供了对 Exendin-4 介导的 MSCs 自我持续性和抗糖尿病活性的机制见解，为 T2DM 提供更有效的基于 MSC 的治疗。 WOSCI沃斯编辑，耶鲁大学博士团队匠心打造，专注最新科学动态并提供各类科研学术指导，包括：前沿科学新闻、出版信息、期刊解析、SCI论文写作技巧、学术讲座、SCI论文润色等。

Gut：粪便病毒组移植(FVT)对2型糖尿病和肥胖小鼠模型的缓解作用 近年来，粪便移植已成为治疗由梭状芽胞杆菌引起的严重腹泻的流行方法。最近，丹麦哥本哈根大学Dennis Nielsen课题组在一项小鼠中进行的试验表明，通过粪便病毒组移植减轻肥胖症和2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)患者的临床症状。 研究目的 ： 肥胖症和2型糖尿病（T2DM）的发生发展与肠道微生物群（gut microbiota, GM）的改变有关。噬菌体（phages）是一种以宿主特异性方式攻击细菌的病毒，其拮抗作用有可能改变肠道菌群，作为概念验证，Dennis课题组通过较瘦供体粪便病毒组移植（Fecal virome transplantation，FVT）将 转变 肥胖小鼠转变为较瘦小鼠表型，证明FVT对2型糖尿病和肥胖症干预的有效性。 实验设计 ： 图1：实验设计流程图。40只5周龄的雄性C57BL/6NTac小鼠分为低脂（Low Fat, LF）饮食、高脂（High Fat, HF）饮食、HF +氨苄青霉素（ampicillin, Amp）、HF+Amp+FVT和HF+FVT 5组：（图1）。在13周内，小鼠被随意喂食HF饲料（研究饲料D12492，美国）和LF饲料（研究饲料D12450J，美国）。在不同方案喂食6周后，HF+FVT和HF+Amp+FVT组的小鼠分别用 mL肠溶酶间隔1周（第6、7周）灌胃进行两次FVT,。第一次接种FVT前一天，HF+Amp和HF+Amp+FVT小鼠在饮用水中给予单剂量Amp（1 g/L）。从18只C57BL/6N小鼠的盲肠含量中提取并混合用于FVT的病毒体，这些小鼠代表3个不同的供体，饲喂LF饲料14周。来自不同供应商的个体小鼠代表了独特和多样的病毒概况。应用的FVT 病毒组的滴度约为2×1010病毒样颗粒/mL。在研究的第20周，对小鼠进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT），并监测食物摄入量和小鼠体重。 项目流程 ： 结果： 1.  瘦供体FVT降低了DIO小鼠的体重增速，使血糖耐量恢复正常 小鼠分别在FVT前1-2周和FVT后间隔1-2周称量体重。在第一次FVT 后，第4和第6周（15、17周龄）时，HF+FVT小鼠（p<）和HF+Amp小鼠（p<）的体重增加明显低于HF小鼠（图2）。LF和HF+FVT小鼠OGTT无显著差异（p>），而HF小鼠OGTT水平显著升高与LF组和HF+FVT组比较（p<），显示FVT已使HF+FVT小鼠的血糖耐量正常化（图2B）。此外，HF+Amp+FVT的OGTT与HF小鼠相当（p>），说明在HF+Amp+FVT小鼠中，Amp对细菌组成的初始破坏有可能抵消了FVT的作用， 。 这同时表明，与FVT相关的影响是通过肠道菌群成分的改变而发生的。除糖化血红蛋白（HbA1c）水平和每只小鼠的食物消耗量外，还定期测定非禁食血糖。 图2. （A）第一次FVT后2、4、6周（分别为13、15、17周）体重增加的条形图。首次FVT后6周（17周龄）测定OGTT水平。数值是基于tAUC相对于单个小鼠的血糖水平。图中排除了第一次FVT后第4周和第6周两两比较的显著差异，以增加图像的可视性。*P<，**P<， ***P<, ****P< 。Amp，氨苄青霉素；FVT，粪便病毒组移植；HF，高脂；LF，低脂。ns，不显著； OGTT， 口服葡萄糖耐量试验； tAUC， 曲线下总面积。 2.  FVT 增强了全身能量稳态相关基因的表达 以肝脏和回肠组织中与肥胖和T2D相关的基因为目标，检测HF+FVT与HF小鼠中相关基因的表达是否有显著差异，并与LF小鼠具有相似性。结果显示，FVT降低了HF饮食引起的基因表达差异，从而形成与健康LF小鼠相似的表达水平。 图3：肝脏和回肠组织中与肥胖和T2D相关的基因表达水平（18周龄）。（A） Ffar2Ileum ，（B） LeprLiver ，（C） KlbLiver ，（D） Ppargc1aLiver ，（E） Igfbp2Liver ，（F） Socs3Liver ，（G） MycLiver 。采用以HF或LF为对照组的线性模型计算组间显著性。样本质检表达量的差异倍数取log2是对相对基因表达的一种度量，它是基于log2转化的表达值归一化到最小值的样本。 Ffar2Ileum ，游离脂肪酸受体； LeprLiver ，胰岛素样生长因子结合蛋白； KlbLiver ，β-klotho； Ppargc1aLiver ，瘦素细胞因子受体； Igfbp2Liver ，过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂1-α； Socs3Liver ，细胞因子信号传导抑制因子； MycLiver 转录因子。FVT，粪便病毒组移植；HF，高脂；LF，低脂。ns，不显著； 3.  FVT 介导肠道菌群转移 盲肠样本16S rRNA基因拷贝数/g在×1010 ~×1010之间变化。LF小鼠的细菌Shannon多样性指数明显高于HF小鼠（p<），但与HF+FVT小鼠相似（p=）。与HF小鼠相比，盲肠中HF+FVT的Shannon多样性指数也显著增加（p<），但在结肠中Shannon多样性指数没有明显增加。Amp治疗后7周，Amp处理过的HF+Amp小鼠的Shannon多样性指数最低（p<），而FVT提高了Amp干预后的HF+Amp+FVT小鼠的Shannon多样性指数（p<）（图4A）。FVT对病毒Shannon多样性指数无影响（p>），而Amp的处理显著（p<）增加了病毒Shannon多样性指数（图4B和线上补充表S5），其原因可能是由于噬菌体的诱导。 根据Bray-   Curtis差异测定法，FVT对细菌组成（图5A, p<）和病毒组成（图5B,P<）都有强烈的影响，如HF+FVT与HF小鼠、HF+Amp+FVT与HF+Amp小鼠的明显分离。 FVT受体的GM特征与供体的GM特征不完全相似，这表明供体病毒组只有部分在接种6周后建立。此外，所有实验组在病毒和细菌群落中两两显著分离（p<），包括LF和HF+FVT （p<）。该研究发现，无论是否经过Amp处理，FVT都强烈地影响和部分重塑了GM的组成。rCCA表明，某些细菌（拟杆菌目和梭菌目）和病毒（尾病毒目，微病毒科和未鉴定的病毒）之间存在强（r>）正或负相关性的潜在宿主-噬菌体对关系。 图4.供体和盲肠（A）细菌和（B）终止时（18周龄）的Shannon多样性指数。括号表示图中每一组的样本数量，灰色点表示异常值。供体是从三个不同供体的盲肠内容物中提取的细菌或菌体的1:1:1混合而成。各组的两两比较见线上补充表S5。*P<。Amp，氨苄青霉素；FVT，粪便病毒组移植；HF，高脂；LF，低脂。ns，不显著。 图5：PCoA图，基于Bray-Curtis不同度测量，取供体和盲肠（A）细菌群落和（B）18周龄病毒群落。Bray- Curtis不同度量的相似度分析（ANOSIM）显示在表中。供体是从三个不同供体的盲肠内容物中提取的细菌或菌体的1:1:1混合而成。各组的两两比较见线上补充表，氨苄青霉素；FVT，粪便病毒组移植；HF，高脂；LF，低脂。 图6.说明所有五个实验组细菌（A）和病毒（B）概况的热图，以及某些细菌和病毒簇之间的强烈相关性（C）。 4.  FVT 介导的血浆代谢组谱的改变 采用非靶向UPLC- MS分析血浆样品，测定FVT对宿主代谢组的影响。基于数据集建立了PCA模型，比较LF、HF和HF+FVT的概况（图7，所有组的在线上补充图S111）。与其他测量方法一致，HF+FVT小鼠的血浆谱位于HF和LF小鼠之间。两两建立OPLS-DA模型，所有模型（LF vs HF、LF vs HF+FVT、HF vs HF+FVT）均具有统计学意义（p<），支持三组分离。在筛选出的VIP评分为>2的特征中，仅对与相关基因表达相关（基于rCCA）和细菌或病毒丰度相关的特征进行进一步检测以进行注释。研究的特征主要包括饱和/不饱和溶血磷脂（LysoPC）和/或磷脂磷脂胆碱（PCs）， 而 其余的特征包括各种氨基酸或无法识别的代谢物。总体而言，与LF小鼠相比，HF小鼠的LysoPC（18:2）、LysoPC（22:2）、PC（16:0/22:6）水平更高，血浆LysoPC（22:4）和PC （18:1/O-18:2）水平更低。与LF小鼠相比，HF+FVT小鼠循环LysoPC（16:0）、LysoPC（18:2）和PC（16:0/22:6）水平升高，而LysoPC（22:4）和PC （18:1/O-18:2）水平降低。与HF小鼠相比，HF+FVT小鼠的LysoPC（16:0）、LysoPC（18:0）和PC （18:1/O-18:2）水平更高。 图分析图，原始数据各维度和每个主成分的相关度由电喷雾电离（ESIZ）+UPLC-MS处理的终止妊娠（18周龄）时LF、HF和HF+FVT（R2=和Q2=）得到，表包括由两两比较生成的监督的OPLS-DA模型。HF，高脂；LF，低脂；OPLS- DA，潜结构正交投影判别分析；PCA，主成分分析；UPLC- MS，超高效液相色谱-质谱分析。 结论 ： ①   对高脂喂养的小鼠进行粪便病毒组移植（FVT），移植来源为低脂喂养14周的瘦小鼠的盲肠病毒组；② FVT 后第 6 周，受体小鼠的体重增长显著降低，且 葡萄糖耐受性 OGTT与 瘦 低脂喂养的对照组小鼠相似，没有出现 发生 因高脂喂养诱发 引起 的糖耐受损；③与此一致的是，FVT 显著改变了小鼠的肠道细菌和病毒组成、血浆代谢物以及与肥胖和 2 型糖尿病相关基因的表达水平；④ 但在 FVT 前进行抗生素预处理，反而会削弱 FVT 的有益效果。这项研究说明，噬菌体介导的疗法或能用来治疗肥胖和糖尿病等肠道菌群相关疾病。

我们这里用65mg/kg STZ对一定种属动物的胰岛β细胞有选择性破坏作用，而使许多动物产生糖尿病。最常用的是大鼠模型。一般常用的诱导方法如下：将大鼠禁食12h，按60mg/kg体重腹腔注射STZ，每日1次，连续2次，成功制备Ⅰ型糖尿病大鼠模型，并且该模型具有高血糖、体重减轻、多饮多食多尿的特点，与临床Ⅰ型糖尿病吻合；但在此实验中，若造模组只腹腔注射STZ一次，并给予高热量饲料饲养12周，则可制备Ⅱ型糖尿病动物模型，且按该法制备出的模型具有超重、糖耐量减低、血脂升高、血清胰岛素升高及胰岛素受体结合力降低伴胰岛素抵抗的特点，类似于Ⅱ型糖尿病病人的临床特征。Ⅰ型糖尿病与Ⅱ型糖尿病动物模型的制备可能与STZ注射的剂量有关系：大剂量（常为120mg/kg）注射时，由于直接引起胰岛β细胞的广泛破坏，可造成Ⅰ型糖尿病模型；而注射较少量STZ时，由于只是破坏一部分胰岛β细胞的功能，造成外周组织对胰岛素不敏感，同时给予高热量饲料喂养，两者结合便诱导出病理、生理改变都接近于人类Ⅱ型糖尿病的动物模型。 也有研究表明，用STZ按90mg/kg体重处理过的新生大鼠长至成鼠后，表现出糖耐量异常、胰岛素分泌下降、体重下降等特征。其主要机制是新生鼠出生后一周内β细胞对STZ敏感性不同，以及再生力不同，导致成鼠后β细胞数量相对减少。故大鼠出生后一周内注射STZ ，其β细胞坏死及增生可使成鼠β细胞数量及生化特点稳定。这说明该方法稳定性好，是研究非肥胖型非胰岛素依赖性糖尿病的理想载体。