细胞凋亡检测的论文

现代人的疾病多与饮食息息相关，怎么吃得健康、营养，是每个必学的课题。从生活中选择好的食材，其中过去「橄榄油」已被证实能帮助抗氧化、降低血胆固醇，如今国际研究指出对癌症患者有所帮助，因为橄榄油内含的特殊成分，能够在一小时内就使癌细胞凋亡！被视为抗癌的新利器。

长期以来，已知橄榄油对心脏、心血管疾病有许多益处，但橄榄油不只如此，根据《分子与细胞肿瘤学》研究中发现，橄榄油中的化合物「橄榄油 *** 醛」（oleocanthal），会让癌细胞在一个小时内凋亡。一般而言，正常细胞凋亡的过程约需16~24小时。

研究员同时也是营养科学家保罗·布雷斯林发现，「橄榄油 *** 醛」（oleocanthal）会让癌细胞断裂外，同时释放溶解酶，当溶酶体中的酵素释放到细胞中，就会分解生命所需的有机物质，导致细胞自杀。

但并非所有细胞都会死亡，「橄榄油 *** 醛」不会损害健康细胞，健康细胞反而会进入休眠状态，并在约24小时之后重启，但对细胞凋亡的情况并不限于单一种类的癌细胞，而是所有观察种类的癌细胞都发生。

其实早在这项研究发表前，美国罗格斯大学环境与生物科学院当时已经初步了解，橄榄油中物质具有杀死癌细胞的作用，只是没料到癌细胞会以如此快的速度凋亡。在更进一步的研究中，研究者更发现癌细胞被自己的酵素杀死。

研究员之一的保罗·布雷斯林博士说：「它可能被证明是未来治疗癌症治疗的新选择，有效杀死癌细胞和又能保护身体健康组织，但目前治疗从此方向着手，此论文对癌症治疗具有特殊的意义。」

橄榄油 *** 醛这同时也有抗发炎的效果，研究人员甚至直言：「对于生病的人不妨开始改吃橄榄油。」过往在饮食中最常食用橄榄油的非地中海美食莫属，因为饱和脂肪含量极低，omega3 脂肪酸则含量较高，可大为降低心脏病风险，但怎么挑适合的橄榄油也很重要。

根据《超级大脑饮食计画》（大雁出版）书中指出，尼可拉斯．柯曼（Nicholas Coleman）是举世少有的「橄榄油专家」之一，他指出几个找到好橄榄油的秘诀。首先，油的颜色与品质无关。要判断一种油的好坏，最佳方法就是品尝它。好的冷压初榨橄榄油，尝起来应该有青草味，绝不能有油腻的感觉。

初榨橄榄油的辛辣味来自橄榄油 *** 醛，因此油里面是否富含橄榄油 *** 醛，可以从辛辣程度判断。比较辛辣的油，甚至会辣到让你咳嗽——但这其实是橄榄油品质的一种分级方式！下次你喝到「咳三下」等级的油，就知道找到守护者了，你的大脑会感谢你的。

文、王芊凌／图、巫郡俊

参考文献

Oleocanthal rapidly and selectively induces cancer cell death via lysosomal membrane permeabilization

您好，PC12细胞是一种神经元细胞，它们可以在体外培养，并且在培养基中可以被诱导凋亡。凋亡是细胞死亡的一种特殊形式，它可以帮助细胞清除病毒或细胞损伤，从而保护细胞免受损害。PC12细胞凋亡形态变化的细胞损伤可以通过几种方式来发生，包括细胞膜损伤、细胞毒性、细胞内激素水平的变化以及细胞内细胞因子的变化。细胞凋亡形态变化的细胞损伤可以通过几种方式来发生，包括细胞膜损伤、细胞毒性、细胞内激素水平的变化以及细胞内细胞因子的变化。细胞凋亡形态变化的表现形式包括细胞膜的变性、细胞膜的溶解、细胞质的凝固、细胞质的收缩、细胞核的收缩、细胞核的溶解以及细胞内的蛋白质损伤等。细胞凋亡形态变化的表现形式可以通过显微镜观察来确定，并可以通过测定细胞内激素水平、细胞内细胞因子水平以及细胞内蛋白质水平来确定。

其主要论文有《松树皮提取物Pycnogenol的生物学和疾病防治功能研究》（与王金发、赖斐合撰）、《马尾松树皮提取物体外诱导人肝细胞凋亡的一过性监测分析》（与王金发、崔映宇合撰）、《马尾松树皮提取物的抗氧化性初步研究》（与王金发、崔映宇、赖斐合撰）、《马尾松树皮提取物对人体外癌细胞的光谱作用研究》（与王金发、崔映宇合撰）、《马尾松树皮提取物体外抑制人肝癌细胞BEL-7402生长的数学建模》（于王金发、崔映宇、陈小红合撰）等。主要著作有《中医中药与养生》（与人合著）。

1、普通光学显微镜观察2、透射电子显微镜观察3、荧光显微镜观察 1）用苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失2)Giemsa染色法、瑞氏染色法等，正常细胞核的色泽均一，凋亡细胞染色变深，坏死细胞染色浅或没染上颜色 1）细胞体积变小，全面皱缩；2）凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 常用的荧光染料：丫啶橙、 PI 、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等Hoechst 33342、Hoechst 33258、 DAPI三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。1)PI双染色法基本原理Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1%，若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。该方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。 1、磷酸缓冲液PBS（）：磷酸钠盐 50mM，NaCl 200mM。2、蛋白酶K(200μg/ml，）：蛋白酶K ；PBS 100ml。3、含2%H2O2的PBS缓冲液（）：H2O2 ；PBS缓冲液 。4、TdT酶缓冲液（新鲜配）：Trlzma碱 用 HCl调节pH至 ，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠 29．96g和氯化钴。5、TdT酶反应液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液 76μl，混匀，置于冰上备用。6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠 17. 4g；柠檬酸钠 ；ddH2O 1000ml7、二氨基联苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，，临用前过滤后，加过氧化氢至。8、甲基绿（）：甲基绿；乙酸钠100ml。9、100%丁醇，100%、95%、90%、80%和70%乙醇，二甲苯，10%中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（ONCOR） 1、标本预处理：⑴石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min。用无水乙醇洗两次，每次3min。用95%和75%乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug/ml），于室温水解15min，去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次，每次2min，然后按下述步骤2进行操作。⑵冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10%中性甲醛中，于室温固定10min后，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃处理5min，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。⑶培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约 5 × 107个/ml细胞于 4%中性甲醛室温中固定 10min。在载玻片上滴加 50～100μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。2、色缸中加入含2%过氧化氢的PBS，于室温反应5min。用PBS洗两次，每次5min。3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴 TdT酶缓冲液，置室温1～5min。4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反应液，置湿盒中于37C反应 1hr（注意：阴性染色对照，加不含TdT酶的反应液）。5、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30min，每10min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。6、组织切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min。7、用PBS洗4次，每次5min。8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的溶液，室温显色3～6min。9、用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。10、于室温用甲基绿进行复染10min。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s。依同样方法再用100%正丁醇洗三次。11、用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。 一定要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本，阳性细胞对照可使用地塞米松（1μM）处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞。阴性对照不加TdT酶，其余步骤与实验组相同。细胞产生不可修复的DNA损伤后通常会程序性死亡，或称凋亡。然而在肿瘤细胞中这一机制失去作用，所以它能够肆意增殖，拒绝接受“自杀”的命令。德国科学家发现了其中的可能原因——肿瘤细胞会降解一种能触发凋亡的蛋白。抑制这种蛋白的降解能够使凋亡机制恢复作用，并将提升放疗和化疗的效力。相关论文发表在《自然—细胞生物学》（Nature Cell Biology）上。严重DNA损伤后触发凋亡的其中一类蛋白是HIPK2分子。德国癌症研究中心的Thomas Hofmann和同事研究发现，HIPK2不断在健康细胞中产生，但一种名为Siah-1的酶将它标记为“垃圾”，所以它又立刻被降解。轻微损伤的细胞会进入一种低级警戒状态——短时间内抑制HIPK2的降解。一旦损伤得到修复，细胞会立即恢复对HIPK2的降解。只有在严重损伤（比如DNA双链均遭破坏）的细胞中，HIPK2的降解才被永久性地抑制。结果HIPK2不断积累，触发凋亡，细胞自杀。研究人员推测，这可能就是放疗和化疗有时失效的原因。这两种治疗方法都会严重损伤肿瘤细胞，最终导致它们的程序性死亡。Thomas Hofmann说：“如果有抵抗发生，经常是由于肿瘤细胞‘拒绝’执行自杀的命令。”研究人员在实验中抑制了Siah-1酶，结果发现，即使在轻微损伤的细胞中，HIPK2也能够积聚，凋亡也被触发。Hofmann推测，“癌医学将可能利用这一发现。比如，我们可以将Siah-1抑制剂与放疗或化疗结合使用，从而将细胞拉回到凋亡机制中来。