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水杨酸(salicylic acid，SA)是一种植物界广泛存在的天然物质，它不仅具有重要的药理效应，而且对植物生长发育过程以及植物抗病性方面有着广泛的调控作用 。SA处理可以延缓多种果实的成熟衰老进程。通过测定果实成熟衰老过程中组织内源SA水平的变化，可以更好了解果实成熟衰老机理，为SA及其衍生物调控果实成熟衰老进程积累基础。但是植物组织中内源SA水平很低，一般在1．0～8．4p~g／g之间_4-一-，果实组织中含量则相对更低，因此如何更有效地提取组织中的SA，并配以更灵敏的检测方法，是研究SA对果实成熟衰老调控的重要内容。 现有的植物组织内源SA提取方法比较复杂，要经过提取、液液分配、蒸干等多个步骤，回收率较低，一般在34．0％～80．7％之间，而血液中SA的提取是通过乙醚或乙醚与石油醚混合物一步萃取法，较现有的植物组织中SA提取法更为简便。 1，提取方法： 取l0．0g叶片充分研磨后，置于50mL的离心管中， 加4．0mL 5％ 的三氯乙酸， 加水至20．0mL后再加入30．0mL乙醚，充分摇匀，浸提12h， 于l 000~g下离心，取出上部乙醚相，水相再经乙醚重复提取2次，合并乙醚相，真空旋转蒸干后，加入1．0mL 50％甲醇50％乙酸缓冲液(pH3．2)的混合液将其溶解，置于Ep— pendorf管中保存，即为游离态SA样品。水相加l8．5％的HCI至终浓度为3．2％，于80cI=水浴中加热1．0h，冷却后用乙醚提取3次，合并乙醚相，蒸干后加入1．0mL 50％ 甲醇+50％乙酸缓冲液(pH3．2)的混合液溶解，置于Eppendorf管中保存，即为结合态SA样品。样品经0，3 Ixm 的微孑L过滤器过滤后，用高效液相色谱(HPLC)进 行检测。

植物激素对附子多糖含量的影响

植物在生长的过程中受到内源激素(或外源激素)的调节作用，因此在植物的栽培过程中激素对其生长发育、生理生化、产量、品质、次生代谢产物等都可能会产生作用。

【摘要】 目的研究植物激素对附子多糖含量的影响。方法在附子的苗期和子根膨大期喷施不同的激素，采用蒽酮-硫酸比色法测定多糖含量。结果不同的激素间差异明显，赤霉素(GA)、α-萘乙酸(NAA)对多糖含量的增加也有作用;6-苄氨基嘌呤(6-BA)和6-糠氨基嘌呤(KT)对多糖含量的增加也有作用;吲哚乙酸(IAA)有抑制影响。结论植物激素对附子多糖的含量有显著的影响。

【关键词】 植物激素; 附子; 多糖

Abstract：ObjectiveTo study the effects of plant hormones on the determination of polysaccharide of Aconitum plant hormones were sprayed on the Aconitum carmichaili at the seedling growing period and tubers expanding anthrone-sulfuric acid colorimetry was used to determine the results showed that there was significant difference between the effect on the increment of the content of polysaccharide with the treatments of GA and NAA were and KT also improved the content of polysaccharide,but IAA had inhibitory effect on effects of plant hormones on the determination of polysaccharide of Aconitum carmichaili are singificant.

Key words：Plant hormones; Aconitum carmichaili; Polysaccharide

附子是我国常用的中药，为毛茛科乌头Aconitum carmichaeli Deb.的子根，附子的主要有效成分为乌头类生物碱:乌头碱(aconitine)、中乌头碱(mesaconitine) 与次乌头碱(hypaconitine)等，具有抗炎、镇痛、强心、抗心律失常、降血糖等药理作用, 有回阳救逆、补火助阳、散寒除湿的功效 [1，2]。中草药多糖在增强机体免疫功能及抗肿瘤、抗肝炎、抗溃疡、调血脂、降血糖、抗衰老方面都有作用[3]。附子多糖提取液还具有抗癌、抗衰老和增强免疫机能等作用[4]。附子多糖高效低毒的生物学特性,近年来逐渐受到了人们的关注，是人们新药研发方向之一。植物激素作为化控技术在农业上发挥了重要的作用,对药用植物次生代谢产物也有影响，但在附子上的研究尚未开展。因此，研究激素对多糖含量的影响，对附子的栽培管理、标准化生产和药用价值的利用都有重要的意义。

1 材料与仪器

材料试验材料来自四川江油附子GAP基地的主要栽培种，由侯大斌教授鉴定。随机区组设计，重复3次，种植在西南科技大学校内实验田。试验田土壤特性：全氮含量为，速效氮含量为 mg/kg，速效磷含量为 mg/kg，速效钾含量为 mg/ kg,有机质 mg/kg。底肥：农家肥30 000 kg/ha，油枯3 000 kg/ha，高效磷肥750 kg/ha，按附子生产要求进行田间管理，每月除1次草。激素选用：GA(60 mg/L)，6-BA(40 mg/L)，NAA (30 mg/L)，IAA(20 mg/L)，KT (25 mg/L)，对照(清水)，分别在苗期和子根膨大期喷施，06-27收获。

收获附子先用自来水清洗干净，在用蒸馏水漂洗两次，装入牛皮纸袋放入烘箱，在105℃下烘30 min，再在60～70℃下烘干至恒重，粉碎过60目筛，4℃冰箱保存，备用。

仪器设备、试剂旋转蒸发仪(Buchi公司)，BP211D电子分析天平(Storis公司)，T6普析通用新世纪紫外分光光度计(北京普析)，高速冷冻离心机(Backman公司)，中药切片机(长沙中南制药机械厂)、中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)。

无水乙醇，丙酮，乙醚，氯仿，正丁醇，浓硫酸，蒽酮，葡萄糖等，以上试剂均为分析纯。

2 方法

附子多糖的提取[5，6]称取干燥的附子粉200 g,加入适量80%乙醇,回流提取3 h,抽滤，药渣挥尽乙醇后,沸水提取2次,1 h/次,合并提取液,浓缩至200 ml,加95% 乙醇使醇含量达到80% ,于4℃冰箱中醇沉过夜，离心(5 000 r/min，10 min)，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤,得到粗多糖。用热水将粗多糖溶于水,用Sevage法(氯仿∶正丁醇=5∶1)除蛋白,重复3次(用考马斯亮蓝法测得无蛋白为止)。流水透析后, 蒸发浓缩至200 ml, 加95%乙醇使醇含量达到80% ,于4℃冰箱中醇沉过夜。离心,沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤,真空干燥，称重计算得率。

多糖含量的测定采用蒽酮-硫酸法[7]。以糖浓度(C，μg /L)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程A= 7,r= 2，葡萄糖在20～100 μg/L与吸光度呈良好的线性关系。

换算因子的测定精密称取附子多糖100 mg,溶于1L容量瓶中,稀释至刻度,摇匀。精密吸取1 ml于具塞试管中,按照蒽酮-硫酸法方法测定吸光度,根据回归方程计算多糖浓度中葡萄糖的浓度C,按下式计算出换算因子f。f= C·D/W。式中W为多糖质量(mg) , C为葡萄糖浓度(μg /ml) ,D为稀释倍数。测得换算因子f= ( n= 5,RSD=)。

样品溶液的制备精密称取不同处理的附子样品 g(n=3)，加入150 ml 80 %乙醇回流提取3 h,抽滤，残渣挥尽乙醇后,用100 ml水提取1 h, 2次,离心，定容至250 ml的容量瓶中,为样品液。

精确度实验精密称取附子粉5份，每份1 g，按照“”项下的方法同时制取5份样品溶液。精密移取各样品溶液各1 ml分别置于具塞试管中，按照“”项下的方法测定吸光度，计算附子多糖含量。测得RSD=(n=5),说明该分析方法精密度良好。

稳定性实验按“”项下样品溶液制备方法制备，吸取1 ml试液于具塞试管中，按照“”下的方法测定吸光度，每隔1 h测定1次，连续6 h，考察其稳定性。测得吸光度在6 h内无明显变化，稳定性较好(RSD=)。

数据处理数据用SAS软件进行方差分析和最小显著差数法(LSD)分析。

3 结果

精制多糖的得率干燥的附子粉200 g,得到精制多糖 g,得率为(n=3)。

回收率的测定精密称取5份附子样品液各 g,分别加入30 mg左右的附子多糖,按照“”项下样品溶液的制备和“”项下的测定方法操作,测得吸光度,计算回收率(R)。回收率R=，RSD=(n=5)表1 回收实验结果

植物激素对附子多糖含量的影响精密吸取“”项下样品液1 ml于具塞试管中，按照蒽酮-硫酸法测定吸光度，按回归方程计算样品液中葡萄糖的浓度，按照下面公式计算附子粉中多糖的含量。样品中含量(% ) = (CD /W Rf) ×100%。式中: C为样品液中葡萄糖的浓度, D为稀释倍数, f为换算因子, W为样品质量,R为回收率。各处理样品中多糖含量和方差分析表见表2。表2 方差分析表

激素对附子多糖的含量的影响见表3。区组间的方差分析可知，F=,说明不同的激素间差异具有明显的差异性，多糖对不同激素的敏感性存在差异。GA，NAA对多糖含量的提高最为显著，平均含量分别是 ， mg/g，比对照增加了，，与其它激素和对照的差异达到极显著;两种细胞分裂素对多糖含量的影响也有显著的增加，但作用低于GA,NAA，含量分别为 mg/g和 mg/g，增加量分别是，和对照的差异也达到极显著。IAA对多糖含量有明显的抑制作用，多糖含量仅为 mg/g。几种激素的作用效果GA，NAA>KT，6-BA>CK>IAA。表3 激素对附子多糖含量影响分析

字母表示处理间的差异显著水平，相同的字母表示两处理间没有差异，不同的字母表示两处理间差异显著，大写字母表示差异极显著(1%)，小写字母表示差异显著(5%)

4 讨论

植物在生长的'过程中受到内源激素(或外源激素)的调节作用，因此在植物的栽培过程中激素对其生长发育、生理生化、产量、品质、次生代谢产物等都可能会产生作用。多糖作为附子有效成分之一，是评价附子药用价值的主要标准之一。目前对多糖含量的测定使用的方法还主要是经典的紫外比色法，通过验证，该方法具有较好精密度和稳定性，回收率也较高，是检测多糖含量的优良的方法之一。通过实验可以发现，激素对多糖的含量有调节作用。除IAA外其它几种激素对多糖含量都有明显的增加作用，说明IAA的作用具有不稳定性，这与前人研究的激素IAA的调节作用具有不稳定性比较相似[8]。IAA在植物生长的不同时期易受到吲哚乙酸氧化酶的破坏而失去作用，对植物的生长发育产生有影响，可能是抑制多糖含量的原因之一。由于激素对植物生长调节机理目前还不是很清楚，激素对多糖含量的影响还有待进一步研究。

【参考文献】

[1] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部 [S].北京:化学工业出版社, 2005:28.

[2] 沈映君.中药药理学[M].北京:人民卫生出版社,2000 :382.

[3] 黄瑞松. 中草药多糖含量测定方法概述[J].中国药师,2005,8(1):68.

[4] 董兰凤,张英俊,刘京生,等.附子多糖与阿霉素长循环热敏脂质体的抗肿瘤作用及其机制探讨[J].细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22 (4) : 458.

[5] 舒晓燕,刘 慧,梁 静,等.川附子粗多糖提取工艺的研究[J]. 中药材,2006, 29(12):1349.

[6] 杨 帆,郝授国,徐恒瑰,等.附子多糖的含量测定[J].大连医科大学学报, 2007, 29 (5):453.

[7] 王秀奇,秦淑媛,高天慧.基础生物化学实验，第2版[M].北京:高等教育出版社，1999:103.

[8] 张石城,刘祖祺.植物化学调控原理与技术[M].北京:中国农业科技出版社,1999:1.

答：一般采用柳树，杨树，冬青树皮或猕猴桃果实等来提，当然杨柳科的树叶中水杨酸含量也是很高的。水杨酸(salicylic acid，SA)是一种植物界广泛存在的天然物质，它不仅具有重要的药理效应，而且对植物生长发育过程以及植物抗病性方面有着广泛的调控作用 。SA处理可以延缓多种果实的成熟衰老进程。通过测定果实成熟衰老过程中组织内源SA水平的变化，可以更好了解果实成熟衰老机理，为SA及其衍生物调控果实成熟衰老进程积累基础。但是植物组织中内源SA水平很低，一般在1．0～8．4p~g／g之间_4-一-，果实组织中含量则相对更低，因此如何更有效地提取组织中的SA，并配以更灵敏的检测方法，是研究SA对果实成熟衰老调控的重要内容。现有的植物组织内源SA提取方法比较复杂，要经过提取、液液分配、蒸干等多个步骤，回收率较低，一般在34．0％～80．7％之间，而血液中SA的提取是通过乙醚或乙醚与石油醚混合物一步萃取法，较现有的植物组织中SA提取法更为简便。1，提取方法：取l0．0g叶片充分研磨后，置于50mL的离心管中， 加4．0mL 5％ 的三氯乙酸， 加水至20．0mL后再加入30．0mL乙醚，充分摇匀，浸提12h， 于l 000~g下离心，取出上部乙醚相，水相再经乙醚重复提取2次，合并乙醚相，真空旋转蒸干后，加入1．0mL 50％甲醇50％乙酸缓冲液(pH3．2)的混合液将其溶解，置于Ep—pendorf管中保存，即为游离态SA样品。水相加l8．5％的HCI至终浓度为3．2％，于80cI=水浴中加热1．0h，冷却后用乙醚提取3次，合并乙醚相，蒸干后加入1．0mL 50％ 甲醇+50％乙酸缓冲液(pH3．2)的混合液溶解，置于Eppendorf管中保存，即为结合态SA样品。样品经0，3 Ixm 的微孑L过滤器过滤后，用高效液相色谱(HPLC)进行检测。2，测定含量1-2 主要仪器与试剂主要仪器：Beckman高效液相色谱仪(带化学工作站)，岛津荧光检测器，Heidolp旋转蒸发仪(德国)。SA标准品，上海五联化工厂生产；甲醇为色谱纯，天津市四友生物医学技术有限公司生产；其余所用试剂均为分析纯；水(二次蒸馏水，自制)。HPLC检测条件Cl8柱，7．3mm~20cm；流动相： 甲醇：乙酸缓冲液(pH3．2)=50：50；岛津荧光检测器(激发波长为310nm，发射波长为415nm)；流速为1．0mIMmin；进样量为201xL。1．5 标准曲线的建立用50％甲醇+50％乙酸缓冲液(pH3．2)的混合液配制浓度为l，0m g／mL的SA溶液，再稀释成0、0．25、0．5、l，0、2，01xg／mL的标准溶液，将不同浓度的标准溶液用HPLC测定，得到标准曲线。具体参考文献：题目：《猕猴桃果实中内源水杨酸的提取、测定及其在采后研究中的应用》猕猴桃果实中内源水杨酸的提取、测定及其在采后研究中的应用=Extraction and Determination of Endogenous Salicylic Acid from Kiwifruit and Its Application to Postharvest Research[刊，中]/张玉（浙江大学果实分子生理与生物技术实验室，杭州 310029），陈昆松，张上隆//中国食品学报.—2004，4（3）.—6～9 摘要：建立一种更有效的水杨酸（SA）提取、测定方法是了解SA对采后果实成熟衰老生理影响和调控机理的基础。本文采用乙醚一步萃取法提取猕猴桃果实组织中内源SA，用高效液相色谱法（荧光检测器）测定其含量。结果显示，本方法回收率为（±）%，显著高于其它已报道的方法，最低检测限为／g·FW。SA的荧光峰面积与浓度在0～μg／mL范围内呈线性关系，达到极显著水平（r＝**），该方法简便易行，样品提取时间比以往报道的方法节省一半，因此可用于成熟果实组织中的内源SA萃取和测定。图4表1参12。可以到VIP网上详细查询