光控靶向蛋白降解研究论文

泛素 为含76个氨基酸、大小约为 kDa的小蛋白质，在真核生物中普遍存在且高度保守。人类基因组中的四个基因编码泛素： UBB ， UBC ， UBA52 和 RPS27A 。

泛素具有7个赖氨酸残基（K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63）和一个甲硫氨酸残基（M1）。泛素之间主要通过赖氨酸残基和甲硫氨酸残基进行各种连接。由此产生的泛素链产生一定的拓扑结构，可通过对蛋白底物进行修饰并决定底物的功能。

将泛素添加到底物蛋白质中称为蛋白质的 泛素化 。蛋白质泛素化是一种动态的多方面翻译后修饰，涉及真核生物学的几乎所有方面。泛素化涉及三个主要步骤：活化，结合和连接，分别由泛素激活酶（E1），泛素结合酶（E2s）和泛素连接酶（E3s）执行。其中人源E1有2种： UBA1 和 UBA6 ；人源E2有35种；人源E3有数百种。

E3酶具有两个结构域之一：HECT结构域以及RING结构域。HECT结构域的E3连接酶先自身结合泛素然后将泛素转移至底物，而RING结构域的E3连接酶使E2酶直接将泛素转移至底物。

HECT结构域E3通过2种机制连接遍在蛋白质靶底物：首先，遍在蛋白从E2的活性位点转移到E3的活性位点中的Cys，然后遍在蛋白化目标底物中的Lys残基。相反，RING-和RING相关的结构域E3连接酶在一步中用作泛素化靶基质的支架：E2将遍在蛋白直接转移至靶底物中的Lys残基。

目前，人体内还存在E4酶。E4酶为泛素链延伸因子，能够对单泛素化的底物进行泛素链的延伸形成多聚泛素化。

单泛素化 是在一个底物蛋白残基上添加一个泛素分子。 多单泛素化 是将一个泛素分子添加到多个底物残基中。 多泛素化 是在底物蛋白上的单个残基上形成遍在蛋白链。目前，泛素可结合的底物残基有赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸

根据泛素与底物的连接位点，目前有9种方式的泛素化，包括M1, K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63, G76。不同方式的泛素化调控不同的功能。其中，与蛋白酶体降解相关的泛素化为K48。

全面的蛋白质组学研究确定了成千上万种蛋白质上成千上万的泛素化位点。大多数蛋白质在其细胞寿命的某些时刻将经历泛素化。

研究蛋白质泛素-蛋白酶体降解大部分是研究两个蛋白质之间的关系，即一个E3连接酶和一个底物蛋白。

环己酰亚胺（Cycloheximide, CHX）为细胞内蛋白合成抑制剂。MG132为蛋白酶体抑制剂。 图3中，相对于MG132未处理组中SUBSTRATE蛋白在各时间点无明显变化，MG132处理组中的SUBSTRATE蛋白在2h、4h、8h的水平明显减小。说明SUBSTRATE的降解与蛋白酶体相关。

图4中，随着E3泛素连接酶表达量的增加，底物蛋白的表达水平相应降低。图5中，随着E3泛素连接酶酶活性失活突变表达量的增加，底物蛋白的表达水平无明显变化。图6中，用E3泛素连接酶的siRNA敲低细胞内E3泛素连接酶的表达水平，底物蛋白的表达水平相应增加。图7中，过表达E3泛素连接酶酶，底物蛋白的半衰期减少。图8中，敲低E3泛素连接酶酶，底物蛋白的半衰期增加。说明E3泛素连接酶能降低底物蛋白的表达水平。

使用免疫共沉淀的方法检测两个蛋白质之间的相互作用。大致分为以下三种：

通过文献或者生物信息学分析E3泛素连接酶和底物蛋白不同的结构域。图15上为E3泛素连接酶的不同结构域示意图：Domain1, Domain2, Domain3, Domain4；图15下为底物蛋白的不同结构域示意图：DomainA, DomainB, DomainC, DomainD。使用免疫共沉淀的方法检测两个蛋白质之间不同结构域的相互作用，见图16和图17。找到相应结构域后，检测这两个结构域之间的相互作用，见图18和图19。

一般使用外源表达的泛素分子检测蛋白质的泛素化，也可使用内源的泛素抗体。因为泛素化为泛素分子与底物蛋白质的共价结合，SDS无法破坏此种相互作用力，所以图20中能够看到多聚泛素化链的存在。一个泛素分子大约为，因此IB结果可能会出现基于底物蛋白质清晰的ladder带或smear带。

蛋白质泛素化为一种蛋白质翻译后修饰，能够调控蛋白质的功能。目前的泛素化种类有K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63，即泛素分子的K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63与底物蛋白质共价结合。一般认为，K48的泛素化可被蛋白酶体识别。因此，需要确认底物蛋白质的泛素链为K48链。将泛素分子赖氨酸单位点突变（见图21）或泛素分子单赖氨酸保留突变（见图23），通过免疫沉淀和免疫印迹的方法检测底物蛋白质泛素化的种类，见图22和图24。

通过过表达（图25）或敲低（图26）E3泛素连接酶的方式检测底物蛋白质泛素化水平的改变。

体外泛素化能够排除体内复杂的环境，让E3泛素连接酶直接与底物蛋白质作用，使E3泛素连接酶泛素化底物蛋白质更有说服力。体外UB, E1, E2, ATP以及buffer均有商业化试剂盒。只需纯化E3泛素连接酶和底物蛋白质进行体外泛素反应，检测底物蛋白质的泛素化。

生物材料学作为生命科学和材料科学的前沿性交叉学科，更是优先发展的重点。生物功能材料专业正是根据社会发展的需要，特别是生物医学工程、组织工程和药物释放等交叉学科技术的迅速发展对专业人才的迫切需求而设立的 。生物医用材料的分类生物材料应用广泛，品种很多，有不同的分类方法。通常是按材料属性分为：合成高分子材料（聚氨醋、聚醋、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸乙醇酸共聚物及其他医用合成塑料和橡胶等）、天然高分子材料（如胶原、丝蛋白、纤维素、壳聚糖等）、金属与合金材料（如钦金属及其合金等）、无机材料（生物活性陶瓷，羟基磷灰石等）、复合材料（碳纤维/聚合物、玻璃纤维/聚合物等）。根据材料的用途，这些材料又可以分为生物惰性（bioinert）、生物活性（bioactive）或生物降解（biodegradable）材料。这些材料通过长期植入、短期植入、表面修复分别用于硬组织和软组织修复与替换。生物医用材料由于直接用于人体或与人体健康密切相关，对其使用有严格要求。首先，生物医用材料应具有良好的血液相容性和组织相容性。其次，要求耐生物老化。即对长期植入的材料，其生物稳定性要好；对于暂时植入的材料，耍求在确定时间内降解为可被人体吸收或代谢的无毒单体或片断。还要求物理和力学性质稳定、易于加工成型、价格适当。便于消毒灭茵、无毒无热源、不致癌不致畸也是必须考虑的。对于不同用途的材料，其要求各有侧重。 常用的医学生物材料 一、医用硅橡胶 医用硅橡胶(silicone rubber)是美容外科中应用较广的生物材料(组织代用品).它是高分子有机化合物聚硅酮的一种橡胶样固体形态,又称二甲基硅氧烷。 二、人工骨 随着生物医学和材料的发展,各种人工制备的生物材料植入骨内替代骨移植,临床应用效果好.这些人工合成或提取的植入材料生物相容性好,对骨形成具有明显的诱导作用,被泛称为人工骨(artificial bone)。 一般而言，临床医学对生物医学材料有以下基本的要求：无毒性，不致癌，不致畸，不引起人体细胞的突变和组织细胞的反应；与人体组织相容性好，不引起中毒、溶血凝血、发热和过敏等现象；化学性质稳定，抗体液、血液及酶的作用；具有与天然组织相适应的物理机械特性；针对不同的使用目的具有特定的功能。物质属性分类根据物质属性，生物医学材料大致可以分为以下几种： 1、生物医学金属材料（biomedical metallic materials）医用金属材料是作为生物医学材料的金属或合金，具有很高的机械强度和抗疲劳特性，是临床应用最广泛的承力植入材料，主要有钻合金（co-cr-ni）、钛合金（ti-6a1-4v）和不锈钢的人工关节和人工骨。镍钛形状记忆合金具有形状记忆的智能特性，能够用于矫形外科、心血管外科。 2、生物医学高分子材料（biomedical polymer）生物医学高分子材料有天然的和合成的两种，发展得最快的是合成高分子医用材料。通过分子设计，可以获得很多具有良好物理机械性和生物相容性的生物材料。其中软性材料常用来作为人体软组织如血管、食道和指关节等的代用品；合成的硬材料可以用来作人工硬脑膜、笼架球形的人工心脏瓣膜的球形阀等；液态的合成材料如室温硫化硅橡胶可以用来作注入式组织修补材料。 3、生物医学无机非金属材料或生物陶瓷（biomedical ceramics）生物陶瓷这类医用材料化学性质稳定，具有良好的生物相容性。生物陶瓷主要包括两类。（1）惰性生物陶瓷（如氧化铝、医用碳素材料等）。这类材料具有较高的强度，耐磨性能良好，分子中的键力较强。（2）生物活性陶瓷（如羟基磷灰石和生物活性玻璃等），这类材料具有能在生理环境中逐步降解和吸收，或与生物机体形成稳定的化学键结合的特性，因而具有极为广阔的发展前景。 4、生物医学复合材料（biomedical composites）生物医学复合材料是由两种或两种以上不同材料复合而成的生物医学材料，主要用于修复或替换人体组织、器官或增进其功能以及人工器官的制造。其中钻合金和聚乙烯组织的假体常用作关节材料；碳-钛合成材料是临床应用良好的人工股骨头；高分子材料与生物高分子（如酶、抗源、抗体和激素等）结合可以作为生物传感器。 5、生物医学衍生材料（biomedical derived materials）生物衍生材料是经过特殊处理的天然生物组织形成的生物医学材料，经过处理的生物衍生材料是无生物活力的材料，但是由于具有类似天然组织的构型和功能，在人体组织的修复和替换中具有重要作用，主要用作皮肤掩膜、血液透析膜、人工心脏瓣膜等。编辑本段应用广泛，增长迅速生物医学材料应用广泛，仅高分子材料，全世界在医学上应用的就有90多个品种、1800余种制品，西方国家在医学上消耗的高分子材料每年以10%～20%的速度增长。随着现代科学技术的发展尤其是生物技术的重大突破，生物材料的应用将更加广泛。表1列举了生物医用材料的一些典型应用，其应用之广泛可见一斑。编辑本段生物医学材料发展的主要动力生物医学材料得以迅猛发展的主要动力来自人口老龄化、中青年创伤的增多、疑难疾病患者的增加和高新技术的发展。人口老龄化进程的加速和人类对健康与长寿的追求，激发了对生物材料的需求。作为世界人口最多的国家，中国已进入老龄化国家行列，生物材料的市场潜力将更加巨大。 生活节奏的加快、活动空间的扩展和饮食结构的变化等因素，使创伤成为一个严重的社会问题。我国创伤住院年增长率达，高居住院人数第2位。美国1998年用于骨骼-肌肉系统损伤患者的治疗费高达1280亿美元，仅骨缺损患者就达123万，其中80%需用生物医学材料治疗。在全球，心脑血管疾病、各种癌症、艾滋病、糖尿病、老年痴呆症等发病率逐年增加，急需用于诊断、治疗和修复的生物材料。 随着生物技术的发展，不同学科的科学家进行了广泛合作，从而使制造具有完全生物功能的人工器官展示出美好的前景。人体组织和器宫的修复，将从简单的利用器械机械固定发展到再生和重建有生命的人体组织和器宫；从短寿命的组织和器官的修复发展至永久性的修复和替换。这一医学革命（特别是外科学），对生命利学和材料等相关学科的发展提出了诸多需求，对生物医学材料的发展产生了重要的促进作用。发展我国生物医学材料的建议生物医用材料学生物医用材料是材料科学与工程的重要分支，其最大特点是学科交叉广泛、应用潜力巨大、挑战性强。随着新材料、新技术、新应用的不断涌现，吸引了许多科学家投人这一领域的研究，成为当今材料学研究最活跃的领域之一。在我国，生物医学材料的研究虽然取得一些令人瞩目的成果，但整体水平不高，跟踪研究多，源头创新少。在产业化方面，生物医学材料及其制品占世界市场的份额不足2%，主要依靠进口，产品技术结构和水平基本上处于初级阶段。结合我国国情和学科发展趋势，按照"有所为，有所不为，重点突破"的原则，我们建议，应在五个方面开展重点研究。 一是生物结构和生物功能的设计和构建原理研究。着重研究具有诱导组织再生的骨、软骨及肌腱等基底材料和框架结构的设计及其仿生装配； 二是表面/界面过程-材料与机体之间的相互作用机制研究。从细胞和分子水平深入研究材料与特定细胞、组织之间的表面/界面作用，揭示影响生物相容性的因素及本质。 三是生物导向性及生物活性物质的控释机理研究。研究可自控或靶向释放蛋白、基因等特异性生物活性物质的材料的设计以及生物导向性原理；用于组织细胞和基因治疗的半渗透聚合物膜的设计、自装配及特异性细胞密封技术； 四是生物降解/吸收的调控机制研究。研究生物降解/吸收材料的分子结构和生物环境对其降解的影响、降解/吸收速度的调控、降解/吸收及代谢机制，以及降解产物对机体的影响。其目标是为组织工程化人工器官生物材料及药物控释材料的自成、改性方法提供理论基础，实现材料参与生命过程和构建生命组织的目的。 五是材料的制备方法学和质量控制体系研究。主要研究生物医用材料及修复体的计算机辅助设计； 通过上述研究的开展，将使我国生物材料的研究水平有较大提高，为我国生物医用材料科学及其产业的发展奠定坚实的基础。编辑本段意义生物医用材料为挽救生命和提高人民健康水平做出了重大贡献，当前正面临重大突破。我国加入 WTO后，生物医用材料产业将面临更大的挑战和更多的机遇，生物材料科学工作者任重而道远。我们相信，在国家的大力支持下，跨部门、跨学科通力合作，通过走自力更生与技术引进相结合的发展之路，在生物材料组织工程化、分子设计、仿生模拟、智能化药物控释等方面重点投人，生物医用材料必将为全面提高人们的生活水乎，造福人类做出更大的贡献。