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菲律宾蛤仔18S rRNA基因PCR扩增及序列分析 论文编号:SP014 论文字数:8926,页数:23 摘要：本试验采用CTAB裂解法提取了菲律宾蛤仔的总DNA。根据18S基因的保守序列设计3段引物，进行PCR扩增，并采用扩增引物进行正反双向测序。通过DNAstar Package中的SeqMan软件对序列进行组装,可以得到18S rRNA基因全序列。在美国国家信息中心（NCBI）网站上对得到的序列进行BLAST，以确定所得到的序列是18S基因序列。结果显示，菲律宾蛤仔的18S全序列长度为1833bp，A占％，G占％，C占％，T占％，A+T=。最后用MegAlign软件对菲律宾蛤仔与一些相近的双壳纲软体动物的18S基因序列进行比对，序列对比显示菲律宾蛤仔与同一帘蛤科的疣帘蛤及薄片镜蛤的18S序列同源性较高，其次是青蛤和蚬科的河蚬。系统发育进化树显示帘蛤目与海螂目的亲缘关系较近，与珍珠贝目亲缘关系较远。但总的来说，它们的同源性都在85%以上，从而进一步证明了18S基因序列是具有高度相似性的保守序列。 关键词：菲律宾蛤仔 PCR 18S rRNA基因 序列分析 分子系统发育 The PCR amplify and sequences analysis of 18S rRNA gene of Ruditapes philippinarum Abstract: The genome DNA was extracted from the adductor muscle of Ruditapes philippinarum with the method of CTAB. Three primers was designed according to the conversation of 18S gene sequences, which was used in the PCR. Then the sequence was sequenced in both direction and by using SeqMan software in DNAstar Package ,the sequences was assembled to get the complete sequence of 18S ribosomal RNA gene. The 18S gene could be ascertain by carring out BLAST on the NCBI web site. The result showed that length of the 18S ribosomal RNA gene of Ruditapes philippinarum is 1833 bp , in which A account for , G accounts for , C accounts for , T accounts for , A + T = , C +G = . Compared with other available 18S gene of Bivalvia species by MegAlign software, it was find out that the 18S ribosomal RNA gene of Ruditapes philippinarum has a high congenetic with Dosinia corrugate ,Venus verrucosa , Cyclina sinensis and Corbicula fluminea ,which were all in Veneroida. The phylogenetic tree showed that Veneroida has a closer relationship with Myoida than Pterioida. In conclusion, they all have a high homology above 85%, which further proofed that the 18S ribosomal RNA gene sequences is very conservative. Keywords: Ruditapes philippinarum；PCR；18S rRNA genes；Sequences analysis；Molecular phylogeny． 方正姚体目 录 1 引言………………………………………………………………………………………1 研究意义……………………………………………………………………………1 研究历史和现状……………………………………………………………………2 2 试验材料与方法…………………………………………………………………………3 试验材料………………………………………………………………………………3 试验器材………………………………………………………………………………3 总DNA提取…………………………………………………………………………3 DNA电泳检测……………………………………………………………………… 4 PCR扩增…………………………………………………………………………… 5 PCR产物检测……………………………………………………………………6 测序……………………………………………………………………………………6 序列分析………………………………………………………………………………6 3 试验结果及分析…………………………………………………………………………7 DNA提取结果……………………………………………………………………… 7 PCR结果………………………………………………………………………………7 测序结果…………………………………………………………………………… 7 序列分析结果………………………………………………………………………10 4 讨论…………………………………………………………………………………… 14 DNA提取…………………………………………………………………………… 14 PCR扩增中遇到的问题…………………………………………………………… 15 存在问题与展望……………………………………………………………………15 结论………………………………………………………………………………………16 致谢……………………………………………………………………………………… 17 参考文献………………………………………………………………………………… 18 以上回答来自:

我国的养猪事业经过几十年的发展，有了很大的进步，集约化规模化程度越来越高。猪的生产性能也有了很大提高，无论是母猪年提供出栏猪头数，还是各阶段猪的成活率、饲料报酬、瘦肉率都有明显的提高。但是随着国外猪种的引入，国内各种猪场种猪之间的频繁调动，猪病越来越复杂，大部分猪病由原来的单一病原转变为多因子协同作用，给我国的养猪事业造成很大的损失，严重影响养猪生产者事业的发展，甚至带来毁灭性的打击。所以，必须采取综合防治的措施，保障生产的正常进行。猪场的综合防疫体系涉及多方面的内容，主要有消毒、疫苗免疫、环境控制、猪群保健、药物预防等。“防疫是生产的第一生命线”、预防为主、治疗为辅、防养并举是养猪场必须遵循的原则。但是，猪场综合防疫体系的建立和实施都不同程度的存在着很大的误区，下面从以下几个方面谈谈一些看法。一、消毒消毒是保障猪场安全生产的一个非常重要的措施，猪场的许多病原微生物可以通过消毒工作来达到杀灭和抑制其传播的效果。但是，猪场工作人员在实施消毒的过程中往往会走入以下几个误区。1、消毒药浓度越大越好任何消毒药浓度的配比，都具有其一定的科学性和合理性，在正常情况下，无论是环境消毒还是带猪消毒，正常的浓度配比就足以杀灭和抑制病原菌的繁殖和传播。如果消毒药的浓度过大，一方面造成消毒药的浪费，增加饲养成本；另一方面很容易导致猪的皮肤、粘膜、呼吸道的损伤，同时也有可能造成人员的伤害。2、消毒药的浓度配比不准确在生产过程中，在对消毒液的配制过程中不采取称量或使用有固定容积的容器，往往凭感觉，这样配制出来的消毒液的浓度不高即低，浓度低起不到消毒效果，浓度高不仅造成药物的浪费，同时也容易造成对猪只和操作人员的伤害。3、消毒不到位、不彻底猪场工作人员在消毒过程中，往往出现走捷径的现象，如消毒速度过快、喷洒不均匀、不采取喷雾的方式等，这样，无论是环境消毒还是带猪消毒很容易留有死角，不能很好的起到消毒的作用。4、消毒不同步无论是环境消毒还是带猪消毒，应尽可能在大致固定的时间范围内进行。否则，病原菌就有可能扩散或传播，给猪场的安全生产构成威胁。5、对人流、物流、车流的消毒不到位对于规模化养猪场来讲，一般都采用封闭式的管理制度，但是现实决定又不可能完全彻底的封闭，必须要与人流、物流、车流不同程度的接触，如果这项工作做不到位，是养猪场最大的安全隐患。6、消毒池利用不充分任何一个养猪场都设置车辆消毒池和员工消毒脚池，但是在实际操作过程中往往出现很大的漏洞，如消毒池消毒药的浓度不够、不定期更换消毒液、消毒池消毒液不干净、员工不走消毒池等；这种现象如不加以杜绝，猪场出现疫情是必然的。二、疫苗免疫对猪场不同猪群的猪只进行不同的疫苗接种是保障猪场安全生产的基础，给猪只接种疫苗，可以有针对性的净化猪场的疾病和抑制猪场疾病的发生。但是，在猪场的生产实践过程中，往往会出现以下几个误区。1、免疫程序不合理免疫程序的制定，必须以当地疫情的发展规律和猪场猪群的健康状况为依据，不能固定的套用某个地区或某个猪场的免疫程序。如果猪群的免疫程序制定的不科学、不合理，一方面使猪场的某种疾病漏防，另一方面可能引发其它的疾病，导致猪场出现疫情，给猪场的生产造成不可估量的损失。2、疫苗质量不过关猪场给猪群接种疫苗质量的优劣，直接关系到猪场的命运。目前市场上流通的疫苗很多，同一个种类的疫苗就有多个生产厂家，但是质量参差不齐，甚至出现假冒伪劣产品。如果购买方稍有不慎，就会给猪场带来致命的打击。所以，猪场在选择疫苗时必须谨慎，应选择信誉度高、知名厂家生产的疫苗。3、疫苗运输、保存不科学由于不同猪场的基础设施有差别，在疫苗的采购、保存过程中不规范，造成疫苗质量的下降或失效。如果使用这种疫苗，对猪群不能起到很好的保护作用，甚至出现疫情。4、在疫苗免疫过程中操作不规范猪场应根据已制定的免疫程序，由专人按标准的操作方法进行免疫注射。但是，由于猪场的监督力度不够或技术人员责任性不强，在操作中往往出现类似情况：疫苗的领取没有做详细的记录；没有按说明进行严格的稀释或在稀释过程中受消毒液污染；针头大小、长度不合适；疫苗没有防日晒、高温，稀释后在2小时内用完；疫苗在使用前或每次吸苗前没有充分的摇匀；注射时没有做好皮肤消毒，注射深度没保证，注射位置不正确，接种剂量不够，疫苗流出后没有立即用沾有消毒液的棉球檫拭、消毒。出现打飞针、不是头头免疫、不是一猪一个针头；病猪、瘦弱猪同步免疫等情况，势必导致免疫失败结果的出现。三、引种与隔离不当猪场在生产过程中一般都要坚持自繁自养的原则，但是，由于原有猪群的生产力下降或老龄化，为了追求更高的经济效益，需要不定时的更换猪的品种。如果对新引进的猪隔离措施不当，会对原有猪群的安全生产带来一定的风险。引进种猪时，要安排适当的圈舍，与其它猪隔离饲养15-30天，并随时观察其健康状况。在隔离期内未发生任何疾病，方可混群饲养。四、病死猪及胎衣的处理不当集约化猪场应有病死猪及胎衣处理的专门场所，对病死猪只进行焚烧或深埋，也可在粪场附近设置一沉尸井，将病死或剖解猪只及胎衣进行无害化处理。一般情况下，对病死或剖解猪只及母猪产后的胎衣应立即无害化处理，否则，容易造成病原微生物的扩散，影响其它正常猪群的健康生长。五、疫病检测不及时在集约化养猪条件下，应进行经常性的疫病检测工作，以便对场内疫病情况、免疫质量、疫病净化水平进行监控，同时也为本场的防疫工作提供客观依据。尤其本地区、本季节爆发和流行严重的传染病更应该加强检测，以便作出及时反应。同时，对场内使用的疫苗、消毒剂的质量也要进行检测，以保证确实有效。如不能及时的做好以上工作，就不可能准确和深入的了解猪场疾病的流行和发展趋势，就不可能及时的采取有效的防治措施，从而影响猪群健康的生长发育。六、疫病发生时没能及时的采取有效的措施猪场如遇到或怀疑是传染病发生时，必须及时隔离，尽早诊断，病因不明或不能确诊时，应将病料送有关部门紧急检验。如确诊为传染病时，应迅速采取紧急措施，对全场进行封锁和消毒。全场猪群进行检疫，病猪隔离治疗或屠宰、焚烧。健康猪只进行紧急预防接种或药物治疗，并对被污染的场地、用具、环境及其它污染物进行彻底消毒。反之，则容易延误最佳防治和治疗时机，造成疫情的扩散和蔓延，给猪场造成更大的经济损失。七、在疫病防治方面主次不分猪场的防疫工作，要结合本地和本场的实际情况，分清主次，有针对性地对某些危害性强、发病频率高的疫病，根据其流行特点、发病规律采取切实有效的措施。针对性地预防和治疗。反之，一方面造成人力、财力的浪费，另一方面也起不到对疫病的防治效果。八、防疫措施不完善传统的养猪防疫似乎仅仅是兽医份内的工作，而且是季节性的。集约化猪场的防疫则是全方位的、常年的。除常规的消毒、免疫、治疗外，还需要加强管理，保证营养平衡，优化场区和畜舍环境。猪场内的诸多因素都和防疫效果有着直接或间接的关系，因此集约化猪场的防疫措施要形成配套的体系。九、不重视猪群的保健猪场在生产过程中，往往在消毒和疫苗免疫方面投入很大的精力，这当然是猪场防疫不可缺少和关键的步骤。但是，对猪群的保健，也是猪场防疫不可缺少重要的一个方面。当然，对猪群进行保健，需要投入很大的财力，会增加猪只的饲养成本，但是可以提高猪群的健康水平，提高猪只对疾病的抵抗能力，降低猪场发生疫情的风险。十、对猪场整体环境的治理不重视猪场的环境卫生体系是以传统的防疫保健为基础，以猪的生物学特性为根据。要求规模养猪在生产过程中，通过完善猪场内外布局和猪舍内部的工艺设计等一系列措施，给猪群提供一个良好的生长和繁育的环境。定期的对猪体内外进行驱虫和杀灭蚊蝇和老鼠，消灭疾病的传播媒介，减少猪只疾病发生的机会。定期清除杂草和填埋阴沟，消灭病原微生物的孳生地。经常保持猪舍内空气新鲜、干燥、温度适宜、干净卫生，可以在很大程度上提高猪群的健康水平。对猪场周围和场区空闲地进行植树种草（包括蔬菜、花草、灌木等）绿化环境，对改善小气候有重要的作用，一般要求猪场内的道路两侧种植行道树，每幢猪舍之间都要栽种速生、高大的落叶树（如水杉、白杨树等），场区内的空闲地都要遍种蔬菜、花草和灌木。有条件的猪场最好在场区外围种植5～10 m宽的防风林。猪舍若能置于这样的环境中，带来的好处是：在寒冷的冬季可使场内的风速降低70％～80％；又能使炎热的夏季气温下降10％～20％；还可将场内空气中有毒、有害的气体减少25％；臭气减少50％；尘埃减少30％～50％；空气中的细菌数减少 20％～80％。生活在这样一个绿化美化环境中，不仅能使长期在猪场工作的人员感到心旷神情，也能使终生关在笼舍内的猪感受到清晨闻啼鸟，夜听虫蛙鸣，阵阵青草香，飓飓风雨声，仿佛又回归到大自然。所以猪场整体环境的治理是猪场安全防疫的一个重要环节。总之，养猪场综合防疫体系的建立和实施是一个不断修改和完善的过程，防疫体系内的众多环节必须环环相扣、节节相连、步步到位，才能充分发挥综合防疫体系的作用，保障猪场生产的安全性和效益性。

微生物的发酵作用对传统酿造食品安全性的影响摘要：对我国酿造食品的工艺特点和生物转化作用机制进行了阐述，分析了发酵过程中微生物的发酵作用对食品酿造过程中的生物性污染、化学性污染和物理性污染等食品安全性因素的影响，得出我国传统酿造食品由于微生物的发酵作用经过分解、消除和滤过等过程使其更具有安全性特征。关键词：传统酿造食品；发酵作用；食品安全食品为人类提供营养要素，同时也是微生物生长的天然培养基。我国传统酿造食品（酱油、酱类、食醋、腐乳、白酒、酸菜、泡菜等）多以谷类、豆类、蔬菜等为原料，将自然界的群体微生物引入发酵过程共同作用形成风味独特的食品。通过微生物发酵作用引起的生物转化食品具有良好的品质、感官特性、可消化性和营养价值。随着现代工业发展，工业“三废”中的有毒有害物质（如重金属毒物、N-亚硝基化合物、多环芳烃化合物等）在环境中污染逐渐增多，这些有毒有害物质通过土壤、水体、空气等环境污染酿造食品原料、食品容器和包装材料等。化学农药、化肥和仓储药剂（如杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物生长调节剂、粮食熏蒸剂、防护剂等）通过各种渠道污染食品酿造原料，作为发酵原料的粮食在生产、加工、贮藏等环节受到霉菌、细菌、寄生虫等生物污染。本文从我国传统食品酿造的工艺特点、微生物的生物转化机制对食品污染的作用进行分析，探究传统酿造食品在发酵过程中的安全性问题。1传统酿造食品的工艺特点我国传统酿造食品历史悠久，经过千百年的实践形成独特的酿造工艺特点。敞口固态发酵传统酿造一般采用固态发酵技术，在添加谷糠或稻壳等辅料之后进行边糖化边发酵的“双边发酵”工艺，具有发酵时间长、产品风味浓厚、管理粗放等特点。整个过程采用敞口式工艺，充分利用物产资源与自然资源，制曲时富集各种功能性微生物，驯化和培育了特定的微生物群落结构体系，将主体微生物与环境微生物融为一体。同时摸索出一套完整的温度、湿度、酸碱度、通气量、发酵时间等酿造工艺条件，创立了产品增香与各种加工技术，对创造我国独特的酿造食品风味和保证产品质量具有十分重要的作用。多种微生物共同作用酿造过程是一个复杂的生物化学反应过程，产品品质主要取决于多种微生物的协同作用。微生物主要来自于曲种和环境，包括霉菌、酵母菌、细菌等，各种微生物共栖生长，赋予醅料复杂而完整的酶系，具有较强的糖化、液化和蛋白分解能力。各种微生物在发酵过程中盛衰交替，此消彼长，协同作用，产生单一菌种所不能比拟的作用。在发酵过程中水解与发酵交替进行，避免过高浓度底物对有益微生物和生化反应的负面影响。发酵时间长，酶促反应深入而完善，代谢产物丰富多彩，产品风味醇厚、浓郁[1-2]。多样的产品防腐措施传统酿造食品采取灵活多样的产品安全措施，一是依靠代谢产物本身的防腐作用（如白酒是依赖酒精的杀菌作用，食醋是靠醋酸的抑菌作用）；二是利用高浓度的食盐抑制微生物的生长繁殖（如酱油、酱、腐乳等）。2传统酿造食品的生物转化机制传统酿造过程是多种微生物将原料中的淀粉、蛋白质和脂类等大分子物质转化为产品的各种小分子风味物质，构成产品的主要成分。酱油的风味物质按其化合物性质可分为醇类、酯类、酸类、醛类及缩醛类、酚类、呋喃酮类和含硫化合物等[3-4]；食醋中除含有主要成分醋酸外，还含有糖分、氨基酸、酯、醛、醇、酚、酮类等化学成分[5-6]。酱油和食醋等酿造食品的风味物质构成产品特有的色、香、味，其来源主要是2方面，一是植物原料的“主生物质”（如蛋白质、淀粉等“，次生物质”如丹宁、芳香族化合物、异黄酮）；二是微生物及其酶对植物原料作用后的代谢产物。此外，白酒、酱油、食醋等在贮藏过程中各种代谢产物相互作用形成各种风味物质，据分析酱油含有300多种风味物质[4]。多糖的转化传统酿造食品原料的主要成分为淀粉，它在曲霉菌分泌淀粉酶的作用下分解为葡萄糖。这些单糖一部分作为霉菌、酵母菌和细菌生长繁殖的碳源和能源，一部分在微生物的作用下形成发酵产品的各种代谢产物。由淀粉转化来的代谢产物包括各种酸类、醇类、酚类以及低聚糖等[7]。酱油的糖分包括由大豆转化的低聚糖（如水苏糖、棉子糖等）和由小麦淀粉转化的蔗果三糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖以及低聚木糖等，而酿造食品的酸类、醇类、酚类等小分子产物是构成产品风味的物质基础。蛋白质的转化