放线菌的分离纯化毕业论文

海洋生物来源药物先导化合物的研究进展【摘要】海洋生物中活性物质丰富，本篇文章对国内外近3年来从海洋生物中分离提取到的萜类化合物以及糖苷类化合物进行了归纳，并对其研究趋势进行了展望。这些新发现的萜类化合物广泛分布于海藻、珊瑚、海绵以及一些海洋真菌等海洋生物中，主要以单萜、倍半萜、二萜、三萜结构型式存在；而糖苷类化合物在海藻、海绵、海参、海星等海洋生物中发现大部分以糖苷脂、甾体糖苷、萜类糖苷型式存在。【关键词】海洋生物萜类化合物糖苷类生物活性【Abstract】.【Keywords】Marineorganism;terpenoid;glycoside;bioactivity海洋是生命之源，由于海洋环境的特殊性，具有高压、低营养、低温（特别是深海）、无光照以及局部高温、高盐等生命极限环境，海洋生物适应了海洋独特的生活环境，必然造就了海洋生物具有独特的代谢途径和遗传背景，必定也会有新的、在许多陆地生物中未曾发现过的新结构类型和特殊生物活性的化合物。萜类物质是一类天然的烃类物质，其分子中具有异戊二烯(C5H8)的基本单位。故凡由异戊二烯衍生的化合物，其分子式符合(C5H8)n通式的均称萜类化合物(terpenoids)或异戊二烯类化合物（isopenoids）。但有些情况下，在分子合成过程中由于正碳离子引起的甲基迁移或碳架重排以及烷基化、降解等原因，分子的某一片断会不完全遵照异戊二烯规律产生出一些变形碳架，它们仍属于萜类化合物。海洋生物中萜类化合物主要以单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜为主，三萜和四萜种类和数量都较少，且大部分以糖苷形式存在。萜类化合物是海洋生物活性物质的重要组成部分，广泛分布于海藻、珊瑚、海绵、软体动物等海洋生物中，具有细胞毒性、抗肿瘤活性、杀菌止痛等活性作用。糖苷的分类有多种方法，按照在生物体内是原生的还是次生的可将其分为原生糖苷和次生糖苷（从原生糖苷中脱掉一个以上的苷称为次生苷或次级苷）；按照糖苷中含有的单糖基的个数可将糖苷分为单糖苷、双糖苷、三糖苷等；按照糖苷的某些特殊化学性质或生理活性可将糖苷分为皂苷、强心苷等；按照苷元化学结构类型可分为黄酮糖苷、蒽醌糖苷、生物碱糖苷、三萜糖苷等，海洋类的糖苷大部分是按照此特点分类的，主要包括鞘脂类糖苷、甾体糖苷、萜类糖苷和大环内酯糖苷等，在很多海洋生物如海藻、珊瑚、海参、海绵等中均发现有糖苷类化合物存在。已有的研究表明海洋糖苷类成分大都具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、增强免疫力等生物活性。抗白血病和艾氏癌药物阿糖胞苷Ara-C(D-arabinosylcytosine)1、抗病毒药物的Ara-A2以及Ara-C的N4-C16-19饱和脂肪酰基化衍生物3是海洋糖苷类药物成功开发的典范〔1〕。本篇文章对国内外自2005年来从海洋生物中分离提取到的萜类化合物以及糖苷类化合物进行了总结。1萜类化合物单萜2005年等人〔2〕对从红藻Plo

放线菌作为生物活性物质的主要产生菌早已成为人们研究的焦点。然而随着放线菌分离和分类研究的不断深入，大量常见菌株已被反复研究，因此从中发现新化合物的几率逐渐降低。由于新物种具有产生新的生物活性物质的潜力，人们开始使用新的方法在尽可能广泛的范围内寻找新的物种，特别是那些用常规方法很少分离到的稀有放线菌 (rare actinornycetes)…。2O世纪 50年代以来人们从稀有放线菌中发现了大量有价值的抗生素，如小单孢菌产生的庆大霉素，诺卡氏菌产生的利福霉素，马杜拉放线菌产生的马杜拉霉素和洋红霉素，糖多孢菌产生的红霉素，游动放线菌产生的游壁菌素，拟无枝酸菌产生的万古霉素等等。这些事实表明稀有放线菌也具有产生新抗生素的巨大潜力ll,21。分离这些稀有放线菌，不仅可以减少对产生已知生物活性物质菌株的重复分离，还可扩展放线菌次生代谢产物的化学多样性。 由于稀有放线菌对生长环境的特殊要求，难以用常规手段分离获得 ，所以要根椐不同类群的特性设计针对这些特定种属的选择性分离方法。近年来，国内外学者在对国家自然科学基金资助项目,云南省自然科学基金重点项目.稀有放线菌选择性分离的研究方面取得了较大进展,同时也用这些选择性分离方法分离到不少稀有放线菌，并显著提高了具有医用前景的生物活性物质的发现机率。此外，这些分离方法的使用也有助于同答这样一个问题 ：稀有放线菌很少被分离到是因为它们在环境中数量稀少，还是仅仅因为它们难以被分离和培养。本文就以上情况介绍了近年来发展起来的几种高选择性分离稀有放线菌的有效方法。 1 胞外多糖胶 (gellan gum)和动孢溶液 (flooding solution)相结合的分离方法 Gellan gum是由Pseudomonas elodea产生的胞外多糖，过去常用来作为植物组织培养的凝固剂，能促进植物生长。Suzuki等人 首先将其用于稀有放线菌的分离，并发现胞外多糖胶能促进很多放线菌的气生菌丝生长和孢子形成.很多物质都能增加放线菌游动孢子的游动性，如蛋[j胨，牛肉膏，含土壤浸汁的磷酸盐缓冲液，脱脂牛奶等。各种动孢溶液对不同的菌影响不同，Suzuki等在使用脱脂牛奶作为动孢溶液时发现不同的菌对脱脂牛奶的浓度、pH、处理时的温度、离心时的速度及时间有不同的要求。另外，使用高压灭菌后的脱脂牛奶比使用未灭菌的脱脂牛奶所获得的游动孢子数少，这可能因刺激孢子游动性的物质对高温高压敏感所致l4]。 1．1 选择性分离鱼孢菌 Suzuki等曾以鱼孢菌作为他们筛选生物活性物质的目标菌，对采自28个国家的466份土样进行了分离，从 2l份土样中分离到了鱼孢菌，发现鱼孢菌广泛分布于亚洲，欧洲，大洋洲，南美洲和北美洲。他们所使用的高选择性分离方法是l4j：200mg土样自然风干一80℃干热处理60min冷却，加 2mL 0．1％脱脂牛奶 (溶于 lOmmol／[ MOPS，pH 8．0)-+27cC温育 60rain,不时摇动以释放游动孢子一1，000×g室温离心 l0min一取上清液梯度稀释后涂布 HVG平板 (0．05％腐殖酸，2mmol／L CaCI ，0．7％胞外多糖胶)，27℃培养 21～28d。HVG培养基是在 HVA培养基的基础上改进的，与 HVA不同的是HVG含有 CaC1，并以胞外多糖胶代替琼脂。加入适量的 CaC1 不仅使胞外多糖胶得以凝固，而且比加入 MgSO 和 MgCI 更有利于某些放线菌的气生菌丝生长和孢子形成 。1．2 选择性分离游动单孢菌 玫瑰色游动单孢菌能产生孢囊霉素，这种含硫的抗生素能通过抑制芽孢杆菌等革兰氏阳性菌的蛋白合成而影响其生K。对游动单孢菌的高选择性分离程序是_6j：500mg土样 自然风下一l00℃干热处理60min 冷却，加入 2mL灭菌的 0．1％脱脂牛奶 (溶于 5mmol／L CHES，pH 9．0) 32℃温育90rain，不时摇动以释放游动孢子一1，000×g，室温离心 l0min一再于32 温育60rain一取上清液梯度稀释后涂布于 HSG平板 (含三甲氧苄二氨嘧啶 20mg／L，萘啶酸 lOmg／L，依诺沙星 20rng／L，氨苄青霉素钠 2mg／L，放线酬 50mg／L，制霉菌素50 mg／L)，35℃培养 l4～21d。用这种方法对 1，200份土样进行分离时，从 137份土样中分离到246株游动单孢菌。并发现委内瑞拉游动单孢菌广泛存在于从热带到温带的土壤中，但在土壤中的密度很低。HSG培养基 组成：0．05％ 腐质 酸，3mmol／L CaC12，0．000l％ FeSO4•7H2 O，0．0001％ MnC12‘4H2O，0．0001％ ZnSO4•7H2O，0．0001％ NiSO4•6H2O，5mmol／L CHES，0．7％胞外多糖胶 ，pH9．0。 1．3 选择性分离游动双孢菌 对游动双孢菌 (Planobispora)的高选择性分离程序是 ：500mg土样 自然风干---~90％干热处理 60min一冷却，加人 2mL 0．1％脱脂牛奶 ，0．01％Tween80，lOOmg／L三甲氧苄二氨嘧啶，lOOmg／L萘啶酸 (溶于5mmol／I CHES,pH 9．0)---~35。【=温育60min，不时摇动以释放游动孢子一1，000×g，室温离心 l0min一 取上清液梯度稀释后涂布 HSG平板 (含三甲氧苄二氨嘧啶 50mg／L，萘啶酸 50mg／L，依诺沙星20mg／L，氨苄青霉素钠 2m L，链霉素 lm L，放线酮 50mg／L，制霉菌素 50 me,／I ，pH9．0)，32oC培养 l4～21d。利用这种方法，对采 自世界各地的 1，467份土样进行的分离中，从5l份土样中分离到 l】9株游动双孢菌，88％的游动双孢菌分离于pH7．0～7．9的土样,并发现游动双孢菌只出现在热带和亚热带的土样中。 2 再水化一离心法 (rehydration-centrifugation) 具游动孢子的放线菌能在干燥时形成孢子或孢子囊，而当再次湿润时释放出活跃的孢子。游动孢子会受到某些物质的吸引，停留下来再次繁殖。对游动孢子的分离方法很多，如使用头发或花粉为诱饵的捕集法；以毛细管来进行的化学趋化法等。这些方法虽然也能分离到某些稀有放线菌，但要么费时费力，要么对设备和操作人员有特殊要求。最近，Hayakawa等人在 Makkar和 Cross的再水化法 基础． 发明了再水化一离心法_9 J，分离稀有放线菌，效果显著。操作具体程序是：取 500mg风干磨细土壤于锥形瓶中一用 50mL含 10％土壤提取液的10mmol／I 磷酸盐缓冲液轻轻润洗一铝箔覆盖，30。【=温育 90min_÷取 8mL润洗液，1，500×g，室温离心20rnjn一静置 30min~0．2mL涂布 HV琼脂 (含三甲氧苄二氨嘧啶20mg／L，萘啶酸 10mg／L，放线酮 50mg／L)。分离平板的总菌落数随土样而不同，有 37％ ～86％是具游动孢子的稀有放线菌，其中以游动放线菌和指孢囊菌为主。在不同 样品中也能分离到放线动孢菌，短链游动菌和动孢囊菌。上述方法经 Otoguro等人I m 改进后可高选择性分离束丝放线菌 (Actinosynnema)。风干搅碎的样品置研钵中按 10：1(w／w)的量加人 CaCO 粉末，混匀一铺于玻璃纤维膜上，加无菌水使样品湿度达 20％ (w／w)一26。【=培养 l4d_÷样品室温风干至恒重，置于平皿，加 50mL含 10％土壤提取液的 10mmoL／L磷酸盐缓冲液 (pH7．0)一 30。【=浸泡 2h一取 8mI 上述溶液 1，500×g，室温离心20rnjn一静置 30min一取上清涂布 HV琼脂 (含弗氏霉素40mg／L，卡那霉素 40mg／L，三甲氧苄二氨嘧啶 20mg／L，萘啶酸 10mg／L)，30。【=培养 2～3周。Otoguro等人用上述方法对 39份样品进行分离，其中l7份样品分离到束丝放线菌，其检出率占总菌落数的4％ 一86％。对任意选取的29株束丝放线菌进行的抗菌试验发现其中28株具有抗菌活性。HVA培养基 (1L)组成：腐殖酸 0．1g，CaCO3 0．02g，Na2HPO4 0．5g，MgSO4- 7H20 0．5g，KC1 1．7g，FeSO4•7H20 0．01g，核黄素0．5mg，硫胺素0．5mg，维生素B60．5mg，烟酸 0．5mg，肌醇 0．5mg，泛 酸 0．5mg，生物 素 0．25mg，对一氨基苯 甲酸0．5mg，琼脂 18g，pH7．2。 3 极高频辐射法 (extremely high frequency radiation) 应用极高频辐射法 (EHF)分离稀有放线菌的机理在于 EHF能抑制一些原核生物，藻类和单细胞微生物的生长，促进某些异养和光合微生物的生长及休眠菌株的复苏。所以采用极高频辐射 EHF法可以选择性地分离那些能耐受 EHF甚至受到 EHF激活的菌株。 具体过程是… ：取 100mg磨碎混匀的土样悬浮于 lOmL无菌水中，用频率为 1kHz的 EHF照射盛有土壤悬液的试管或平皿底部 (所使用的 EHF无热效应)。处理方式有两种：一种是以5．6mm或 7．1mm单一波长处理；另一种足以3．8mm～5．8mm或 8mm ～11．5mm波长连续处理。处理后州种土样都涂布于 Gauze 2琼脂 (含萘啶酸 10 ms／L，制霉菌素 50 ms／L)。结果显示，以单一波长5．6mm或7．I mm处理不能选择性分离到稀有放线菌。而以 3．8mm～5．8mm和8ram～11．5mm波长连续处理后，稀有放线菌的比例从原来的4．1％ 分别升至8．4％和30．6％。其中马杜拉菌，小四孢菌和野野村荫的绝对数量大为提高， 同时还能分离到那些普通方法无法分离到的菌株，如拟无枝酸芮和拟诺 氏菌。并日,分离物中具抗菌活性菌株分别增加了 13％和20％。在此基础上 Li等人 将极高频辐射法与连续分析相结合，能分离到单独使用这两种方法所不能分离到的稀有放线菌，如珊瑚状放线菌 、原小孢菌、游动放线菌和拟孢囊菌，同时，具有抗菌活性的菌株数量增加了10％ ～20％。具体程序是：加无菌水使土样湿度达 30％ (w／w)一撒在普通琼脂培养基上一+第0，7，14，30，45d分别取样进行 4．6ram～5．8ram和 8mm～1 1．5mm两种波段的 EHF’处理(在取样前 样始终保持30％的湿度)_÷涂 于土壤浸汁琼脂即可 (含 1mL／L维生素 溶液：10rag泛酸钙，10mg尼克酸，1mg硫胺素以及微晕的生物素共同溶于 20mL水；10mg／L荣啶酸；50mg／L制霉菌素)。 4 噬菌体定向分离法 (bacteriophage) 传统的分离方法由于对土样的微生物多样性等基本情况了解较少，加之放线菌生长缓慢，于是可能浪费数月的时问去分离土样中并不存在的菌株，而当目标菌又是稀有放线菌时更是如此。基于这 •原因，Esther等人… 设计了一种以细菌噬菌体作为指示物对环境样品中的野野村菌 (Nonomuria)进行快速筛选和分离的新方法。首先确定土样中是否含有能感染目标菌的噬菌体。具体步骤如下：3g土样悬浮于 100mL PYCa液体中一28℃，250r／rain，培养 24h一培养液3，O00g离心20min一上清液经0．45 m滤膜过滤一取5 T 滤液接种于野野村菌菌苔上一28℃培养48h以上一将含有噬菌斑的琼脂切下，用5mL PYCa洗涤一洗液经0．45Ixm滤膜过滤一点接滤液于长有野野村茼菌苔的琼脂上以确定噬菌体是台可以再牛。对能产生噬菌斑的土样，采用常规的选择性分离方法对 目标菌进行分离。结果， 放线菌l1l 20％为野野村菌。可见其并不是我们以前所认为的那样 “稀有”。同时，我们也可以将适量的只对一种或儿种链霉菌有裂解作用的噬荫体加入土样中来减少非目标菌的数 量。 5 蔗糖梯度离心法 (sucrose-gradient centrifugation) 由于土壤中营养贫乏，放线菌大部分以孢子形式存在，网此可以利用孢子的不同特性对不同的放线菌进行选择性分离。Karwowski 等人曾根据放线菌孢子浮力密度的差异，利用氯化铯密度梯度超速离心有效地从土壤中分离小单孢菌。最近，Yamamura 等人m 根据这一特性，运用蔗糖梯度离心选择性地分离诺卡氏菌，也取得了成功。其方法是：在离心管中从上到下设置各 lmL的 10％、20％、30％、40％ 、50％ (w／v)的蔗糖梯度。将用无菌水稀释为 10。土壤悬液 1mL加入到离心管上层，240×g， 室温离心 30rain。离心后把每层蔗糖取出稀释后涂布 0．2mL于 HV琼脂 (含萘啶酸10mg／L，放线酮 50mg／L，金霉素 10mg／L)。结果，大部分诺卡氏菌 (Nocardia)的孢子出现在 20％的蔗糖层中，小单孢菌可以在20％和 30％蔗糖层发现，但数量较少。游动放线菌等放线菌的游动丝状孢子只能在 10％蔗糖层出现。用这种方法对 l4份土样进行分离时，诺卡氏菌类群的检出率占总菌落数的5％ ～89％，而且 7l％的菌有抗菌活性。 6 结语 不断涌现出的新型稀有放线菌分离方法将成为天然产物筛选中的有用工具 ，也使我们了解到稀有放线菌事实上广泛存在于土壤等环境中，只是由于分离方法和手段的不完善才使得它们较少获得。当然，除了使用特殊方法对稀有放线菌进行分离外，扩大分离范围也是获取稀有放线菌的一个重要手段。比如作者所在单位从 80年代初开始温泉高温菌的研究，发现大量新的高温微生物资源。1991年，该所姜成林和徐丽华建 立了双孢放线菌新属 (Actinobispora)。近几年，该所还从新疆 、青海样品中发现嗜盐放线菌新属一个、嗜冷链霉菌新种一个、嗜盐放线菌新种 6个、嗜碱放线菌新种 4个。这些材料为我们的天然产物筛选奠定了坚实的基础。在寻找下一代化学治疗剂和新的生物活性物质的过程中，放线菌特别足稀有放线菌仍然是重要的目标菌。目前，已有超过 120种抗生素由游动放线菌产生，250多种抗生素是由马杜拉放线菌产生，到 1998年共发现有 32种生物活性物质来源于链孢囊菌，这些化合物都具有广泛的化学多样性，使得这些菌成为工业开发的重点对象。

分离放线菌用高氏1号培养基加10%的酚数滴以抑制细菌的生长。将高氏1号培养基熔化，冷却至50℃左右时，加入10%的酚数滴，然后到平板，并标记稀释倍数。将10克土样倒入盛有玻璃珠和90毫升无菌水的三角瓶中，震荡30分钟，制成悬浊液。再取一支1毫升无菌移液管，吸取毫升土悬液注入盛有毫升无菌水的试管中取另一支1毫升无菌移液管吹吸三次，吸取毫升注入另一盛有毫升无菌水的试管中，以此类推，稀释四次。接下来，取一支1毫升无菌移液管吸取不同浓度的悬液各毫升于相应的平板上，用无菌涂棒涂匀。将培养皿倒置于28℃恒温箱中培养3~4天即可转管 。