泛素研究论文

田中启二，1976年从德岛大学医学院研究科大学院博士课程中途退学，经过德岛大学酶研究所助手，酶科学研究中心助教授，从96年起东京都医学院研究机构东京都临床医学综合研究所分子肿瘤学研究部门部长，2002年至今任同研究所副所长。译者介绍当初引起我翻译这篇文章的冲动是因为他写得很好，使我有一种想好故事大家分享的想法。但凡事说起容易，做起来难，各种专业名词和本人并不高的日语水平，使得这片并不长的文章的翻译时间拖了又拖。尽管我尽了最大努力，我仍然无法确定内容的权威性，大家最好仅仅当做一个故事，而对细节的正确与否请放过。 现在回想泛素的发现，不能不提到两个先驱性的研究。泛素的发现最早要回溯到半个世纪前，1953年，Simpson 利用当时普及的放射性同位素进行代谢实验，发表了“生物细胞中的蛋白质分解中需要代谢能量即需要ATP的加水分解”的论文。但是，这个划时代的研究，在以后的很长一段时间里，被人忽视了。在当时热力学的世界观中，加水分解反应是产能反应，与需要能量的合成反应不同，这个过程是不需要能量的。另一个先驱性的研究是Goldberg等的论文（1977），他们报道在试管内再现Simpson所观察到的现象。这篇论文唤醒了在图书馆底沉睡的Simpson的发现。Goldberg等报道网织红细胞的提取液中加入ATP显著促进了蛋白质的分解，也就是伴随着蛋白分解有能量的消耗。这个发现中，选择网织红细胞是独具慧眼的。Goldberg等注意到网织红细胞向红细胞最终分化时候，不再需要的核，细胞器，溶酶体等细胞内的蛋白质在细胞内快速分解，也就是在蛋白质合成活跃的网织红细胞中，其分解活性也非常高。可以这么说，这个选择决定了一切。实际上，如果不是在网织红细胞的提取液中加入ATP，离体进行Simpson 的实验观察，泛素的发现可能还要等上好多年。ATP依赖性的蛋白分解在在体情况的发现，暗示了其生化学的可能机制。上面的研究和其他关于蛋白质分解的不可思议现象开始吸引人们的目光。1960年代前期，发现了充满了加水分解酶细胞器--溶酶体，因此其被认为蛋白分解的主要器官。但是溶酶体的非选择性破坏方式难以说明在细胞器中寿命和表达水平千差万别的蛋白质个体间的矛盾。不过在当时，这只是少数意见并逐渐销声匿迹了。但在70年代，随着溶酶体机能抑制剂的开发，经过这些试剂处理过的细胞仍然有恒定的蛋白质分解难以抑制，表明了存在与溶酶体不同的蛋白分解系统，基于这些观察，当时称之为“非溶酶体的蛋白质分解系统”。没过多久，这个“非溶酶体的蛋白质分解系统”与前面所提到的“ATP依赖性的蛋白分解系统”便合二为一了。为了保持溶酶体和细胞器内的酸性pH值，需要代谢能量，但这些能量是来自膜型的ATP泵（ATPase）的作用，与Goldberg等所观察到的细胞质的能量消耗的机制是完全不同的。实际上，像大肠杆菌这样的不含细胞器的原核生物的蛋白质分解也是需要代谢能量的，由此明确了ATP依赖性蛋白水解酶系和溶酶体系统是相互独立存在的。接着，在大肠杆菌内发现了ATP依赖性的蛋白水解酶的Lon酶(共有丝氨酸蛋白水解酶和ATP泵酶结构的多功能酶)。Goldberg等人从Lon酶的经验出发，坚信真核细胞中也存在ATP依赖性的蛋白水解酶，而在当时，发现并建立了网织红细胞系统的Goldberg团队对探明ATP依赖性机制也拥有绝对的信心，但在这场大戏中确有意想不到的剧情出现，将他们所预想夺取到的“探明在真核细胞中ATP依赖性的蛋白质分解机制”的光荣全部夺走，打破Goldberg团队美梦的就是巨星Hershko和Varshavsky.从APF-1的认定到泛素的发现Hershko在60年代后期，在以倡导“诱导酶”而闻名的Tomkin研究室中报告了类固醇激素诱导的酪氨酸转移酶的半衰期显著缩短，其分解代谢需要能量。1971年，他回到了祖国以色列，继续进行蛋白质分解的研究，1977年受到使用网织红细胞的Goldberg等人的“ATP依赖性的蛋白分解系统”等相关论文的启发，同当时是研究生的Ciechanover一同进行探明其机制的工作。他们采用化学方法分离，纯化网织红细胞提取液中的阶段性的相关因子。很快的，在1978年得到了通过DEAE-cellulose方法的“阶段1”和采用吸附高浓度盐析的“阶段2”。 幸运的是，这些操作只是通常的为了将红血球内大量的血红蛋白除去的生化学解析方法。阶段1和阶段2单独几乎难以见到ATP的促进效应，但当二者混合时，可以观察到ATP的促进效应。这个结果，显示了ATP依赖性的蛋白质分解路径是复合的，并以简报的形式刊载在BBRC(1978)上。他们将这篇小论文作为自己最值得自豪的业绩，即便在现在的讲演中，也常常提及。此后不久，在阶段1中成功提纯ATP-dependent proteolysis factor(APF-1)。APF-1是热稳定性很好的小分子蛋白。当时推想，APF-1是阶段2内存在的尚未认定的蛋白水解酶的活化因子，采用I125标记的APF-1以检测其相互作用的分子。但结果出现了令人惊奇的现象，125I -APF-1是以高分子梯状出现的，而且明确了这个修饰反应在ATP加水分解反应中是必要的。现在这个现象作为聚泛素化的现象是很自然的事情，但在当时不难想象他们惊讶的程度。与原来的预想不同，1980年，APF-1被认为是底物蛋白质与所消耗的能量共价结合的产物。现在有必要介绍一下泛素的研究历史，最初在1975年，Goldstein把它当作胸腺激素的一种发现的，但不久就明确了其不过是标本中混入的物质，也就是说，泛素是一种“被错误发现的分子”。但是正是在这个研究，创造了“泛素”这个名字得以流传史册。Goldstein等人，为了强调这个物质在所有的组织细胞中普遍存在，即其普遍性（ubiquity）,称其为泛素（ubiquitin）。在1977年，Goldknopf和Busch在细胞周期的研究中认定了在染色体的组蛋白2A中与其异肽链结合的分子为泛素。这篇“泛素与蛋白质共价结合”文章为明确泛素修饰反应机制带来了光明。接着，在1980年，Hershko与其共同研究者一道证明了APF-1和泛素是同一物质。再次验证了泛素的功能。Hershko的泛素假说很快Hershko和Ciechanover提出了泛素在蛋白质分解中所起的基本作用的假说：泛素通过E1（活化酶）,E2（结合酶）,E3（连接酶）的多级反应，与目标蛋白共价结合，多数泛素分子枝状连接，形成聚泛素链，而聚泛素链成为蛋白水解酶攻击的标记，被捕捉到的目标蛋白被迅速的分解。这个“泛素假说”后来得到广泛的称赞。这个假说的要点在于代谢能量是泛素活化所必须的，从概念上讲，ATP的消耗在了蛋白分解的信号形成上了。这个假说，对于Goldberg等人所预想的ATP依赖性的蛋白水解酶的概念完全不同，这种对能量依赖性蛋白质分解机制的解释不亚于晴天惊雷。有必要说明的是，这一系列的研究的是由生物化学方法所取得的，而和当时蓬勃发展的分子生物学技术并无关联。在Hershko和Ciechanover提出泛素假说的最初5年间竟然没有竞争对手的出现，这在和平年代里是极为罕见的。当然，这也与当时大家都难以相信这种“当时难以想象的现象”有关，对于他们的假说的可信度人们总是投去怀疑的目光。这也是独创性到达了超世的境界，高处不胜寒的典型例子。但这种独创性过高的同时也常常带了些不幸。由于其超出常识，Nature,Science等世界超一流的杂志也不相信他们的发现，在很长一段时间内拒绝刊登。Varshavsky的遗传学的研究对于泛素系统离体作用的证明中，贡献最大的是Varshavsky和他的共同研究者，其门生很多，（Finley, Jentsch, Hochstrasser 等），现在仍然作为这个世界的带头人活跃着。Varshavsky在1977年，从原苏联莫斯科染色体研究所移居到了美国波士顿的MIT（麻省理工）。当时他主要在进行染色体的研究，由于这个关系，他注意到了Goldknopf和Busch关于泛素修饰的报告，并且围绕泛素化的组蛋白H2A的染色体相关机能进行了研究。以这个为契机，1980年左右 ，Varshavsky开始使用出芽酵母的逆遗传学技术对泛素系统进行研究。接着，将Hershko等在生化学所认定的E1,E2,E3等酶群所对应的酵母基因一个一个的分离出来。这些研究将明确了泛素链作为细胞体内实际分解信号的机能，将“泛素假说”的假说在文字上去掉了。同时他们以一连串的遗传学的研究取得了关于泛素系统相关的许多前瞻性的研究 成果。在当时，这一连串在Nature, Science, Cell杂志上发表的论文，在5年间席卷蛋白质分解的世界。考虑到他们的研究对后来人的影响，他们的工作是值得大加赞扬的。蛋白质水解酶体的发现作为精彩的范例，“泛素假说”从能量依赖性的蛋白质分解机制的观点来看，仍然有一个重大的缺陷，这就是泛素修饰只是ATP消耗的一个装置而已。1983年，笔者和Goldberg通过证明泛素修饰后的蛋白质分解仍然需要ATP的加水分解，因而主张“在蛋白质分解的过程中ATP依赖性的2段学说”。也就是说，虽然已经证明泛素以能量依赖性的信号附加机制，作为蛋白水解酶的攻击标识这个概念是正确的，但是实际上泛素修饰后的蛋白质分解仍然需要能量。这个假说的要点在于作为第二个ATP的消耗的分子机制，与原核生物一样，真核生物也存在着同样的ATP依赖性蛋白水解酶。这意味着在泛素登场前Goldberg的预测，一半是正确的。这个推断带来了称为蛋白水解酶体的ATP 依赖性的蛋白水解酶的发现。蛋白水解酶体最早出现在科学杂志上是1988年，但搞明白它的分子结构是在10多年以后。花费如此长的时间的理由在于这个酶体是一个分子量达到250万，总的亚基数达100个的生命科学史上最大最复杂的分子集合体。蛋白质水解酶体是和已知的蛋白水解酶从概念上完全不同的新奇酶体，它的发现路程，可以称得上是一部电视连续剧。笔者作为这个酶体发现及其之后的研究进展的当事人之一，很遗憾将不能在这里讲述“蛋白质水解酶发现故事”，不过，有兴趣的读者可以去看看我的个人主页泛素生物学研究的导火线本文讲述的不过是泛素发现的故事，对于其后泛素研究的进展，是难以用一言两语概括的。有关泛素依赖性蛋白质分解系统的生物学飞跃发展，而由这种突破所带来的是发现与其相关的疾病和患者也是愈来愈多。本文只想记述有关其生物学发现前驱性研究的一个例子。1980年，在进行细胞周期研究的一个日本团队（东京大学名誉教授山田正笃等）分离了可以诱导染色体异常凝固的温度感受性的变异细胞ts85，并报告了在将这个细胞进行非限制温度下培养时发现修饰组蛋白H2A的泛素消失。当时，对组蛋白泛素化研究的Varshavsky，注意到了这篇论文，获得了ts85细胞，证实了ts85细胞存在泛素活化酶E1的变异，并使用这种细胞证明了泛素参与短寿命蛋白质分解的。这篇1984年的报告是最初关于泛素系统在细胞内生理机能的里程碑式的论文。同时对ts85细胞研究也成为了研究泛素在控制细胞周期中重要性的重要手段。1983年，Hunt发现了在细胞分裂期间周期性变动的蛋白质CyclinB, 接着在1991年，由Hershko团队和Kirschner各自独立发表了CyclinB的周期性分解和泛素依赖性蛋白质分解系统相关的论文，细胞周期的研究从此掀开了新的一页。接着，Hershko通过生化学的方法分离出CyclinB泛素化的E3连接酶，命名为cyclosome。这个多少有些夸大其词的名称来自能够检测到泛素化的CyclinB与其有20S的巨大分别。但是cyclosome最初也被投以怀疑的眼光。“所谓E3酶会不会是膜或是其他什么的尚未认定的分子的结合的产物呢？”等等疑问不绝于耳。而在1996年，出现了将这些疑问完全打消的事件。世界上几个不同的研究团队探明了cyclosome也称为APC(anaphase-promoting complex)的分子结构。其结果探明了APC是由10几个亚体构成的巨大分子复合体。现在成这个酶为APC/C。接着，京都大学的柳田充弘教授和Kim Nasmyth通过分离正在分离的染色体中异常诱导的酵母基因组，明确了APC/C构成亚基和其多数情况下的靶分子。这是证明在细胞周期控制中，泛素依赖性的蛋白分解系统的重要性的决定性事件。这个结果揭开了ts85细胞在非允许温度下染色体异常凝固的谜团，也使得对细胞周期M期，也就是染色体分配的机制的研究到达了分子水平。在以后对细胞周期的研究中，泛素系统的重要性也变得愈来愈重要。特别是SCF和Mdm2等新泛素连接酶的发现，对它们的研究，证实了在细胞周期的顺利进行中，check point的调控中泛素依赖性的蛋白质分解的中心作用。这些结果，确立了细胞周期是由蛋白质的磷酸化反应与泛素控制的蛋白水解控制的概念，这被称为近年来癌研究的最大成果。其后对泛素的研究距离1984年Finley,Ciechanover, Varshavsky使用ts85细胞，在Cell杂志上发表了“泛素与细胞内蛋白质分解相关”的文章已经20年了。2004年，Cell杂志为了纪念这个发现，刊登了当事人的回忆文章。按照与这个发现有关的Pickart的回忆，1984年与泛素相关的文章不足100篇，2003年已经超过了1000篇。这也从侧面反映了泛素研究的飞速发展。而且在生命科学领域的顶级杂志Nature, Science, Cell中，每期都登载有“泛素话题”，现在关于泛素的研究仍然处于未见衰减的快速发展中。泛素—蛋白水解酶体作为决定体内众多生体反应能够快速，顺序，一过性，单向进行的合理手段，在细胞周期，凋亡，代谢调节，免疫应答，信号传递，转录控制，质量管理，应激应答，DNA修复等生命科学中众多领域起到了中心的作用，已经成为了难以动摇的事实。对泛素的研究也取得了意想不到成果。举一个例子，最初提到的组蛋白的泛素化的研究中，也清楚了泛素也具有除了蛋白质分解外的机能，例如，现在已经探明，在胞饮，小泡运输等的选择，病毒的出芽等细胞内的物质流通系统，或是DNA修复，翻译控制，信号传递中，泛素是起到了信号分子的作用。再举一个例子，细胞存在着许多类似泛素分子（即泛素样蛋白质），它们独立形成了巨大的“蛋白质的由蛋白质进行的对蛋白质翻译后的修饰系统”。它们对通过基因信息的增幅基因的进行控制，能够发挥基因模体上没有的功能。更令人惊讶的是，泛素相关联的基因群，占基因总数的2-3%。泛素，真的是难以说是一种普通的蛋白质。泛素的发现中做出贡献的Hershko, Ciechanover, Varshavsky在2000年被授予Albert Lasker Award。ershko, Goldberg,Varshavsky等所发起的FASEB Summer Conference “Ubiquitin and Protein Degradation” 对泛素的研究进展有重大贡献。第一届在1989年，以后隔年召开，2004年为第8届。第一届的时候，参加者主要是上面3位伟人与其弟子。不过是泛素研究者的小型聚会。现在，这种情况已经改变，参加者半数以上是笔者不认识的年轻研究者。加之从2003年开始，由CSH symposium组织的“泛素之家”，今后，这两个会议将交替每年举行。而且关于蛋白水解酶将于2005年在Clermont-Ferrand(法国)举行第6届Proteasome Workshop。这些定期的国际会议以外，Keystone Symposium和EMBO workshop还对泛素话题频繁举行不定期的会议。从这些情况来看，现在泛素的正处在蓬勃发展的时期。但令人遗憾的是，高潮之后的世界将是怎样的，仍然是未知的。果真能够给生命的理解带来福音么，或是仍然徘徊在谜乱的深渊。对于笔者个人来说，虽然并不指望过长的寿命，但想在泛素的研究看见完结的曙光时告别这个世界。

诺贝尔化学奖2000年Hershko, Ciechanover, Varshavsky获得Albert Lasker 基础医学奖。这个奖被称为其获得者的一半将获得诺贝尔奖，从这个时候起，泛素开始被视为诺贝尔奖的候选者。在第二年也就是2001年，以“Regulation of cellular function by the ubiquitin-proteasomesystem”为题目的第34回诺贝尔学会在斯德哥尔摩的Karolinska研究所召开，这次会议除了Hershko, Ciechanover, Varshavsky，Goldberg等人，还召集了细胞周期，免疫，神经等关于这方面研究的专家。接着，就如大家所知道的那样，2004年，Hershko, Ciechanover, Rose 等3人获得了诺贝尔化学奖。对于这个诺贝尔奖的获得，无论是当事人还是相关领域的研究者都是既欢迎又惊讶的。因为竟然“没有Varshavsky而是Rose”，“不是医学生理学奖而是化学奖”。相关影响Rose是使用ATP的酶反应学的权威，在初期和Hershko, Ciechanover共同进行研究，对泛素修饰反应的机制的探明有重大的功绩。其后，其在人才的培育上也有非凡的成就。在最初使用生化学手段主张泛素假说，这3名学者有极大的功绩。我个人的看法，Varshavsky未能获得诺贝尔奖的确是非常令人遗憾的。如果没有Varshavsky的杰出工作，现在对泛素的研究也难以扩展到现在这个地步。而且，Varshavsky在Nature, Cell, Science等杂志上刊登关于泛素系统的论文有数十篇之多。与此相对的是，此次获奖的3人几乎为0。大概这个所代表的意义是，现代的基因工学，分子生物学等现代技术的快速发展，这种进步的本身就应该带来人体基因解析的大幅进步，而这回这3个人使用的以前生化学和酶学的基础性的所谓低技术而有了这种新概念的发现，有特别重大的意义。 因此，授予诺贝尔奖是对这种独创发现的最初发现的表彰吧。诺贝尔委员会正是标榜自己来表彰这种“最初的发现”的。现代高度发展的生命科学量产了大量论文，而这回诺贝尔化学奖的授予也可以说是为这种真正带有独创意味的发现所做得特别警示吧。另外还有一件事，使这回得奖后在nature刊登的轶事。Hershko在诺贝尔医学和生理学奖颁布的第二天，他原来计划准备和孙女一起去游泳，结果从由堂兄打来的电话得到了被授予诺贝尔化学奖的消息（诺贝尔委员会是使用电报通知受奖者，而在这之前广播播发了短信，听到了这个消息的堂兄通知了本人）。也就是，对获得化学奖是极其意外的。是的，近年来，泛素的研究在医学，病态生理学等领域日渐扩大，很多人认为更应该授予医学生理学奖，实际上却是化学奖。这个化学奖，有必要把目光放在蛋白质作为配体的独特调节机制的发现及其生物学意义这一焦点问题，进行正确地认识。Hershko的智慧，Ciechanover卓越的技术和行动力，Rose深刻的酶学素养，这3个个性和才能毫不相同的科学家共同努力的结果，建立了泛素作为蛋白质分解信号的假说。从这3个人对确立基本概念的贡献出发，我想大概能够理解诺贝尔化学奖的意义。

这个问题还是得拿数据说话，外网上早有统计，但是诺奖并非一个文章讲的没明白，一般是一系列文章，但总有一篇开创性的“奠基文章”，也就是概念或理论被第一次提及的文章。以下横轴为奠基文章数量。