细胞的自噬反应论文

右哉 [细胞自噬] 2016-01-07

最近自噬的研究都很火，耐药不耐药，凋亡不凋亡的都开始往上扯了。

这篇文章的题目是："Ulinastatin Reduces the Resistance of Liver Cancer Cells to Epirubicin by Inhibiting Autophagy"，基本上可以作为入门级自噬研究的参考模板了。

文章思路是这样的：首先文章证明了EPI能诱导肝癌细胞自噬，而UTI能抑制这样的自噬；然后UTI能促进EPI诱导的细胞凋亡；接着证明UTI是抑制自噬从而促进了EPI诱导的凋亡；然后证明了UTI是通过NF-kB信号通路起到了这样的作用；最后做了一下成瘤实验。

我们就看第一个Fig，就基本能了解自噬他们究竟做了点啥。

自噬研究基本可以分这样几个层次：

1.证明自噬参与了你的研究表型：****western检测LC3，p62；LC3双荧光测细胞自噬流；电镜观测自噬；

自噬形成时胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。

但LC3的抗体会对LC3-II有更高的亲和力，所以往往会造成假阳性。所以通常会使用LC3的亚细胞结构定位来辅助实验。比如这篇文章所采用的就是HanBio Inc.（汉恒生物）的****mRFP-GFP-LC3的腺病毒进行分析的。

2.证明自噬在你的表型中起了关键作用：****加自噬抑制剂3-MA，激动剂rapamycin等，然后检测表型（功能）；

这里就用到了两种自噬抑制剂：3-MA和CQ（Chloroquine）。

3.找到表型与自噬衔接的分子：****检测自噬通路如pI3K 通路，Beclin-1，ATG家族各成员,看看哪个与表型呈现正相关变化;

4.基因操作3中的分子,检测自噬和表型****：说明该分子在衔接自噬和表型中的作用机制;

这一点需要运用到的也就是柯霍氏法则和回复实验。

…华丽丽的分割线…

李莫愁博士：****而普通的自噬研究，也就是这样一个模式：（感谢汉恒生物的蔡博士为我们整理）

自噬表型研究中，较为常用的就是采用汉恒的mRFP-GFP-LC3融合蛋白的腺病毒，对细胞进行了感染。mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP 荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。

就像是这样：

（2014，Kidney International，IF=）

（该实验所用自噬工具为汉恒生物Ad-mRFP-GFP-LC3双标腺病毒）

自噬（autophagy）被认为是维持细胞稳态的关键过程，也是对等压力源的反应，如营养缺乏，这可能会危及细胞的生存。当细胞接触到这些压力源时，原本在低水平发生以平衡生物分子的恒定合成的自噬，就会被大幅度上调。 这种上调会增加了细胞的吸收和降解，将大分子释放回胞质中以驱动必须的代谢反应并产生能量。

在正常和压力条件下，自噬对细胞健康的贡献，意味着这种严格调控和精确协调过程的重要生理和病理作用。事实上， 自噬在哺乳动物的发育过程中被发现是有用的。 此外，最近的研究发现自噬是各种疾病和病症的重要调节器。探索自噬在发育和疾病中的参与，对于更全面地了解这一途径的作用至关重要，并且可能对保持健康或治疗疾病有影响。

自噬的研究已经成为如今医学研究的常客，发文量也十分巨大，成为常规生物学现象来研究，但是有一些实验上的技巧值得探讨一二，例如一些试剂的使用等等

1、自噬相关试剂的使用。

①MDC: 取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L;

②Rapamycin: 用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配;

400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存;

③3-MA: 首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L;PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成；

用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。

文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主

④Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h

sigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些

⑤无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。

EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了。

⑥Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。

⑦sigma的氯喹的货号C6628。用氯喹做自噬抑制剂，293T细胞50uM就可以。1. 可以用双蒸水配制2. 配制后4度保存

不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后续的步骤，Chloroquine抑制自噬体与溶酶体的融合过程，autophgy不能完成，所以lc3才会累积。因此加了抑制剂lc3之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中的pH值，使溶酶体中的酸性水解酶丧失活性，从而导致“自噬溶酶体”不能降解，因此，位于自噬体和自噬溶酶体膜上的LC3不能按时降解，表现为LC3荧光长时间的保留或WB中LC3条带变粗。

⑧Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制剂）抑制EV71感染所引起的细胞凋亡，观察细胞的自噬情况。研究发现，抑制细胞凋亡能增加LC3-I转化为LC3-II以及p62的降解。

1. 雷帕霉素：作为以mTOR 为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用，推荐工作浓度为1μmol-10μmol；

2. 氯喹：氯喹（Chloroquine）作为溶酶体的抑制剂，可以抑制自噬体与溶酶体的融合从而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究，推荐使用浓度：10umol-50umol。

2、自噬诱导剂

正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的药物有：

(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激

(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）

(3) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿

(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂

(5) Rapamycin：mTOR抑制剂

(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂

3、自噬抑制剂

(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制剂

(2) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂

(3) Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）

衣霉素(tunicamycin from Slreptomyces sp., TM). Sigma-Aldrich 公司产品,货号:T7765 ;溶于DMSO中配成储存液,使用时DMSO终体积浓度不超过1/1000。

3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA). Sigma-Aldrich 公司产品,货号:M9281;溶于灭菌超纯水制成储存液。

氯喹二磷酸盐(chloroquine diphosphate salt,CQ) sigma-Aldrich 公司产品,货号:C6628;溶于灭菌超纯水中制成存液。

雷帕霉素(rapamycin), in DMSO, Sigma-Aldrich 公司产品,货号:R8781;

4、MDC染色焚光显微镜检测细胞自睡

单丹黄酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)是一种突光染料,被用作自吞泡的示踪剂。具体操作步骤如下:

(1)将处于对数生长期的HepG2细胞按常规方法消化后接种于6孔板,每孔接种1x106个细胞;

(2)细胞密度达到60%-70%时,弃去培养液,小心用PBS洗1遍,分别用含TG浓度为0、、1 nM的培养基及含Rapamycin (终浓度1 pM)的培养基继续培养24 h;

(3)弃上清PBS洗2遍,每孔加入含MDC(终浓度50 nM)的培养基于37 V、5% CCh的恒温培养箱中避光温育20 min;

(4)取出六孔板置于劳光显微镜下,Ih内观察细胞自唾发生情况并拍照。

5、流式细胞术检测细胞自噬发生率

(1)取对数生长期的HepG2细胞,接种于6孔板,培养24h之后,分别用含TG浓度为0、1、2、4、8uM的培养基继续培养24h和的TG作用不同时间(0、24、36、48、60h)后,取出六孔板,将上清收集到4 ml的离心管中;

(2)每孔加入2ml含MDC(终浓度50nM)的MEM培养基,于37°C、5%0?的恒温培养箱中避光孵育30 min;

(3)将收集的上清2000rpm,离心5min;

(4)弃掉上清,每管加入500ul含MDC(终浓度50 uM)的MEM培养基,吹打混句,37 °C避光解育30 min;

(5)取出六孔板,PBS洗2次,的胰酶消化2min, 1 ml的PBS吹打混匀收集到的离心管中,2000 rpm.离心5 min;

(6)弃掉上清,加1ml的PBS重悬,2000rpm,离心5 min;

(7)吸出800ul上清,剩余的200 ul吹打混勾;

(8)鲜育完的上清,2000rpm,离心5 min;

(9)弃掉上清,1ml的PBS吹打混勾收集到 ml的离心管中,2000 rpm,离心5 min;

(10)重复步骤(6)和(7);

(11)将上述两个相同浓度或相同时间点的两管混勾,过300目铜网上机检测。流式细胞

仪以488nm激发波长测定MDC染色的荧光强度。

LC3B WB: 1:2000

条件是15% SDS-PAGE, 正常跑胶至下沿即可，200mA 湿转45min 正常的PVDF，5%牛奶封闭1h，4C过夜摇动孵育，洗抗体3*5min即可

LC3B的Western-blot检测，配置的15%的分离胶，湿转250mA，60min

转自科研者言公众号 基金知识##细胞自噬的相关实验和方法，对实验很有用