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写论文的时候，通常要求大家以后写十篇左右的参考文献。参考文献的要求应该和你写的题目有关。你写的是会计论文，后面的参考文献是体育论文，是完全不行的。下面和小编一起来了解论文怎么查参考文献？ 论文参考文献通常需要10~15个左右，有些学校需要两个英文参考文献。参考文献通常有自己独特的格式，参考文献主要分为期刊和论文。许多学生不知道如何查看这些参考文献，其实并不难。最简单的方法就是直接从查重报告上抄下来。小编推荐的查重系统是Paperfree，将论文上传到该系统进行查重，通常等待15-30分钟左右，会有详细的查重报告。本查重报告将列出本文引用的一些参考文献，因此您只需将本查重报告上的一些参考文献原封不动地复制到您的论文中。这种查找参考文献的方法是最简单方便的，可以原封不动的复制，也可以保证参考文献的格式不会出错。 另一种方法是在早期写论文时阅读大量的参考文献，许多学生会记录这些参考文献的名称。您还可以阅读以前做的阅读笔记，并将这些参考文献摘录到论文中。
以下四种方式查找参考文献：
1.检索头牌：Pubmed
Pubmed作为美国国家医学图书馆所属的国家生物技术信息中心开发的一款论文搜索引擎，凭借其海量的文献数据和简便快捷的搜索方式，成为了网上使用最广泛的生物医学方面的文献搜索工具。我们可以通过最简单的在标题和摘要中搜寻相关的关键词或相关公式，来寻找相关的文章。
2.用之不易的Google学术
这个其实并不能算是文献检索工具，但其有个很大的特点就是能够对全文进行搜索，而不是像上面说的那两个只是搜索标题和摘要。因此当要搜索事实型依据的时候，比如，要搜索“某病的发病率为36%”这样的出处，在摘要中可能没有具体的数据，所以需要google来进行全文搜索。
Google学术的功能还是挺强大的，不过在天朝却被封了，要是想用还得翻墙。不过不知道是应广大学者的呼唤，据说，最近Google又可以用了，这机会可是来自不易，小伙伴们还是抓紧时机享受这一福利吧。
3.关联检索：Web of Science
这个方法比较适合研究机构，因为Web of Science的数据库是要收费的，但其搜索引擎比Pubmed更高级，不但能够限定文章的学科，还能限定作者的国籍单位等等，非常好用。值得一提的是它里面的逻辑连接词比Pubmed多了一个很实用词——Near，这个能在相邻的两个句子中寻找关键词。比方说要搜索高血压和糖尿病的关系，如果使用一般”AND“来连接，可能会出现头一句是说的糖尿病，然后结尾出来个高血压，其实并无联系。但用”Near”的话，由于两个词之间的距离被限定了，因此相关的概率也会高的多。
4.中文检索：万方，知网，维普等。
生物制药参考文献黑海参多糖对β-淀粉样蛋白诱导的皮 刺参凝集素的分离纯化及其性质 玉足海参酸性粘多糖(抗栓胶囊)抗血 梅花参化学成分研究(I) 二色桌片参的化学成分研究I.二色桌 糙海参中三萜皂苷活性成分的研究 海洋生物制药 什么是生物开发 鱼类三倍体培育方法及现状 钝顶螺旋藻中蛋白质结合硒的研究 海胆生物习性 美味河豚鱼 海湾扇贝及其生活习性，生殖习性 黑乳海参中两个新的三萜皂苷 四种药物对刺参幼参毒性的初步研究 常用抗菌药物和消毒剂对刺参幼体的！
1 曾幼波.陈琴 抗癌新药--卡莫氟(HCFU) [期刊论文] -药物生物技术2003(2) 2 姚学清.林锋 肿瘤多药耐药和进展期大肠癌耐药细胞株建立研究进展 [期刊论文] -药物生物技术2003(9) 3 何娟.刘晓磊.彭文兴 P-糖蛋白介导的肿瘤多药耐药逆转机制研究进展 [期刊论文] -药物生物技术2006(3) 4 Warren A Increased accu-mulation of drugs in multidrug-resistant cells induced by lipo-somes 1992 5 Bennis P Enhanced eytotoxic-ity of doxorubicin encapsulated in polyisohexyl-cyanoacrylate nanospheres against multidrug-resistant tumor cells in culture 1993 6 Cuvier JM Doxorubicin-loaded nanospheres bypass tumor cell multidrug resistance 1992(3) 7 Nermti H Reversion of multj-drug resistance using nanoparticles in vitro:influence of the nature of the polymer 1996 8 张炎.鲁功成.张润清.陈晓春 阿霉素纳米粒的制备及体外逆转人膀胱癌细胞多药耐药的实验研究 [期刊论文] -药物生物技术2002(3) 9 Verdiere F Reversion of muhidrug resistance with polyalkyleyanoacrylate nanoparti-cles:towards a mechanism of action 1997(2) 10 廖文彬.黄惠琴.张开山.孙前光.鲍时翔 海洋放线菌HSL-6抗菌物质的发酵优化与性质研究 [期刊论文] -药物生物技术2005(4)
生物科学论文格式范文
无论是身处学校还是步入社会，大家都尝试过写论文吧，论文是对某些学术问题进行研究的手段。那么，怎么去写论文呢？以下是我为大家整理的生物科学论文格式范文，供大家参考借鉴，希望可以帮助到有需要的朋友。
摘要：
随着我国对科学技术的探究和发展，生物科学与技术研究成为21世纪以来人类关注的重点话题，其发展与人们的生活息息相关，改变着人们的生产活动和生活面貌。随着生物科学技术的不断成熟，生物科学逐渐运用于现代医疗领域、农学领域和工业领域，它对基因遗传和生物化学的研究也具有重大意义。因此，重视生物科学的发展与应用，是关乎生活的重要话题。本文从生物科学的应用、研究成果进展和生物科学技术对社会的影响三方面对生物科学的发展与应用进行阐述。
关键词：
生物科学；科学技术；发展；应用；研究进展
生物科学是对生命活动规律和生命本质进行研究的一门学科，是认识自然的有利工具。20世纪50年代以来，DNA双螺旋结构的构建和基因重组等技术的重大突破发展，使得现代的生物技术逐渐趋于成熟。生物科学的发展对医学领域和农业领域的发展有重大的推动作用。重视生物科学的发展对人类的生产生活带来了巨大的影响。
一、生物科学的研究成果及发展
（一）基因组计划的实施
破译基因的遗传码，解开生命的奥秘是基因破译的主要目的。目前，科学研究人员对遗传图、物理图和转录图的制作工作已由相关的制作单位完成，这在理论上具有重大的进步意义的同时也具有重要的实践意义和很高的商业价值。2013年的1月中国科学家成功破译了小菜蛾基因组，历时三年的研究，终于得出了小菜蛾的基因组图谱，科学家指出，将进一步与国内外人员合作交流，在小菜蛾基因组的研发完成后，将继续开展研究与抗药性和食性生长发育密切相关的功能基因组学和遗传学，为小菜蛾的有效防御、持续控制提供科学依据。
（二）细胞全能技术的实施与应用
随着人类基因组图谱的进一步发展，更多的生物模式经重要的动植物基因组将不断被揭露。细胞全能技术是一项快速纯合创造新品种的先进技术。21世纪后，生物的起源、原始细胞的产生和新生物的形式与改造等重大理论问题在我国已经得到重大的发展。人类对生物生命本质的'认识将会进一步的提高，这对生物细胞全能技术的理论性和实践性的发展都将会产生重大的影响，对新品种作物的选育具有指导性因素。
（三）生物识别技术
生物识别技术是指依据人类自身所固有的生理或行为特征而进行识别的一种技术。目前，应用最为广泛的包括有：指纹识别、手掌几何学识别、声音识别、面部识别等。生物识别具有不易遗忘、防伪性能高、不易被盗、便于携带等特点，容易和电脑配套使用，从而增强在使用过程中的自动化管理，已广泛用于胜负、军队、银行等地。但生物识别技术中由于其中一部分技术含量较高，现在还处于试验阶段。
二、生物科学的应用
（一）农业领域的生物科学技术
20世纪以来，在生物科学领域，分子生物学的诞生及现代生物技术的兴起已然成为人类社会进步最伟大的事件之一。20世纪末21世纪初，对基因组学的突破性研究推动了生物技术进入迅猛发展的阶段。动植物和微生物技术在农业领域的发展已对农业起到了极大的推动作用。不仅如此，转基因技术的推广应用使得农业得到了相应的发展。同时，抗病虫、除草剂的使用推进了转基因棉花、玉米、花生、大豆等的商业化发展。现代分子生物学与传统的动植物育种学催生了新型的分子育种学。
（二）生物科学在医学上的应用
药品领域的开发对生物科学的运用已达到相对成熟的阶段。改革开放后，生物技术制药受到了相对高度的重视，为生物高新技术的发展投入了大量的人力财力，因此，我国生物技术制药得到了快速的发展，已达到国际水平。2013年7月，深圳华大基因研究院亚洲癌症研究组织合作完成干细胞癌基因研究项目，这是继乙肝病毒整合机制研究之后的又一项重要生物科学研究成果。通过对88例癌患者进行全基因组测序，发现了一些列与肝细胞癌发生发展相关的基因突变，找到了肝细胞癌发生的两条关键性途径，从而为日后肝细胞癌治疗法的药物开发奠定了基础。
三、生物科学对社会带来的影响
20世纪70年代以来，随着生物科学的发展，生物科学基础的研究取得了不断突破。我国的生物科学技术成果在世界范围内得到了公众认可。在工业化和商业化飞速发展的今天，生物技术具有了良好的发展环境。通过对社会各个领域的发展经验总结得出，生物科学技术的发展仍然面临着众多挑战。我国的科研管理部门应对高校或科研组的科研项目加大人力财力的扶持，鼓励更多的青年科学家、技术专家投身于生物科学的研究中，并为他们提供多学科的培训，使得多学科科学的发展能具有高度的综合性，从而推进多领域的融合，促进现代社会生物科学技术的革新与健康发展。
四、结束语
生物科学技术的研究是科学应用研究的源泉，随着科学技术的进步和多种学科的融合发展，生物科学逐渐从单一化发展为多层次、多方面的科学技术，由宏观逐步发展到微观的可操作性。生物科学的发展对人们的生产生活产生了重要影响，赢得了人们越来越多的关注。我国的生物技术在发展中不断突破，研究成果已遍布全世界，相信如此下去，将会赢得生物科学的巨大成果。加大生物科学技术的研究进程，促进现代生物科学技术的良性有利发展，以实现我国科学技术又快又好的发展。
参考文献：
[1]周宜君,张淑萍,杨林等.民族高校生物科学类综合性、研究型野外实习的探索与实践――以中央民族大学实验基地为个案[J].民族教育研究,2009,20(5):18-22.
[2]郝建华,卢祥云,韩曜平等.应用型本科生物科学专业人才培养方案的构建――以常熟理工学院生物科学(师范)专业为例[J].新课程研究(高等教育),2011,(3):14-16.
[3]赵格日乐图,苏亚拉图,哈斯巴根等.生物科学专业野外综合实习教学改革与实践――以内蒙古师范大学生物科学专业为例[J].内蒙古师范大学学报(教育科学版),2011,24(5):148-151.
[4]李朝晖,周峰,华春等.高校生物科学专业人才培养方案的改革与实践――以南京晓庄学院生物科学专业为例[J].南京晓庄学院学报,2013,25(5):66-68.
[5]叶辉,丁斐,王兆慧等.特色专业与重点学科一体化建设实践与探索――以南通大学生物科学特色专业与生物学重点学科建设为例[J].安徽农业科学,2012,40(23):11885-11887.
格式
（一）题目
科学论文都有题目，不能“无题”。论文题目一般20字左右。题目大小应与内容符合，尽量不设副题，不用第1报、第2报之类。论文题目都用直叙口气，不用惊叹号或问号，也不能将科学论文题目写成广告语或新闻报道用语。
（二）署名
科学论文应该署真名和真实的工作单位。主要体现责任、成果归属并便于后人追踪研究。严格意义上的论文作者是指对选题、论证、查阅文献、方案设计、建立方法、实验操作、整理资料、归纳总结、撰写成文等全过程负责的人，应该是能解答论文的有关问题者。现在往往把参加工作的人全部列上，那就应该以贡献大小依次排列。论文署名应征得本人同意。学术指导人根据实际情况既可以列为论文作者，也可以一般致谢。行政领导人一般不署名。
（三）引言
是论文引人入胜之言，很重要，要写好。一段好的论文引言常能使读者明白你这份工作的发展历程和在这一研究方向中的位置。要写出论文立题依据、基础、背景、研究目的。要复习必要的文献、写明问题的发展。文字要简练。
（四）材料和方法
按规定如实写出实验对象、器材、动物和试剂及其规格，写出实验方法、指标、判断标准等，写出实验设计、分组、统计方法等。这些按杂志对论文投稿规定办即可。
（五）实验结果
应高度归纳，精心分析，合乎逻辑地铺述。应该去粗取精，去伪存真，但不能因不符合自己的意图而主观取舍，更不能弄虚作假。只有在技术不熟练或仪器不稳定时期所得的数据、在技术故障或操作错误时所得的数据和不符合实验条件时所得的数据才能废弃不用。而且必须在发现问题当时就在原始记录上注明原因，不能在总结处理时因不合常态而任意剔除。废弃这类数据时应将在同样条件下、同一时期的实验数据一并废弃，不能只废弃不合己意者。实验结果的整理应紧扣主题，删繁就简，有些数据不一定适合于这一篇论文，可留作它用，不要硬行拼凑到一篇论文中。论文行文应尽量采用专业术语。能用表的不要用图，可以不用图表的最好不要用图表，以免多占篇幅，增加排版困难。文、表、图互不重复。实验中的偶然现象和意外变故等特殊情况应作必要的交代，不要随意丢弃。
（六）讨论
是论文中比较重要，也是比较难写的一部分。应统观全局，抓住主要的有争议问题，从感性认识提高到理性认识进行论说。要对实验结果作出分析、推理，而不要重复叙述实验结果。应着重对国内外相关文献中的结果与观点作出讨论，表明自己的观点，尤其不应回避相对立的观点。论文的讨论中可以提出假设，提出本题的发展设想，但分寸应该恰当，不能写成“科幻”或“畅想”。
（七）结语或结论
论文的结语应写出明确可靠的结果，写出确凿的结论。论文的文字应简洁，可逐条写出。不要用“小结”之类含糊其辞的词。
（八）参考义献
这是论文中很重要、也是存在问题较多的一部分。列出论文参考文献的目的是让读者了解论文研究命题的来龙去脉，便于查找，同时也是尊重前人劳动，对自己的工作有准确的定位。因此这里既有技术问题，也有科学道德问题。一篇论文中几乎自始至终都有需要引用参考文献之处。如论文引言中应引上对本题最重要、最直接有关的文献；在方法中应引上所采用或借鉴的方法；在结果中有时要引上与文献对比的资料；在讨论中更应引上与论文有关的各种支持的或有矛盾的结果或观点等。一切粗心大意，不查文献；故意不引，自鸣创新；贬低别人，抬高自己；避重就轻，故作姿态的做法都是错误的。而这种现象现在在很多论文中还是时有所见的，这应该看成是利研工作者的大忌。其中，不查文献、漏掉重要文献、故意不引别人文献或有意贬损别人工作等错误是比较明显、容易发现的。有些做法则比较隐蔽，如将该引在引言中的，把它引到讨论中。这就将原本是你论文的基础或先导，放到和你论文平起平坐的位置。又如科研工作总是逐渐深人发展的，你的工作总是在前人工作基石出上发展起来做成的。正确的写法应是，某年某人对本题做出了什么结果，某年某人在这基础上又做出了什么结果，现在我在他们基础上完成了这一研究。这是实事求是的态度，这样表述丝毫无损于你的贡献。有些论文作者却不这样表述，而是说，某年某人做过本题没有做成，某年某人又做过本题仍没有做成，现在我做成了。这就不是实事求是的态度。这样有时可以糊弄一些不明真相的外行人，但只需内行人一戳，纸老虎就破，结果弄巧成拙，丧失信誉。这种现象在现实生活中还是不少见的。
（九）致谢
论文的指导者、技术协助者、提供特殊试剂或器材者、经费资助者和提出过重要建议者都属于致谢对象。论文致谢应该是真诚的、实在的，不要庸俗化。不要泛泛地致谢、不要只谢教授不谢旁人。写论文致谢前应征得被致谢者的同意，不能拉大旗作虎皮。
（十）摘要或提要
以200字左右简要地概括论文全文。常放篇首。论文摘要需精心撰写，有吸引力。要让读者看了论文摘要就像看到了论文的缩影，或者看了论文摘要就想继续看论文的有关部分。此外，还应给出几个关键词，关键词应写出真正关键的学术词汇，不要硬凑一般性用词。
中国门禁网论坛上应该有或者直接登陆中国门禁网首页查寻
随着计算机科学技术的飞速发展,计算机安全防护已成为企业生产中计算机应用系统重要基础工作。下面是我为大家整理的计算机网络安全技术 毕业 论文，供大家参考。
计算机安全常见问题及防御对策
摘要： 文章 首先分析了引发计算机使用安全问题的原因，分别从硬件缺陷与软件系统漏洞两方面来进行。其次重点探讨安全问题的解决对策，以及日常使用中的风险防御 方法 ，能够帮助减少计算机设备的运行隐患，使用者更高效的完成工作任务。
关键词：计算机安全;网络环境;软件安全
1计算机安全常见问题分析
硬件方面的安全问题分析
第一，芯片陷阱。计算机设备在网络环境中运行时，自身硬件系统中存在的隐患会增大病毒入侵的几率。常见的硬件问题是芯片中存在的漏洞，使用这种芯片的计算机设备自身不具备风险防范能力，虽然能够满足日常使用需求，但一旦接入到网络端口中，黑客攻击便有迹可循。借助芯片中存在漏洞，进入到用户的计算机系统中，盗取个人信息，严重者还会借助这一漏洞对用户计算机设备进行攻击，引发使用阶段的稳定性。第二，电磁泄露。同样是盗取用户的个人信息文件，但与芯片漏洞不同，该种方法是通过捕捉电磁传递信号来实现的。黑客通过编写程序来实现对用户个人信息的盗取，截取到的磁波信号也会通过程序对内容进行翻译，这样黑客便实现了侵入用户计算机设备的目的。计算机维护人员对这种安全隐患问题的重视程度偏低，由于入侵原理比较复杂，通过对磁波加密能够避免安全隐患问题发生。但现存问题是这一安全防护 渠道 并没有得到重视，缺乏针对性的管理方案。第三，硬件故障。网络系统中计算机最先受到攻击的是软件系统，随着病毒入侵范围逐渐扩大，也会威胁到硬件系统的安全。如果计算机硬件中自身存在漏洞或者损坏，安全隐患发生的几率更大，在硬件中，存储了大量数据信息，计算机与网络端口连接时也是通过搜索查找信息来实现的。硬件故障不但会影响到使用安全，同时上网速度也会有明显的减慢，不能满足用户使用需求。与软件系统中存在的漏洞相比较，硬件问题更难修复，通常需要进行更换处理，已经损坏的硬件如果继续使用，会影响到计算机功能实现。
软件方面的安全问题分析
第一，窃听。明确硬件中常见的问题后，软件 系统安全 隐患也需要继续深入研究，针对设备使用期间的特征来进行。一旦软件系统出现漏洞，传输中的信息会受到黑客攻击，信息被第三方窃取后，计算机网络系统的稳定性会受到影响，工作人员也不能够实现预期的目标。软件问题在设备使用阶段最为常见，也是威胁计算机安全的主要因素。第二，病毒。在网络环境中运行的计算机设备，对安全隐患类型进行划分时，病毒所占的比重最大。病毒也分多种类型，常见的是对存储文件进行破坏，一旦损坏很难恢复。还有对用户重要账号密码进行盗取，造成使用者的经济损失。第三，网络钓鱼。所谓的网路钓鱼就是一些网络黑手，通过制作一些色情或者是仿冒的网站来获取网民的相关信包，直接造成网民信息的泄露，严重地还会让网民为此付出严重的经济代价。第四，伪装和篡改。对于计算机软件安全问题中的伪装来说，主要是一些非法人员，通过各种技术手段和设备来伪装成合法的用户，然后对计算机或者是账户的相关权限进行盗取。所谓的篡改主要是对计算机中的各类信息进行篡改，另外，资料的完整性也会受到严重地影响，甚至严重地影响到资料信息的安全性。第五，垃圾邮件泛滥破坏网络环境。垃圾邮件一般是指未经过用户许可强行发送到用户邮箱中的电子邮件。垃圾邮件的泛滥已经使Internet网络不堪重负。在网络中大量垃圾邮件的传播，侵犯了收件人隐私权和个人信箱的空问，占用了网络带宽，造成服务器拥塞，严重影响网络中信息的传输能力。
2计算机安全常见问题的防御对策探究
加固技术。提升计算机设备使用安全性，需要对重要文件进行加固，减少受到破坏的可能性。加固技术还会针对使用期间的端口连接来进行。硬件加固是保护使用安全的有效条件，根据使用期间常常会发生故障的部位来进行，线路损坏会影响到网络的传播速度，造成损坏的原因多数是因为线路老化，对表面进行防腐涂刷，并且保持使用环境干燥，可以减少故障发生的几率。现场工作人员更要加强对线路安全的管理，硬件安全得到保障后工作效率会有明显的提升。
加密技术。设置防火墙，并对文件进行加密，能够避免病毒的侵入。计算机的操作人员也可以设立单独的密码，只有知道密码的人可以使用该设备，这样增大了安全性，同时也能避免设备中存储的重要资料被他人盗取。加密技术的运用很大程度的提升了设备运行安全性，可以与加固技术结合使用，并不会影响到计算机设备其他功能的实现。
认证技术。该种技术是针对黑客病毒篡改网络端口来进行的，在对系统中的数据进行访问时，需要通过认证环节，如果访问者信息异常，系统也会将这一状况进行反馈，提升计算机设备的使用安全性。常见的认账方式是通过在计算机内安装控件来实现的，能够确定规范的访问形式。数字签名又称之为电子签名，主要是将数字签名当作报文发送给接收者。对于用户来说，可以通过安全可靠的方法向相关部门提交资金的公钥，从而获取证书，进一步用户便具备公开此项证书的合法权益。对于需要用户公钥的人，均能够获取此项证书，并且通过相关合法协议的签订，从而使公钥的有效性得到证实。对于数字证书来说，将交易各方的身份信息逐一标识出来，进一步提供出验证各身份的方法，如此一来用户便能够使用这些方法对对方的身份进行有效验证。
杜绝垃圾邮件。垃圾邮件已经成为计算机网络安全的又一个公害。为了防止垃圾邮件首先要学会保护自己的邮件地址，避免在网上随意登记和使用邮件地址，预防垃圾邮件骚扰。其次使用Outlook—Express和Faxmail中的邮件管理功能，对垃圾邮件进行过滤设置，将垃圾文件拒之门外。目前许多邮箱都具有自动回复功能，使用不当垃圾文件就有了可乘之机，所以劝告用户谨慎使用邮箱的自动回复功能。另外对邮箱中的不明或可疑邮件最好不要打开，更不能回复，这样也能有效避免垃圾文件的骚扰和破坏。
提高计算机网络安全意识。计算机网络的安全管理，需要建立相应的安全管理机构，制定 岗位职责 ，实施网络系统的安全标准，提高计算机网络安全的管理能力、和业务水平。做好重要数据随时备份和加密，严禁重要数据泄露，定期维护计算机网络系统的安全运行，提高用户健康上网意识，防患于未然。通过本课题的探究，认识到计算机安全面临诸多常见问题。为了使计算机能够正常运行，同时保证人们生活及工作的可靠性及安全性，对计算机安全常见问题制定有效的解决 措施 便显得极为重要。然而，这是一项较为系统的工作，不能一蹴而就，需要从多方面进行完善。比如采取加固技术、加密技术及认证技术等。
3结论
除了诸多先进技术的应用，还需要构建系统化的计算机管理制度及监督机制，做到提前预警，充分保证计算机网络的可靠性与安全性。
参考文献
[1]杨常建,王进周,米荣芳.计算机安全面临常见问题及防御对策探讨[J].计算机与网络,2012(7).
[2]丁晨皓.计算机安全面临常见问题及防御对策探讨[J].中国新通信,2015(3).
计算机安全技术保护策略
摘要：网络普及的时代，计算机网络安全问题变得尤为重要，通过分析现在的网络安全问题，可以得知有些安全工作有待提高，针对具体问题提出相应的对策。
关键词：计算机;网络安全;措施
1计算机的网络安全问题
计算机网络系统方面的安全问题
XP、Vista、window7、window8等 操作系统 是计算机网络必不可少的一个平台，但是这些系统都存在着一定的安全风险，使不法分子会对计算机进行非法访问，从而窃取用户的重要信息或者直接将带有病毒的代码植入到系统中，导致系统的破坏或者瘫痪，对用户造成严重的损失。
计算机病毒、木马对网络安全的威胁
现在处于网络无处不在的时代，人们随时随地都能够上网，利用网络进行各种事情。网络的这种开放性，给黑客进攻提供了很多的机会，使木马和病毒对计算机进行侵害。计算机病毒主要是通过网络和硬件设备进行传播，它的破坏性在于破坏计算机的数据信息和硬盘，在计算机系统中自由复制，对系统造成损害。病毒主要是通过论坛或者电子邮件等进行网络传播，由局域网感染到整个网络。光盘、软盘、U盘等存贮设备是计算机病毒硬件传播的主要途径。现在的病毒，木马具有很大的伪装性，它通过各种媒体载体欺用户，只要用户点击了，程序就会自动下载并且安装，更有甚者，被病毒入侵的程序会读取用户的联系人，给他们发送病毒或者欺性的信息，引起一连串的破坏。
用户身份存在安全隐患
人们使用网络时通常需要账户和密码，而这些账户和密码的设定都是由自己设定的，无论是网络密码，还是登录密码或者是支付密码，都需要用户谨慎的操作，设置密码的时候尽量选用复杂的不易被人解除的密码，这样才能减少重要信息向外泄露的可能性。很多黑客就是通过伪造用户的身份，窃取或者篡改重要的信息资源。
2计算机网络安全的现实状况
网络犯罪普遍
在这个网络普及的时代，可以看到到处都有电脑，几乎人人都是通过电脑和外界进行着联系，每个人或多或少的都是电脑专家，也就是说每个人都有权利和机会去使用电脑，同时这也代表着每个人都有可能通过网络进行犯罪，如窃取他人的重要信息，对他人造成问题或者损失。
计算机用户缺乏网络安全意识
计算机网络安全意识对于每个人来说包含两方面的含义，一是，每个人都应该有保护自己计算机内的信息不被他人盗取，所以在平时联网做各种事情的时候，应该有安全方面的意识或措施;二是，每个人除了保证自己的网络安全外，还应该确保自己不会对其他人造成伤害，更不要想着去窃取别人的重要信息。
黑客攻击技术具有很强的先进性
并不是每个人都是黑客攻击的对象，他们更趋向于有商业价值的用户，他们为了实现自己利益最大化，往往会伪装成各种方式进行病毒植入，从而窃取用户的重要信息，获得利益。
3保证计算机网络安全的措施
计算机网络物理方面的安全措施
首先，应该保证网络线路的隐蔽性和安全性，保证周围的环境不会因为自然原因或者人为原因对网络造成干扰或者破坏;其次，计算机的硬盘或者设备在质量上应该是良好的，不能因为质量不合格而造成信息的泄露或者损坏。
技术
(虚拟专网)技术的核心是隧道技术，它将网络数据进行加密，通过虚拟的通道把信息传递到另一端，可以保证数据的安全性。
提高计算的入侵检测技术，充分发挥防火墙的作用
计算机网络安全的主要内容就是硬件和软件安全，防火墙的设置主要就是通过设置软件防火墙和硬件防火墙来保驾护航的。防火墙的工作原理就是在内部网络和外部网络之间保证信息的安全，设定好哪些是可以访问的信息，哪些是可以需要提示的信息，哪些是直接拦截掉的信息。计算机正常的操作系统，当出现与设置情况不同的时候，计算机就会自动拦截并提醒用户，检测是否有入侵行为。一个安全的网络环境是保证用户正常使用的前提，也是用户财产安全的根本保障。
做好计算机病毒防范和防治工作
计算机病毒就是根据软件自身的缺陷编写出来的，这种病毒具有更为先进的编程，且更不易被人识别与制止，病毒一旦植入计算机，就像脱缰的野马疯狂地复制病毒，对计算机造成很大的干扰和破坏，不能处于正常的工作状态。计算机病毒存在很大的威胁性，对它的防范工作必须做到万无一失。一般情况下，主要是通过三步病毒进行处理：预防、检测、消除。最常用的计算机病毒防范措施就是安装杀毒软件，当软件发现病毒时，第一时间就对它进行查杀，在病毒还没有植入到计算机软件，对系统造成伤害时，就把它扼杀在摇篮里。常见的病毒防治方法有加值总和法(CheckSUM)、移植检查法和疫苗程序法。加值总和法就是将查出来具有病毒的原文件用没有病毒的备份文件进行替换，将源程序中中病毒的识别码改正，生成新的识别码。采用工作站防病毒芯片和StationLock网络防毒方法。
对漏洞进行扫描
每个系统无论花费了多少财力和安全技术，都不可能完全的没有攻击之处，或多或少存在着一些不可避免的问题。
4结论
计算机网络安全问题关系到每一个计算机用户的安全，为了营造安全的网络环境，每个人都应该树立安全意识，坚持文明上网。
引用：
[1]蔡艳.社交网络安全问题及解决对策[J].电子技术与软件工程，2016.
[2]张昆，胡文涛，郭鑫.浅析计算机网络安全分析[J].信息化建设，2016.
计算机安全技术分析
【摘要】随着我国计算机技术以及 网络技术 不断的发展,计算机的应用也逐渐的广泛,从而更好的推动各个行业的发展;但是计算机网络技术在给我的生活带来便利的同时,自身也具有一定的局限性,像漏洞、病毒的存在,不仅会影响计算机的正常使用,同时也会威胁到人们的生命财产安全;对此本文就计算机安全技术,结合安全的指标和安全防护的对策进行分析,并提出相关的见解,希望对于科学技术的发展有着积极促进作用。
【关键词】计算机;网络安全
近些年来计算机网络应用范围越来越广泛,网络安全的影响因素也逐渐增加,主要来自人员的操作、系统的漏洞、病毒的存在以及防火墙设计等方面的因素,影响计算机的信息不被保密和完整;对此合理的利用防火墙、加密技术、密钥技术以及生物识别技术等,从而更好的保证网络技术以及计算机系统的正常应用,保证社会群众的财产利益不受侵犯。
一、计算机安全的标准
计算机网络安全的标准主要是指信息的完整性,尤其是在利用计算机网络技术,进行信息传输时,传输的速度、质量以及完整都应该不被延迟和破坏;其次是信息必须是可用的,同时用户在使用信息时,必须是进过授权且保密的;而用户在使用信息时,该信息都是由授权机构及时进行操控的。最后当计算机网络技术安全的情况下,会为网络事故提供一系列的依据;对此计算机网络信息安全是非常有必要的。
二、影响计算机网络安全的因素
1、操作系统。随着网络技术不断的研发,以及技术应用的领域不断扩大,对于系统操作的安全却忽视,导致计算机网络技术存在一系列的安全隐患和系统漏洞,从而直接影响计算机信息的安全。但是随着人们安全意识的增加,也相继的设计出了防火墙等安全程序,但是由于影响操作系统的安全因素有很多,一但安全防护程序自身存在漏洞,导致其不能发挥很好的安全防护作用。
2、病毒。网络病毒主要是指在计算机程序中,编制特殊的指令;这个指令不仅会破坏计算机系统中的数据库,同时也可以对信息资源进行复制。而目前长常见的指令,主要是指一系列的非法人侵的代码,通过计算机系统的漏洞进行攻击,但是这些病毒常常是隐蔽不被发现,且传播快速快破坏程度大,一旦结合黑客技术,对于计算机会起到控制和破坏的作用。
3、操作问题。虽然计算机已经成为了人手必备的上网工具,但是对于计算机技术灵活操作的用户却非常得少,一旦用户的失误操作,会造成很大的安全威胁;加上用户对于防护技术应用的意识缺乏,导致计算机很容易受到病毒或是木马的侵害,直接威胁用户的个人信息以及生命财产的安全。
三、计算机网络安全技术
1、防火墙技术。防火墙是置于外部与内部网络之间的网络安全体系,防火墙的安装,可以有效的检查数据包,并根据自身检查的结果,有效的提醒用户及时的进行过滤和清理,给自身的计算机系统加以保护。
2、加密技术。加密技术的研发,对电子商务以及网络信息交易提供了有效的保证;而加密技术主要包括对称与非对称两种,其中对称加密技术,主要是指基于口令,将加密与解密运算提供想相同的密钥;而非对称加密技术,也是以口令为基础,但是加密与解密预算所使用的密钥不同,同时解密密钥也只有当事人自己知道,而其他人是不知道的。
3、智能卡技术。挂技术与密钥技术相似,同时也是基于密钥方式的一种按群操作程序;该用户的智能卡被赋予了指定的口令之后,当用户使用该只能卡时,输人的口令与网络服务器上的密码相同,从而用户在利用网络技术时,对以用户的信息起到很好的保护作用。但是此技术的应用也具有一定的局限性,因为数据加密技术并不能适合于所有的服务器,或是操作得系统使用。
4、生物识别技术。其生物识别技术,起初是机械密钥的使用发展,然后是数字密钥的应用和发展,最后经过优化发展到了生物识别技术,它是利用人体独特的身体特征,在利用网络系统操作时,对于其进行身份验证;尤其是指纹识别、声音识别等身体特征验证,是有效的通过外设,获得身体体征的数字图像,然后再输人到计算机系统中,当用户进行系统操作时,就会对于信息以及数据库等起到很好的保护作用。随着科学技术不断的发展,我国生物识别技术,已经从指纹发展到了视网膜、骨架等身份识别技术,从而更好的保证信息的完整性、保密性以及安全性。
四、 总结
综上所述,通过对于计算机安全技术的分析,发现对于计算机网络技术的防护,主要是对于病毒、木马、漏洞以及黑客技术的预防,对此结合计算机网络完全的标准,合理的利用防火墙技术、加密技术、智能卡技术、生物识别技术,与此同时,最主要的还是要有效的提升计算机用户的网络安全防护意识,通过灵活的应用网络安全防护技术,正确操作计算机系统是非常必要的,从而更好的保证自身的财产利益不受到侵害。
参考文献
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PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。下面是我整理的关于pcr技术论文，希望你能从中得到感悟!
技术的研究进展
摘要 PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，已被广泛地应用于水产、微生物检测等许多领域。该文从PCR技术的原理及应用方面进行了综述，并对其发展做出了展望。
关键词 PCR技术;研究进展;应用
中图分类号 Q819 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2012)10-0047-02
PCR(polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。1985年，美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR(mutiplex PCR)技术[4]、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术[5]、单分子PCR技术[6]。
1 PCR技术原理
PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94 ℃的条件下变性解链;第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55 ℃退火;第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。
2 PCR技术的分类
在传统PCR技术的基础上，根据人们的需要以及各个领域的应用要求，又衍生出很多种类的PCR技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进，为进一步的研究提供了基础。
实时荧光定量PCR技术
1996年，学者经过研究，在传统PCR技术的基础上，首创了实时荧光定量PCR技术，新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃[8]。
荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[9]。实时监测这一特点是常规PCR技术所不具有的，因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[10-11]。一个PCR循环反应结束之后，定量PCR仪可以收集1个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况，这样就可以得到1条荧光扩增曲线[12]。荧光信号在指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析[13]。
多重PCR技术
多重PCR(mutiplex PCR)技术是PCR技术的一种，为同一管中加入多对特异性引物，与PCR管内的多个模板反应，在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段[14]。
在同一反应体系中，多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR的扩增效果[15]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率，如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR扩增效果[16]。
单分子PCR技术(SM-PCR)
单分子PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展的，基本循环过程相同，但在反应条件、模板数量、DNA 聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[17]。
单分子PCR技术反应中，DNA 模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应该严格控制GC的含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物[18]。由于单分子PCR技术反应的变性温度(96~98 ℃)大多比常规PCR技术(94 ℃)略高，因而对DNA 聚合酶热稳定性的要求也更加严格，需要有较好的热稳定性，以防止温度过高而使其失活。其变性时间(5~15 s)、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术[17]。
3 PCR技术的应用
PCR技术在水产上的应用
基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化，或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-time PCR技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK以及PEPCK表达量的影响[19-21]，研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据。孙淑娜等[22]研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响，表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer et al[23]以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料，采用实时荧光定量PCR技术，检测了P450aromA和P450aromB在不同组织的表达量，表明在各组织中均有2种基因的表达，但表达量显著不同，呈现组织特异性。
PCR技术在微生物检测上的应用
1990年，Bej et al[24]在利用多重PCR的方法检测了Leg-ionella类菌种和大肠类细菌，其结果是通过点对点方法固定的多聚dT尾捕捉探针和生物素标记的扩增DNA进行杂交来检测的。张志东等检测口蹄疫病毒(FMDV)持续性感染的带毒动物，表明实时荧光定量PCR技术具有快速检测、准确、客观等优势，较优于传统的检测方法[25-26]。Metzger-Boddien et al[27]对PCR-ELISA的方法进行了评价，结果显示，样品中沙门氏菌的检出率可以达到98%。
4 展望
传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用。多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用;未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面，其次是整合应用多重PCR与其他技术，必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。
5 参考文献
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分子生物技术在微生物降解环境 污染物中的应用 [摘要〕介绍了与环境微生物关键降解酶基因的筛选、克隆及应用相关的分r生物技术，包括聚合酶链式反应技 术、基因重组技术、荧光原位杂交技术和生物信息学等技术，并对这些技术在污染物降解基因检测、筛选和克隆方 面的应用进行了阐述与探讨、 [关键词]分子生物技术;微生物;基因;环境污染物;降解 随着现代j:\地技术的发展，多环芳烃、含氯有 机物和硝基苯类化合物等人工合成井难以降解的 污染物大量排放，造成世界范围内的环境污染和生 态破坏，严重地威胁人类和其他生物的正常生存和 发展。利用微生物修复技术对受污染的水体及土 壤进行处理，凸显了其重要的意义和可行性。研究 人员发现并筛选到一些微生物，它们不仅对环境有 较高的适应性、对污染物有较高的耐受性，而且对 污染物有较强的降解效率和专一性。然而环境中 存在的大量微生物中仅有少于1%可通过传统的培 养方法进行培养、分离和纯化，绝大多数细菌需要 非常严格的营养条件川。因此，为了对修复环境有 所贡献却难以培养的微生物进行更全面了解，也为 了筛选到更多有利于降解环境污染物的微生物菌 种及其关键酶基因，分子生物技术和手段逐渐被广 泛应用到环境可降解污染物及降解机理方面的研 究中。 本文对近年来发展起来的聚合酶链式反应 (PCR)技术、基因重组技术、荧光原位杂交(FISH) 技术和生物信息学等多种分子生物技术进行了介 绍，并总结了它们在污染物降解基因检测、筛选和 克隆方面的应用。 1与环境污染物降解相关的分子生 物技术 及其相关技术 PCR是一种利用脱氧核糖核酸(DNA)半保留 复制原理，在体外扩增位于两段已知序列之间的 DNA区段从而得到大量拷贝的分子生物技术。根 据其模板、引物来源或扩增条件的不同，PcR技术 可分为以下几种:(l)反转录pCR(RT一PeR)技 术，将mRNA反转录为cDNA后再对其进行PCR 扩增，可用来构建cDNA文库，分析不同生长时期 的mRNA表达状况和相关性以及mRNA的定量测 定等;(2)巢式PCR技术，在扩增大片段目的DNA 时，先用非特意性引物扩增再用特意性引物对第一 次扩增产物进行第二次扩增，以获得可供分析的 DNA;(3)竞争PCR技术，是一种定量PCR，向PCR 反应体系中加人人工构建的带有突变的竞争模板， 通过控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度， 对目的模板作定量研究;(4)实时荧光定量PCR技 术，在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线 对未知模板进行定量分析，该法已广泛用于基因表 达研究、转基因研究等方面;(5)扩增的rDNA限制 酶切分析技术，根据原核生物rDNA序列的保守性， 将扩增的rDNA片段进行酶切，通过酶切图谱来分 析菌间的多样性;(6)RNA随机引导PCR技术，基 于任意寡核昔酸引物与RNA之间可能的配对，在 低严谨度条件下经聚合酶催化使链延伸，将细胞总 RNA或InRNA作为反转录反应的模板，此技术结 合单链构象多态性，用非变性胶分辨大小相同而构 象不同的片段，可用于诊断遗传突变及分析污染条 件下序列的多态性;(7)随机扩增多态DNA (RAPD)技术，是一种基于PCR检测PCR引物结合 位点序列改变的方法，通常以10bp的寡核昔酸序 列为引物，对基因组DNA随机扩增，电泳分离染色 扩‘增产物，再分析多态性。 技术 FISH技术利用荧光标记的探针在细胞内与特 异的互补核酸序列杂交，通过激发杂交探针的荧光 来检测信号。荧光探针比放射性探针更安全，具有 较好的分辨力，不需要额外的检测步骤。近年来， 由于FISH技术具有灵敏、便捷等优点，迅速发展完 善成为研究环境微生物的有力工具。此外，可用不 同激发和散射波长的荧光染料标记探针，在一步反 应中同时检测几个靶序列。该技术主要包括试样 固定、预处理、预杂交、探针和试样变性、杂交、漂洗 去除未结合的探针、检测杂交信号等步骤。由于 165rRNA具有遗传稳定性，因此成为FISH技术检 测最常用的靶序列。 基因重组技术 基因重组技术是从供体生物的基因组中通过 酶切扩增等手段获取目的基因，与载体连接形成重 组DNA分子，再导入到受体细胞中，让外源基因得 以表达。在已经分离出的许多菌株中，与降解能力 有关的基因多在质粒体上。由于质粒很容易在细 菌的繁殖过程中遗失，对细菌降解能力的长期稳定 非常不利，可将其与污染物降解有关的酶基因重组 到大肠杆菌等微生物中进行表达，以此构建的各种 生物降解特性增强的重组菌可用于污染环境的治 理修复或发酵某些废弃物。 生物信息学 20世纪后期，生物学的迅猛发展，从数量上和 质量上极大地丰富了基因组数据库、蛋白质数据 库、酶数据库和文献数据库等许多生物科学的数据 资源。已有多个国家和国际科研组织建立了生物 信息数据库，如欧洲分子生物学实验室(Eur叩ean MolecularBiologyLaboratory)核酸序列数据库和美 国国家生物技术情报中心(Nationaleente:fo:Bio- technologyInformation，NCBI)基因序列数据库等。 科学家利用计算机及生物信息分析软件分析这些 数据资源，确定大分子序列、结构、表达模式和生化 途径与生物数据之间的关系，区分生物个体间遗传 差异，揭示DNA多样性。例如，基本局部比对搜索 工具(BasieLoealAlignmentSearehTool，BLAST)， 是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似 性比较的分析工具。它基于Altschul等的方法「2〕， 在序列数据库中对查询序列进行同源性比对工作。 BLAST程序可对一条或多条、任何数量、任何形式的 序列在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对，甚 至将有缺口的比对序列也考虑在内，利用比较结果中 的得分对序列进行相似性说明。基因的序列分析可 揭示出生物物种之间的关系，在污染治理研究中可用 于生物基因组特殊区域或特异基因的测序。 2分子生物技术在环境污染物降解 中的应用 土壤试样总DNA的提取 用适当方法直接从土壤中提取DNA并纯化， 是从分子生物学角度对土壤微生物进行研究的前 提条件，而后可进行酶切、PCR扩增、核酸分子杂交 等分子生物学技术操作。从土壤中提取微生物 DNA主要分为汽接法和间接法}’{。直接法是在 ogram等的方法基础卜发展起来的，其主要包括2 个步骤:(l)原位细胞裂解;(2)DNA提取和纯化。 直接法提取的DNA超过细菌总DNA的60%且省 力，但提取的DNA常常有折断、腐殖酸污染、甚至 提取物中还夹杂有未知的胞外DNA和真核生物的 DNA。最先报道间接法的是Faegri等[‘〕，其主要包 括4个步骤:(l)分散土壤;(2)分离细胞与土壤; (3)细胞裂解;(4)DNA纯化。间接法提取DNA 产量低且费力，但纯度较高、DNA损伤小，提取的 大片段DNA可用来构建cos而d和细菌人工染色体 文库等。 采用PCR及相关技术扩增分析DNA片段 可降解污染物的微生物必然能产生分解代谢 该污染物的酶。selvaratnam等L’l用编码苯酚单加 氧酶dmpN摹因的RT一PCR技术来检测序列间歇 式活性污泥反应器‘{一，降解酚的假单胞菌。检测结 果表明，RT一PCR技术不仅能检测微生物降解酚的 能力，还能测量dmpN基因的转录水平，从而确定假 单胞菌特殊的分解活性，发现了在转录水平下，酚 浓度与通气时间之问存在正相关关系。 将PCR技术和变性梯度凝胶电泳(DGGE)结 合起来，在变性条件适当的情况下能分辨一个碱基 对，分辨率较高。染色后的凝胶用成像系统进行分 析，可在一定程度l几反应试样的复杂性。条带的多 少能反应试样「 一 }1微生物组成的差异，条带的亮度能 反应试样中微生物的多少。基于以上优点，日前该 技术在微生物群落结构的分析和动态研究方面得 到了厂‘泛应用。DGGE可通过分析PCR扩增的基 因点突变来探索微生物的复杂性。徐玉泉等[“〕从 某废水中分离出一株能以苯酚为惟一碳源的菌株 PHEA一2，使用PCR一DGGE技术对该菌165 rDNA进行分析，发现该菌与醋酸钙不动杆菌同源。 M盯sh等r了)利用PcR一DGGE技术获得了活性污泥 中真核微生物的种群变化情况。王峰等下8〕采用 PCR一DGGE技术对城市污水化学生物絮凝处理中 活性污泥和生物膜微生物种群结构进行了分析，结 果表明活性污泥培养前后微生物种群结构发生r 很大改变。 RAPD技术也是一种应用比较广泛的以多态性 引物来扩增某些片段的技术。RAPD技术可用于检 测含有混合微生物种群的各种微生物反应器中微 生物的多样性。用RAPD技术分析检测实验室规 模的油脂淤泥培养料中的细菌菌群发现，用油脂淤 泥改良过的培养料比未改良的更适于不同的微生 物种群生长[9j。vainio等t’。〕从516种孤立的菌落 中提取出165rDNA，经PCR扩增后进行测序，检测 活性污泥中微生物种群的结构。这些组合技术的 应用显著增强r对微生物的检测和鉴定能力，为理 论研究工艺优化及提高生物处理效率提供了条件。 基因重组 基因工程技术应用于环境保护起始于20世纪 80年代。其基本原理是通过基因分离和重组技术， 将目的基因片段，比如可编码降解某种污染物的 酶，转移到受体生物细胞中并表达，使受体生物具 有该目的基因表达显现的特殊性状，从而达到治理 污染的目的。找到特定污染的抗性基因，利用基因 重组技术转基因后也可获得其他抗性植株以及筛 选到可转化污染物的植物，还可开发超量积累植物 进行污染土壤的生物修复。 罗如新等L”〕用放射性同位素标记tfdc基因片 段作探针，Southemblot杂交定位Ll菌株的邻苯二 酚1，2一双加氧酶基因位于Pstl的I片段和BamH I的M、N片段，回收并将其直接克隆至表达载体 pKT230卜，获得的重组子能转化不具开环酶活性 的甲胺磷降解菌P2，得到高于天然宿主21倍的邻 苯二酚1，2一双加氧酶。stingley等{”〕通过构建基 因文库和重组质粒等基因工程方法证实了NidAB 双加氧酶是降解菲的关键酶类，并首次鉴定出此基 因通过磷苯二甲酸实现降解功能。chae等‘”}发现 不能降解苯酚的su如lobusso扣taricu、98/2菌株中 的儿茶酚2，3一双加氧酶基因与能降解苯酚的 sulfolo右u，，o如taricu、咫有[6J源区，分析得知它们 是山共同祖先进化而来。把儿茶酚2，3一双加氧酶 基因克隆到大肠杆菌中表达，可获得有较高降解活 性的双加氧酶。 重金属污染是环境污染的重要方面之一。随 着分子生物学技术的发展，越来越多的修复性蛋白 基因正被从植物、微生物和动物中陆续分离出来， 如汞离子还原酶基因、有机汞裂解酶基因、汞转运 蛋自基因、金属硫蛋白基因、植物络合素合成酶基 因、铁离子还原酶基因和锌转运蛋白基因L’‘〕。这些 基因通过基因工程的改造，重组到合适的受休细胞 中表达相应的蛋白质和酶，达到治理难以降解的有 毒有害污染物的目的。sorsa等〔”〕把MTS插人 LamB序列的153位点，在中表达MTs，解决 r细胞内MTs对金属离子有限的吸附能力。综L 所述，基因重组技术具有快速、高效的特性，已逐渐 成为环境生物技术的研究热点。 技术 FISH技术利用核糖体内长度适中(约1500bp)、 高度保守的165:RNA序列作为理想的基因分类靶 序列，其中使用的165:RNA寡核普酸探针一般是 进行了荧光标记的20bp左右特异性核昔酸片段， 利用该报告分子(如生物素、地高辛)与荧光素标记 的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测系 统对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 FISH技术能提供处理过程中微生物的数量、空间分 布和原位生理学等信息。 硝化细菌是一类生理上非常特殊的化能自氧 菌，传统的研究方法要经过富集、分离、分类和鉴定 步骤，耗时长。HSH技术的引人解决了上述困难。 FlsH技术还被广泛用于活性污泥系统、硝化流化床 反应器和膜生物反应器等废水处理系统}’61。 基因工程微生物越来越多地被用于农业害虫 控制和环境污染的生物修复，对人类健康和环境的 影响引起广泛关注。1994年出现了一种新的标记 系统:绿色荧光蛋白(GFP)，由于GFP基因表达产 物对细胞没有毒害作用，且由GFP产生的荧光标记 检测卜分方便、简单。在某些被污染的环境中可分 离出降解该污染物的细菌，通过基因重组等手段使 用GFP分子标记，可更容易的分离检测被标记的 细胞叫。 Bastes等[’8]进行了苯酚降解菌染色体GFP基 因标记实验。通过PCR和Southemblot分析，证明 GFP基因已成功整合到宿主细胞的染色体中。对 标记菌与野生型的降解能力比较结果证明，GFP分 子标记的插人并不影响细胞的苯酚降解能力。 用G即标记Pseudomonasputida，研究活性淤 泥中细菌存活情况{’9飞。Pseudomonasputida被转到 活性淤泥2min后，观察到细胞在淤泥絮凝物间自 由游动;培养3d后，发现荧光细胞减少，大部分已 被合并到淤泥絮凝物中，以防止细菌被原生动物捕 食。用oFP标记石.eozi和Serraliamarceseern，考 察菌株附到絮凝物卜的过程{’()j。使用表面荧光显 微镜能将带有GFP标记的细胞从活性污泥中区分 开，井进行观察和记数。而聚焦激光扫描显微镜 (cLsM)可使GFP标记细菌产生三维轮廓，结合表 面荧光显微镜和CLSM观察GFP标记细胞，结果表 明，细胞表面疏水性在细菌附到絮凝物的过程中起 重要作用，两种细菌附在絮凝物上的模式有很大不 同，通过这种方法可更好地理解细菌赫附机理，有 助于提高废水处理效果。 3结语 分子生物技术的应用使研究人员可从微观的 角度更细致深人地了解微生物对污染物降解的具 体生理生化机制，在分子水平 _ _ [揭示生物体吸收、 迁移、积累有害物质最终被毒害，及适应、抗性等生 态问题，从而筛选到更多有利用价值的微生物。随 着越来越多微生物全部基因序列的解码，对各种细 菌体内可降解基因的分布和表达会有更深人的了 解，有关技术的发展和成熟必将对污染物的降解过 程有一个整体的、生态水平上的认识。 参考文献 l李凤，刘世贵 . 分子生物学技术在环境微生物研究中的 应用 . 世界科技研究与发展，2003，25(4):88一92 2AltsehulSF，GishW，MillerW， mentsearehtool . JMolBiol，1990，215(3):403一410 3魏志琴，曾秀敏，宋培勇 . 土壤微生物DNA提取方法研 究进展 . 遵义师范学院学报，2006，8(4):53一56 4FaegriA，TorsvikVL，]andfunga] aetivitiesin5011:seParationofbacteriaandfungibyaraPid fraetionatedeentrifugationteehnique5011BiolBioehem， 1977，9(2):105一112 5SelvaratnamS，SehoedelBA，MeFarlandBL，etal APPlieationofreversetranseriPtasePCRformonitoring exPressionoftheeataboliedmPNgeneinaPhenol- degradingsequencingbatehreaetor . APPIEnviron Microbiol，1995，61(11):3981一3985 6徐玉泉，张维，陈明等 . 一株苯酚降解菌的分离和鉴 定 . 环境科学学报，2000，20(4):450一455 7MarshTL，LiuWT，ForneyLJ . Beginningamoleeular analysisoftheeukiU洲aleollllllunityinaetivatedsludge. WaterSeiTechnol，1998，37(4一5):455一460 8王峰，傅以钢，夏四清等.PCR一DGGE技术在城市污 水化学生物絮凝处理中的特点 . 环境科学，2004，25 (6):74一79 9涂书新，韦朝阳 . 我国生物修复技术的现状与展望 . 地 理科学进展，2004，23(6):20一31 10VainioEJ，MoilanenA，KoivulaTT，etal . ComParison ofpartial165rRNAgenesequeneesobtainedfromactiva- tedsludgebaeteria . APPIMierobiolBioteehnol，1997，48 (l):73一79 11罗如新，张素琴，李顺鹏 . 邻苯二酚1，2一双加氧酶
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I THINK IT IS GOOD. AND IT IS BETTER. PCR技术王霄鹏 推荐：栗瑞丰摘要：PCR是分子生物学的关键技术，又是常规技术。它的出现极大地推动了分子生物学的发展，旋即被迅速推广并应用到生命科学的各个领域。关键词：PCR、发展简史、基本原理、基本操作、主要应用 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）是体外扩增DNA序列的技术。它与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个分子生物学实验工作的基础。在这三种技术中，PCR方法理论上出现最早，实践中应用也最广泛。PCR技术使对微量的核酸（DNA或RNA）操作变得简单易行，同时还可以使核酸研究脱离活体生物。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，它极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。 PCR技术发展简史 人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。 1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学 分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。 PCR技术的基本原理和操作1. PCR的基本原理PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。2. PCR的基本成分PCR包括7种基本成分：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。模板DNA：包括基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增的DNA、cDNA和mRNA分子等几乎所有形式的DNA和RNA都能成为PCR技术反应的模板。除此之外，PCR反应还可以直接以细胞为模板。特异性引物：是一段与模板DNA链结合的寡核苷酸片段，对于DNA的扩增起到引发的作用。热稳定DNA聚合酶：这是PCR技术实现自动化的关键。热稳定DNA聚合酶是从两类微生物中分离的：一类是嗜热和高度嗜热的真细菌，另一类是嗜热古细菌。现在又出现了一种兼顾了几种DNA聚合酶特点的混合型酶。脱氧核苷三磷酸（dNTP）：是DNA合成的原料，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。二价阳离子：常用到Zn2+和Mg2+,作为构成热稳定性DNA聚合酶的成分之一。缓冲液：一般使用Tris-Cl缓冲液，标准的为10mmol/L,并将其调节到之间。一价阳离子：一般使用50mmol/L的KCl溶液，有利于改善扩增的产物质量。PCR的基本操作PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。PCR技术的基本反应由三个步骤组成：1. 变性：通过加热使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；2. 退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；3. 延伸：将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成DNA链延伸。以上三部为一个循环，新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。 PCR的主要应用最初建立PCR是为了扩增已知序列的靶基因。因为在PCR方法问世以前，要获得一个靶基因，必须建立基因文件库，然后从成千上万的菌落中通过Southern blot 杂交筛选含有靶基因的克隆。这样既费时又费钱，特别是在克隆真核生物基因时难度更大。自从建立了PCR方法以后，使克隆已知序列的基因变得非常容易。为了适应分子生物学的快速发展，PCR方法也得到了不断发展，现在PCR已应用到生命科学的各个领域。1. 基础研究方面的应用目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的：l 扩增目的基因和鉴定重组子；l 克隆基因；l 基因功能和表达调控的研究；l 基因组测序；l 制备单链模板；l 致突变；2. PCR在临床上的应用l 在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。l 在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。l 检测病原体l 在基因分型中的应用：当进行器官移植时并须先组织配型工作，此时常应用序列特异性寡核苷酸多态性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）进行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段长度多态性也可以用于对HLA的分型。3. 在法医学中的应用例如：最早应用DNA限制性片段长度多态性结合PCR-RFLP来进行法医学个体识别和亲子鉴定。目前发现在真核生物基因组编码和非编码序列中的短串联重复序列的重复次数在个体间存在着差异，因此可以使用短串联重复PCR技术对其进行分析。使用PCR技术进行法医鉴定的优点是样品用量小并且适于对高度降解材料的检测。除刚才提到的之外，可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法医学个体识别和亲子鉴定。所以，综上所述，PCR的确是一种分子生物学研究的基础技术。在它30多年的发展中衍生出了诸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突变PCR和定量PCR等十几种不同的技术方法。PCR技术可以为基因工程提供目的基因，并广泛地应用于个体识别、亲子鉴定、免疫配型、疾病诊断等方面。可以说，PCR已经渗透到了生命科学的各个领域。21世纪是生物工程的世纪。我相信，在今后的发展中PCR技术会不断地得到扩充和完善，PCR技术也将发挥着越来越重要的作用。参考书目：黄留玉，PCR最新技术原理、方法及应用，北京，化学工业出版社，现代生物技术与医药科技出版中心，2005年
写论文的时候，通常要求大家以后写十篇左右的参考文献。参考文献的要求应该和你写的题目有关。你写的是会计论文，后面的参考文献是体育论文，是完全不行的。下面和小编一起来了解论文怎么查参考文献？ 论文参考文献通常需要10~15个左右，有些学校需要两个英文参考文献。参考文献通常有自己独特的格式，参考文献主要分为期刊和论文。许多学生不知道如何查看这些参考文献，其实并不难。最简单的方法就是直接从查重报告上抄下来。小编推荐的查重系统是Paperfree，将论文上传到该系统进行查重，通常等待15-30分钟左右，会有详细的查重报告。本查重报告将列出本文引用的一些参考文献，因此您只需将本查重报告上的一些参考文献原封不动地复制到您的论文中。这种查找参考文献的方法是最简单方便的，可以原封不动的复制，也可以保证参考文献的格式不会出错。 另一种方法是在早期写论文时阅读大量的参考文献，许多学生会记录这些参考文献的名称。您还可以阅读以前做的阅读笔记，并将这些参考文献摘录到论文中。
毕业论文参考文献可以从图书馆或者中国知网上找。
毕业论文指的是你在大学期间对你所学专业的现实或理论问题进行科学探索且是有一定意义的论文，一般大学生在大三下半学期就可以为毕业论文做准备了，因为大四的上半学期要准备实习，下半学期要准备毕业答辩，等大四再去慢慢准备毕业论文时间是很仓促的。毕业论文的撰写过程要求是相当高的，学生要在相关教师的指导下，选定要写的课题才行，这也是从总体上考察一名大学生大学四年的学习成果。
毕业论文一般都包含以下部分：题目、署名、中文摘要、中文关键词、英文摘要、英文关键词（其中英文摘要和关键词要与中文摘要和关键词相对应）、引言（前言)、正文、参考文献、致谢辞和附录。其中对参考文献的要求和格式都特别严格，查找参考文献的过程也特别浪费时间，下面我将讲讲一些找参考文献的方法。
1.确定方向
不管你要找什么类型的参考，首先都要确定你的毕业论文写作方向，然后根据根据你的毕业论文主题去寻找你所需要的参考文献。所以，定方向是至关重要的一步。
2.找信息
找信息这一步是最耗费心血也是工作量最大的一步了，因为就算你明确了你要找的参考文献目标，但是这一类的参考文献实在太多了，所以找起来也不方便。这些都是你要面临的挑战。找参考文献的话主要有两种方法：①图书馆。不过这个图书馆的范围就有点大了，你可以利用学校的图书馆，毕竟每一所高校的图书馆都提供了很多的资源供大家使用。同时要是学校图书馆的还是不能找到你所需的参考文献，你也可以去当地的图书馆，每一个县级以上的地区都设有它们专门的图书馆，你可以去看看。
②网站信息。随着大数据时代的来临，我们查找资料也越来越方便了，只用动动手指就可以在网上查找到你所需要的资料。现在网上也有专门的网站为大家提供寻找参考文献的便利。比如中国知网和全国学术快报等。
3.信息来源
毕业论文的参考文献不仅仅是局限于一些专著，它还可以包括论文集、辞书、研究报告、期刊文章和报纸文章等。
所以其实找毕业论文的参考文献其实有多种途径，能找的文献也很多，只是在找的过程中比较麻烦，还有就是一定不要抄袭，要是在毕业论文出现抄袭现象后果是很严重的。
以下四种方式查找参考文献：
1.检索头牌：Pubmed
Pubmed作为美国国家医学图书馆所属的国家生物技术信息中心开发的一款论文搜索引擎，凭借其海量的文献数据和简便快捷的搜索方式，成为了网上使用最广泛的生物医学方面的文献搜索工具。我们可以通过最简单的在标题和摘要中搜寻相关的关键词或相关公式，来寻找相关的文章。
2.用之不易的Google学术
这个其实并不能算是文献检索工具，但其有个很大的特点就是能够对全文进行搜索，而不是像上面说的那两个只是搜索标题和摘要。因此当要搜索事实型依据的时候，比如，要搜索“某病的发病率为36%”这样的出处，在摘要中可能没有具体的数据，所以需要google来进行全文搜索。
Google学术的功能还是挺强大的，不过在天朝却被封了，要是想用还得翻墙。不过不知道是应广大学者的呼唤，据说，最近Google又可以用了，这机会可是来自不易，小伙伴们还是抓紧时机享受这一福利吧。
3.关联检索：Web of Science
这个方法比较适合研究机构，因为Web of Science的数据库是要收费的，但其搜索引擎比Pubmed更高级，不但能够限定文章的学科，还能限定作者的国籍单位等等，非常好用。值得一提的是它里面的逻辑连接词比Pubmed多了一个很实用词——Near，这个能在相邻的两个句子中寻找关键词。比方说要搜索高血压和糖尿病的关系，如果使用一般”AND“来连接，可能会出现头一句是说的糖尿病，然后结尾出来个高血压，其实并无联系。但用”Near”的话，由于两个词之间的距离被限定了，因此相关的概率也会高的多。
4.中文检索：万方，知网，维普等。
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生物教学论文参考文献
生物教学论文参考文献有哪些呢?生物教学论文参考文献是毕业论文的重要的组成部分。欢迎阅读我整理的生物教学论文参考文献，希望能够帮到大家。
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拓展内容： 生物基因工程论文的参考文献
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生物基因工程论文参考文献汇总 生物基因工程论文参考文献怎么写?有哪些格式要求，下面我就为大家推荐一些优秀的范例，希望大家喜欢![1] Brackett B G, Baranska W, Sawicki W，et al. Uptake of heterologous genome by mammalianspermatozoa and its transfer to ova through fertilization. Proc Natl Acad Sci USA,1971,68(2):353-357. [2] Jaenisch R, Mintz B. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived frompreimp antation blastocysts injected with viral DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1974,71 (4): 1250-1254. [3] Palmiter R D, Brinster R L, Hammer R E, et al. Dramatic growth of mice that develop from eggsmicroinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes. Nature, 1982,300(5893):611-615. [4] 李宁.动物克隆与基因组编辑.中国农业大学出版社，2012. [5] Hammer R E, Pursel V G, Rexroad C J, et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs bymicroinjection. Nature, 1985,315(6021):680-683 [6] 杜伟，崔海信，王 琰 ，等.精子载体法制备转基因动物的'研究进展.生物技术通报，2012(12):13-18. [7] Maione B，Lavitrano M, Spadafora C, et al. Sperm-mediated gene transfer in mice. Mol ReprodDev, 1998,50(4):406-409. [8] Lavitrano M, Bacci M L, Forni M, et al. Efficient production by sperm-mediated gene transfer ofhuman decay accelerating factor (hDAF) transgenic pigs for xenotransplantation. Proc Matl Acad SciUSA, 2002,99(22):14230-14235. [9] Sperandio S, Lulli V，Bacci M L, et al. Sperm - mediated DNA transfer in bovine and swinespecies. Animal biotechnology, 1996,7(1):59-77. [10] 武坚，刘明军，李文蓉，等.精子载体介导法生产转基因绵羊的研究.草食家畜，2001(S2):186-190. [11] Pfeifer A, Kessler T, Yang M, et al. Transduction of liver cells by lentiviral vectors: analysis inliving animals by fluorescence imaging. Mol Ther，2001,3(3):319-322. [12] Lois C, Hong E J, Pease S, et al. Germline transmission and tissue-specific expression oftransgenes delivered by lentiviral vectors. Science, 2002,295(5556):868-872. [13] Hofmann A, Kessler B, Ewerling S，et al. Efficient transgenesis in farm animals by lentiviralvectors. EMBO Rep, 2003,4( 11): 1054-1060. [14] Hofmann A, Zakhartchenko V, Weppert M, et al. Generation of transgenic cattle by lentiviral genetransfer into oocytes’ Biol Reprod, 2004,71 (2):405-409 [15] Lillico S G, Sherman A, McGrew M J，et al. Oviduct-specific expression of two therapeuticproteins in transgenic hens. Proc Natl Acad Sci USA，2007,104(6): 1771-1776. [16] Lyall J，Irvine R M, Sherman A, et al. Suppression of avian influenza transmission in geneticallymodified chickens. Science，2011,331(6014):223-226. [17] Golding M C, Long C R，Carmell M A, et al. Suppression of prion protein in livestock by RNAinterference. Proc Natl Acad Sci USA, 2006,103(14):5285-5290. [18] 杨春荣，窦忠英.利用干细胞生产转基因动物研究进展.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2006(07):37-40. [19] Hai T, Teng F，Guo R, et al. One-step generation of knockout pigs by zygote injection ofCRISPR/Cas system. Cell Res, 2014,24(3):372-375. [20] Hongbing H, Yonghe M A, Tao W, et al. One-step generation of myostatin gene knockout sheepvia the CRISPR/Cas9 system. Frontiers of Agricultural Science and Engineering, 2014,1(1):2-5. [21] Swanson M E，Martin M J, O'Donnell J K, et al. Production of functional human hemoglobin intransgenic swine. Biotechnology (N Y)，1992,10(5):557-559. [22] Zbikowska H M，Soukhareva N, Behnam R, et al. Uromodulin promoter directs high-levelexpression of biologically active human alpha 1-antitrypsin into mouse urine. Biochem J, 2002,365(Pt1):7-11. [23] Golovan S P，Hayes M A, Phillips J P，et al. Transgenic mice expressing bacterial phytase as amodel for phosphorus pollution control. Nat Biotechnol, 2001,19(5):429-433. [24] Rapp J C, Harvey A J, Speksnijder G L, et al. Biologically active human interferon alpha-2bproduced in the egg white of transgenic hens. Transgenic Res, 2003,12(5):569-575. [25] Wright G, Carver A, Cottom D, et al. High level expression of active human alpha-1 -antitrypsin inthe milk of transgenic sheep. Biotechnology (N Y), 1991,9(9):830-834. [26] Li S, Ip D T, Lin H Q, et al. High-level expression of functional recombinant humanbutyrylcholinesterase in silkworm larvae by Bac-to-Bac system. Chem Biol Interact,2010,187(1-3):101-105. [27] 刘英，张瑞君，伍志伟，等.转基因疾病动物模型的研究进展.动物医学进展，2006(12):44-49. [28] Kragh P M, Nielsen A L, Li J, et al. Hemizygous minipigs produced by random gene insertion andhandmade cloning express the Alzheimer's disease-causing dominant mutation APPsw. Transgenic Res,2009,18(4):545-558. [29] Lee M K, Stirling W, Xu Y, et al. Human alpha-synuclein-harboring familial Parkinson'sdisease-linked Ala-53 Thr mutation causes neurodegenerative disease with alpha-synucleinaggregation in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA, 2002,99(13):8968-8973. ;