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在光合作用的过程中，光照强度对碳3（Rubisco）酶活性的影响非常大。当光照强度突增时，光合速率也会相应增加。然而，Rubisco酶的催化速率却受到了限制，因此，碳3的含量反而减小了。具体来说，当光照强度突增时，叶片中的ATP和NADPH的产量会迅速增加，而CO2的供应速率却没有跟上。这样会导致ATP和NADPH的积累，进而抑制Rubisco酶的活性，从而减小碳3的含量。随着光照强度的增加，CO2供应速率也逐渐增加。当CO2的供应速率达到一定程度时，ATP和NADPH的积累就会被消耗，Rubisco酶的活性也会逐渐恢复，碳3的含量也会增加。最后，当光照强度进一步增加到光饱和点以上时，光合速率不再随光照强度的增加而增加，此时碳3的含量也趋于稳定。因此，在光合作用达到光饱和之前，光照强度的突增会导致碳3的含量先减小后增大，最后趋于稳定。
rubisco在光下活化,暗中钝化。但光对rubisco的活化作用不是直接的，包括了跨类囊体的mg2+流动，co2活化，叶绿体ph改变，以及活化蛋白等多因素之间复杂的相互作用。e（钝化）+aco2↔（钝化）(ec形式)慢反应↔(活化)(ecm形式）快反应一个核gene编码的叶绿体蛋白具有激活rubisco的效应，称为rubisco活化酶。研究表明，活化酶对rubisco的激活可分为两个阶段：（1）光激活rubisco活化酶。（2）活化酶激活rubisco，使rubisco肽链内一特殊的赖aa残基的ε-氨基转变成氨基甲酰化的形式。活化酶表现活性需要照光,实际上就是需要活化酶提供了一种调节光合作用活性的手段，使rubisco活化水平与叶绿体间质中rubp合成的速率以及类囊体膜光能吸收的速率相协调。植物体内在夜间可合成2-羧基阿拉伯糖醇-1-磷酸（ca1p），它是一种6-碳的c3循环中间产物的类似物。ca1p可与活化的rubisco(ecm)紧密结合，因此阻断了rubp的结合，抑制羧化反应。在黑暗中叶片内的ca1p浓度增加，而光下ca1p被代谢，浓度下降，转变成2-羧基阿拉伯糖醇（ca）。因此强光照几分钟就可使rubisco与其抑制剂ca1p分离。另外，rubisco活化酶不分解ca1p本身,但是可使ca1p从ecm中解离的速率提高。xubp和kabp对rubisco的调节xubp(1,5-二磷酸木酮糖)是rubp的差向异构体，kabp(3-酮基阿拉伯糖醇-1,5-二磷酸)是rubp的酮式异构体，这两种物质是rubisco活性的重要抑制剂。rubisco活化酶可将xubp和kabp解离.总体来看，无论是rubp与rubisco的e形式结合，还是ca1p、xubp与rubisco的ecm形式结合，都会抑制酶的活性。因此，磷酸糖是rubisco活性的重要抑制因子。而活化酶能使这些抑制剂与酶解离从而使酶活化
酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类，其最适作用pH值为。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。 目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。 因此，本研究以开发耐温偏酸性蛋白酶为目标，进行了以下几方面的研究： (1)偏酸性蛋白酶产生菌的分离筛选。 (2)偏酸性蛋白酶粗酶酶学性质的研究。 (3)偏酸性蛋白酶固体发酵条件的优化。 (4)偏酸性蛋白酶产生菌P-1007的初步鉴定。 (5)偏酸性蛋白酶在啤酒澄清中的应用。 本论文主要研究结果和结论如下： (1)用常规土壤分离方法，从土壤样品中筛选到一株产偏酸性蛋白酶的菌株，命名为P-1007。 (2)通过单因素发酵条件实验和正交实验的方法得到最佳固体发酵条件为：麦麸15g，黄豆粉8％，葡萄糖3％，NaH2PO41％，％，水35ml，最佳起始，最适发酵温度为40℃。在此条件下所产酶活可达3700u/g，比原始菌株发酵酶活提高了将近2倍，且产酶稳定性较好。 (3)菌株P-1007所产的偏酸性蛋白酶的最适作用pH值为，最适作用温度为50℃。酶的pH稳定性和耐温性较好，50℃、条件下保温8h后剩余酶活可达83％以上，、50℃条件下保温2h后剩余酶活仍在70％以上。Mn2+、Cu2+对偏酸性蛋白酶有明显的激活作用，其它金属离子则对该酶有不同程度的抑制作用。与目前所得到的酸性蛋白酶相比较，偏酸性蛋白酶具有较高的作用pH值和较好的耐温性。 (3)从菌株P-1007菌落形态、显微观察以及区序列分析可以看出菌株P-1007可能属于烟曲霉。 (4)从酶学性质上可以看出，菌株P-1007所产的偏酸性蛋白酶的作用条件满足于啤酒澄清工艺的要求，因此本实验进行了偏酸性蛋白酶在啤酒澄清中的应用研究以及该酶与酿造复合酶和啤酒用中性蛋白酶作用效果的比较。研究结果表明：经偏酸性蛋白酶作用后，麦汁和发酵液中酪氨酸含量、透光率、总氮量、可凝固性氮含量都有了明显的提高。麦汁中a-氨基氮含量也增加了，说明偏酸性蛋白酶将凝固性蛋白质水解成了分子量较小的a-氨基氮，为啤酒酵母的生长繁殖提供了氮源。同时发酵液中的a-氨基氮含量却降低了，分析原因为发酵阶段中酵母利用a-氨基氮的速度比偏酸性蛋白酶降解蛋白质的速度快。麦汁和发酵液的pH值都无太大变化，因此不会影响啤酒酵母的生长和繁殖。在与酿造复合酶和啤酒用中性蛋白酶作用效果的比较中发现，三种酶的作用效果大致相同，但从最适作用条件来看，偏酸性蛋白酶比另两种蛋白酶更适合于啤酒澄清工艺。 以上研究结果表明，本课题筛选到的菌株P-1007所产偏酸性蛋白酶的作用条件特别适合于啤酒澄清工艺，因此在啤酒工业中有较好的应用前景。 关键字:烟曲霉,偏酸性蛋白酶,发酵条件优化,酶学性质,rDNA-ITS区序列分析,啤酒澄清
浅谈酶联免疫吸附试验实验教学思考的分析论文
【摘要】 酶联免疫吸附试验是广泛应用于临床检验诊断的免疫学检验技术，实验教学中采用该技术检测“乙肝两对半”。为适应中职生教育人才培养模式的教学改革，使学生符合具有“理论知识适度、技术应用能力强”的要求，我们对实验教学内容和方法进行改革，从适用性角度选题，通过实验操作考核，采取以考促学的手段，加强酶联免疫吸附试验的训练力度，提高学生实验操作能力，培养学生独立工作的能力。
【关键词】 酶联免疫吸附试验；免疫学检验；实验；考核
酶联免疫吸附试验(enzyme－linkedimmunosorbentassay，ELISA)是广泛应用于临床检验诊断的免疫学检验技术。该技术集基本理论、基本技能为一体，能使学生能对前期所学的理论知识及技能进一步加强和提高，是一个能为学生进人临床实习打好基础的系统实训。目前该技术的临床检测多采用商品化的ELISA试剂盒，实验步骤较少，操作简单。然而，参与反应的成分很多，如抗原抗体浓度、酶结合物浓度以及试剂的质量控制等等，影响因素众多。传统的实验教学中，实验材料的准备、仪器的准备及调试、标本及试剂的处理等工作基本上是由教师包办。实验的许多环节学生没有亲自做，因而在实验完成后，部分学生对实验还是一知半解，更谈不上能力的锻炼和培养［1］。为适应中职生教育人才培养模式的教学改革，使学生符合具有“理论知识适度、技术应用能力强”的要求，对免疫学检验实验教学内容和方法进行改革势在必行。为此我们通过实验技能操作考核，采取以考促学的手段，加强了酶联免疫吸附试验内容的训练力度，也收到了一定的效果，以下谈谈我们的做法及效果。
1精选考核内容，以适应临床实践的需要
考核内容的选择上以围绕临床实际进行选择，真正使学生做到学以致用。不但要让学生了解、掌握先进的免疫学检验技术和操作方法，还必须着重培养学生的创造性思维和综合分析问题的能力，从而全面提高学生素质［2］。ELISA由于操作简单、灵敏度高、可定性定量，在临床检验诊断中应用最为广泛。常用于如病毒性肝炎、艾滋病、疱疹等传染性疾病的检测诊断，还常用于补体、免疫球蛋白和肿瘤标志物的检测。要想在有限的课时里完成诸多的内容训练，显然是不现实的。因此我们仅选择了最具有代表性的“乙肝两对半”检测作为该技术的训练及考核内容。“乙肝两对半”共有五项检测项目，即HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，实验中所需要的实验器材均能由检验实验室提供，易于准备，给学生提供了选择和发挥的空间。实验过程中所需要的待测血清标本为阳性或阴性标准物，不具传染性，保证了学生实验的安全性。学生只要掌握了“乙肝两对半”的检验程序和检验方法，其他在临床上需要用ELISA技术检测的常见项目则触类旁通，能起到事半功倍的效果，至于少见的、较为复杂的检测项目可以在日后的实习及工作中继续学习。
2调整考核内容，可行性及针对性强
酶联免疫吸附试验教学内容在学时安排上有6课时，理论与实验课课时之比为1．1。以往的教学形式为先理论授课，教师讲解实验的原理及检验程序，实验教学中教师讲解后进行示范教学，学生照葫芦画瓢的再做实验;实验操作考核只设HBsAg项目的考核，考核项目单一、形式单一。学生只需完成实验操作，报告结果即可。而现行的考核内容是“乙肝两对半”的共五项检测项目，各个项目的检验过程如标本的稀释、试剂选择、加样顺序有所不一。从限制考核时间的角度考虑，学生在考核时随机抽考其中的一个项目，由考生自主选择所需物品进行实验操作，这样增加了考试的随机性和灵活性。虽然抽考使得考核难度增加，但能强化学生对ELISA检测乙肝两对半操作步骤的理解。当学生抽到题目后，在熟悉操作步骤的基础上，只要懂得该项目检测时需注意的细节，如检测HBcAb需将血清稀释50倍，HBeAb的检测需加入中和试剂，学生在对离心机、水浴箱及微量移液器的使用相当熟悉的基础上，不难将标本中的结果如实地检测出来。
3考核的形式
学生重理论、轻实验的现象普遍存在，有的学生每操作一步就看一下笔记，或者是询问其他同学，有的学生甚至希望教师能一步步的教，因而学生对酶联免疫吸附试验缺乏系统的认知。我们将考核的形式设计有理论测试(占30分)和操作考核(占70分)。通过调整考核内容，将能力培养贯穿于整个训练过程，将单纯理论教学融合于实验教学中，能把理论知识激活，也强化了学生的实验操作能力及解决问题、分析问题能力。理论测试采用本教研室的计算机交互平台进行，根据教学内容特点，理论测试我们进行这样的设计，首先收集乙肝两对半检测相关试题，建立题库，内容涉及实验原理、操作、材料、结果观察及临床意义。如(1)乙肝两对半检测涉及ELISA的哪些原理?分别检测什么项目?(2)通过各反应孔显色，判断疫苗接种者、病毒携带者、“大三阳”、“小三阳”;(3)手工洗涤有何要求;(4)加终止液的目的是什么;(5)ELISA常用的酶是哪种?其底物是什么。共组10套试题，学生抽签后通过计算机交互平台指向性地发布试题、进行考试。考虑到学生对理论考试容易产生畏难情绪，在题型的设计上，设有填充题，标示题、连线题及填空题等，内容直观、清晰，学生“寓考于乐”，在轻松愉快的心理环境下地完成理论测试。
4考试评分严谨，设计合理
理论考核从试题集中抽取出6道题组卷，每题5分，共30分。操作考核的评分项目包括:专业素质(衣着仪表、考试态度、纪律)5分;实验准备(实验用品、试剂的预处理、标本处理、标记记录)5分;实验步骤(加样、微量移液器的使用、孵育、洗涤、显色)35分，结果观察10分;操作后清场(试剂、器材归位、实验台面清理)5分，综合评价(规定时间完成、实验后清场、消毒等)10分，共70分。评分标准于考试前告知学生，给学生能充分地复习和准备，注意操作细节，提高考试质量。考试时每个学生独立完成试验，教师全程监考，及时对出错环节扣分，评出总分。
5效果分析
在酶联免疫吸附试验的实验教学中，采用考核方式，取得了以下成效。
5．1利于调动学生的主观能动性，激发起学习的热情
实验操作考核综合反映出学生的实验预习、实验过程和实验态度等各方面的表现。考核成绩占期末总成绩的30%，将学生实验考核计入课程总成绩后，学生上实验课的目的性增强，课上都抢着做实验，从以往实验缺乏主动性，不预习，不复习，变为积极思考，认真准备。实验报告抄袭现象也明显减少，改变了重理论轻实践的现象［3］。从学生提出的'问题，如溶血标本可以检测“乙肝两对半”吗?如果用溶血标本检测，会有什么影响，会影响什么试剂?从这些问题的提出可以看出，学生懂得对实验进行思考，也懂得遇到问题主动和老师商量，学生不断发现问题、思考问题、解决问题的能力得到提高。
5．2独立工作能力的培养
独立工作能力是一个医学检验工作者最基本素质，中职生毕业后就业单位多是基层医院，基层医院的检验科可能只有1至2名检验员，每天的检验工作任务都要独立完成。因而学生在就学期间即应注重独立工作能力培养。在实验考核过程中，实验物品的选择、摆放，实验结束后操作台的清理等，是学生自己准备和独立完成。学生在考核时需考虑到考核时间的限制，因此只有熟悉基本的理论知识、熟练基本操作，才能在规定时间内完成实验，得出正确的结果，考试前不做好准备实验将无法顺利完成。
5．3实验基本技能的训练
由于酶联免疫吸附试验涉及环节多，通过考试能综合考核学生的基本实验技术，如移液管的准确吸样，血清等倍稀释的方法;能考察学生对常用仪器设备如离心机、恒温孵育箱、酶标仪、洗板机的操作;在对血清标本进行检测时，使用过的物品如棉签、试管、注射器的正确处置，能增强学生的无菌操作技术和观念。
5．4学生的评价及反馈
此考核方案在两届学生进行了实施，通过操作考核，学生们得到较为系统的训练，对ELISA检测乙肝两对半的整个流程有了较为深刻的认识。有必要开展，通过考核能更好地将理论与实践相结合，学生能自如地、成功地检测出标准物血清标本的正确结果，同时也很有成就感，增强了对实习及将来的工作的信心。在对2013级的学生进行实习情况跟踪、访谈中得知，学生普遍认为，ELISA技术在临床免疫检验诊断中应用广泛，用此技术检测的项目多，工作量较大。由于在操作考核强化了技能，在实习老师的指导下，能很快地进入角色，增强了工作自信心。对学生进行实验考核的同时，也对教师提出了更高要求。教师准备的理论测试问题在内容上需与临床免疫检验接轨，使考核更科学合理化。规范实验教学，严谨、规范示作好示教。学生操作过程中，巡视督查，及时纠正学生的错误。以考促学法强化酶联免疫吸附试验的实验教学，补充和完善了免疫学检验实验教学的内容和方法，也希望能以此提高学生对其他课程学习的主动性及激发起学习的热情。
淀粉酶活性的测定结果与分析实验：
一、研究背景及目的：
酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。
酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到。
本实验选取萌发的禾谷类种子为材料，通过对其所含两种淀粉酶活力的测定来研究酶活力测定的方法。
二、实验原理
萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是 a 淀粉酶和 B 淀粉酶，B淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而 a 淀粉不耐酸，在 下则发生钝化。本实验的设计利用 B 淀粉酶不耐热的特性,在高温下(70C°)下处理使得 B 淀粉酶钝化而测定 a 淀粉酶的酶活性。
酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的，麦芽糖的浓度利用比色法可以很容易测得。然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性，拟将总活性与 淀粉酶的活性的差值看作B 淀粉酶的活性，再做进一步分析。
实验中为了消除非酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。
淀粉酶是可以水解淀粉的一类酶的总称，从对淀粉水解方式的不同，淀粉酶可以分为内切型、外切型、脱枝和转移4个种类。在淀粉酶家族中，a-淀粉酶具有来源丰富和催化特性多样等特征，在淀粉质的加工处理工业过程中具有极为重要的应用。
a-淀粉酶的来源极为丰富，包括动物、植物和微生物。其中，微生物来源的a-淀粉酶可满足多种工业应用需求，在现在工业中发挥着极为重要的作用。在现代工业的淀粉质处理过程中，微生物a-淀粉酶的水解方法已经彻底取代了传统的化学水解方法。
真菌来源的a-淀粉酶有很多种，目前工业上应用的真菌a-淀粉酶几乎全部来源于丝状真菌中的曲霉属微生物，如米曲霉（Aspergillus oryzae）等，多数真菌a-淀粉酶的作用温度和pH比较温和，如最适作用pH在～之间，最适作用温度为50～55℃之间，当温度超过60℃酶开始失活，最近也有关于木霉产生a-淀粉酶的报道。
日本的Noguchi A等（2008）最先报道了从1株 JCM22452中克隆到a-淀粉酶同系物TRa2的cDNA序列，其氨基酸序列与其他子囊菌a-淀粉酶序列高度同源，也可产生儿茶酸和儿茶素糖苷（EGCG）。该木霉菌株产生的TRa2可以使儿茶素等自然黄酮类物质糖化，可以将麦芽低聚糖水解为麦芽三糖、麦芽四糖等。
Mohamed等（2011）研究了以金柑皮为培养基，发酵生产a-淀粉酶A3的纯化方法及酶学性质，通过凝胶过滤和SDS-PAGE电泳分析发现纯化获得的酶的大小为70kDa，在pH 和40℃条件下，对马铃薯可溶性淀粉的酶活最大，在40℃温浴30min可保持稳定酶活，但在50℃和60℃只能保持70%和50%的酶活，Ca2+可显著提高酶活性，而其他金属离子和金属螯合剂、EDTA、柠檬酸钠、草酸钠等均对酶活有抑制作用。
Khan等（2012）研究发现，可以产生大量的a-淀粉酶，以3%麸皮加1%葡萄糖作为碳源的培养基中，30℃培养12 d，a-淀粉酶产量达到最佳，为6U/mL；若换做1%的淀粉作为碳源，在同样的培养条件下，显示该木霉菌株产生的a-淀粉酶量很低，最大产生量发生在第4 d，产量仅为。
丹尼斯科美国公司分别在美国和中国申请了发明专利“里氏木霉a-淀粉酶增强玉米淀粉的糖化”（中国专利号：；美国专利号：20120129226），显示来自的生麦芽糖a-淀粉酶（TrAA）在麦芽糖生产工艺中，可单独使用或与支链淀粉酶组合，TrAA在低pH和高温条件下可催化麦芽糖的产生；在从液化淀粉产生高葡萄糖糖浆的过程中，TrAA可有力地抑制葡萄糖逆转成麦芽低聚糖，从而使得加工的玉米淀粉混合物中的葡萄浓度达到约96%（w/v）。
1773年，意大利科学家斯帕兰扎尼（—1799）设计了一个巧妙的实验：将肉块放入小巧的金属笼中，然后让鹰吞下去。过一段时间他将小笼取出，发现肉块消失了。于是，他推断胃液中一定含有消化肉块的物质。但是什么，他不清楚。 1836年，德国科学家施旺（—1882）从胃液中提取出了消化蛋白质的物质。解开胃的消化之谜。 1926年，美国科学家萨姆钠（—1955）从刀豆种子中提取出脲酶的结晶，并通过化学实验证实脲酶是一种蛋白质。 20世纪30年代，科学家们相继提取出多种酶的蛋白质结晶，并指出酶是一类具有生物催化作用的蛋白质。 20世纪80年代，美国科学家切赫（—）和奥特曼（—）发现少数RNA也具有生物催化作用。酶有催化作用，有3个特性，1、高效性，2、专一性，3、多样性，4、温和性。
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正常腰椎间盘是由纤维环、髓核及软骨板构成。人体椎间盘髓核是一个高度含水的组织，水分占80%～90%；干性成分中，蛋白多糖占65%，胶原约占25%，胶原纤维无定向排列成一疏松的立体网络。纤维环中水分占60%～70%；干性成分中，蛋白多糖占20%，胶原占60%。椎间盘内主要含有Ⅰ型和Ⅱ型胶原分子，从纤维环的外层到内层，胶原构成由Ⅰ型逐渐变为Ⅱ型。Ⅰ型胶原提供纤维环的张力强度，Ⅱ型胶原提供承受压力强度。当腰椎间盘突出时，髓核中的水分含量下降，胶原含量可达60%或更高。Bromley等〔5〕用狗进行的实验认为：胶原酶注入盘内剂量达400u～500u时，有纤维环内缘的轻微溶解，超过这个剂量溶解作用将增加，但也只是纤维环内缘的溶解，注入胶原酶2w之后溶解程度不再增加。孙磊等〔6〕将胶原酶注入兔椎间盘内后观察到：胶原酶注入盘内24h，可见髓核结构破坏；1w后髓核浓缩，纤维组织增生；2w时椎间盘髓核结构界线不清；4w时椎间隙狭窄，髓核结构消失。被纤维软骨替代，但纤维环的外层胶原纤维结构无变化。Sussman(1968)〔4〕首先提出并证明胶原酶可以溶解术中切取的人体椎间盘组织，证明胶原酶能迅速地、选择性地溶解髓核和纤维环中的胶原纤维。Sussman(1975)〔7〕进行的毒性试验表明：胶原酶行盘内、静脉内、腹腔内、脊柱旁及硬膜外注射有相当大的安全范围，胶原酶对透明软骨、骨及成熟的纤维组织如前、后纵韧带作用极小，对硬脊膜、马尾神经等接触也不会造成损害，腰神经根等神经实质对胶原酶不敏感，但认为胶原酶鞘内注射可引起严重的并发症。3 胶原酶用于腰椎间盘突出症治疗中的若干问题 胶原酶治疗机理 胶原蛋白水解酶(collagenase，简称胶原酶)，其化学本质是蛋白质，是一种有催化作用的高度特异性生物催化剂，是唯一能作用于胶原组织螺旋结构的酶，能在生理pH值及温度条件下水解天然胶原纤维。人体内源性胶原酶与胶原分子在细胞内共同合成，以酶原的方式处于潜伏状态〔8〕。当椎间盘内环境改变或受到机械作用时，椎间盘纤维细胞崩解，酶激活物进入基质激活处于酶原状态的胶原酶，使其具有生物活性，胶原纤维出现降解。降解的结果引起椎间盘本身出现自溶，使纤维环强度下降，出现裂隙或破裂，并引起相应的临床症状。当外源性胶原酶以酶原的形式大量注入病变的椎间盘，便被其中的酶激活物激活。胶原酶被激活后作用于胶原分子的全部3条α-链，距氨基酸端的3/4处，将胶原分子水解为3/4和1/4两个片段，使之溶解度增加，易解链变性被其他 蛋白酶水解〔9〕，最终降解为相关的氨基酸，被血浆中和吸收。由于椎间盘的总体积明显缩小，从而使突出物减小或消失，对神经组织的压迫得以缓解或消除，临床症状得以改善或消失。 胶原酶治疗对象选择 对胶原酶治疗对象的选择至今仍缺乏统一认识，国内外至今尚无统一标准，如何选择病例，提高治疗效果，是有待进一步探索和研究的课题。有作者〔10〕提出对椎间盘向侧后方突出大于10mm，椎间盘突出伴钙化、伴侧隐窝狭窄等均可列为适应症。目前国内多数学者比较一致认定的是：单侧腰腿痛有明显神经根压迫症状；经系统保守治疗无效者。凡伴有过敏体质、马尾综合征、代谢性疾病、椎间盘炎或椎间盘感染、心理变态、腰椎管狭窄或脊椎滑脱、非椎间盘源性腿腰痛、孕妇及14岁以下儿童、突出物游离于腰椎管内及突出物已钙化或骨化者均不宜列为治疗选择。适应症的选择恰当与否，直接关系治疗效果，故此笔者认为对治疗对象应慎重选择，不宜过宽。 胶原酶治疗方法 目前临床上主要有以下5种方法：(1)经皮斜刺或侧方直刺椎间盘(盘内)注射法。此法是经典注射法，适用于各种类型的椎间盘突出，尤其适用于椎间盘膨出、中央型突出或偏斜不重者。其穿刺途径安全，定位客观，精确可靠，效果确实，但操作要求准确。笔者主要采用此法，我们认为此法具有针对性强，直接溶解胶原纤维的作用。(2)经皮椎间孔硬膜外侧隐窝突出物局部(盘外)注射法。此法适于突出物偏向一侧，而且突向神经根管，临床有神经根刺激症状者。此法针对突出物，准确性要求高，术中需造影确定，效果可靠。(3)经椎板外切迹或小关节内缘行硬膜外侧隐窝穿刺法。此法系盘外注射的改进法，由宋文阁等〔11〕提出并应用于临床。此法进路骨性标志清楚，定点明确，进针角度和方向固定，可变范围小，但其应用时间较短，目前临床报道较少。(4)经皮棘突旁硬膜外注射法。它是经椎板间隙利用硬膜外套管注射法。适用于多间隙突出或老年体弱有明显骨质增生并有骨桥形成者。在操作时需在最高位间隙穿刺插管，并将硬膜外导管送到最低突出间隙，边退管边向突出区域注药。此法简单、安全，但效果不如其他方法 。(5)经皮切吸与胶原酶注射联合法。此法是先将椎间盘髓核组织吸出，使椎间盘内压力降低并有一定空隙，再注入胶原酶，使药液均匀地渗透到纤维环部，髓核及纤维环得到充分溶解。但其操作复杂，外套管针较粗，创伤相对较大。目前国外均采用盘内法注射，国内盘内、盘外均有使用。 胶原酶临床疗效及与手术疗效对比 目前国内报道胶原酶治疗优良率在60%～84%，有效率在83%～96%。笔者治疗25例，优良率为74%，有效率为92%，基本上报道一致。经过比较，盘内法与盘外法治疗疗效并无明显差异。Weinstein(1986)〔12〕将胶原酶注射与手术组进行了详细比较，其结果为：化学溶核组治疗后近期疼痛缓解者为51%，手术组为41%；3个月后疼痛缓解者化学溶核组为75%，手术组为70%；1年后化学溶核组为86%，手术组为80%；2年以上无需其他治疗者分别为86%与88%。治疗后第一年度复发率化学溶核组12%，手术组18%；10年后化学溶核组为32%，手术组为39%，需再次手术。治疗后短期感觉良好，恢复工作者化学溶核组为90%，手术组87%。根据比较，化学溶核组的有效率高于手术组，而复发率却低于手术组。化学溶核术显得更为优越。 胶原酶治疗的副反应与并发症 副反应 ①疼痛反应。一般在治疗后3～10天疼痛可比治疗前加重，但笔者体会往往多在注药后1～2h后即开始出现疼痛加重。其原因是胶原酶的注入增加了盘内容积，同时胶原纤维在胶原酶作用下出现降解。导致椎间盘内容物增加，使盘内压升高及降解过程中的化学刺激反应，窦椎神经受到激惹后出现的〔13〕。 ②尿潴留和肠麻痹。是由于盘内压力增高后窦椎神经受到激惹引起植物神经功能紊乱所致〔13〕。 ③脊柱失稳性腰背痛。椎间盘溶解后椎间隙变窄，小关节将出现重叠，对窦返神经的刺激，出现反射性腰背部不适和疼痛。 并发症 ①过敏反应。胶原酶作为一种生物制剂，存在过敏反应的可能。杨述华等〔14〕报道1例二次注射发生过敏反应；谢国华等〔15〕报道1例于注射后8h出现过敏性休克。 ②椎间隙感染。主要表现为腰肌痉挛，腰痛加剧，有深压痛，白细胞计数和分类可正常或升高，血沉增快。高翔等〔16〕报道1例椎间隙感染。 ③神经损伤。多为穿刺针刺伤脊神经根或穿刺过程中误伤脊膜或神经外膜，高浓度胶原酶使神经根发生脱水、变性，一旦误入蛛网膜下腔，轻者出现化学性脑膜炎，重者可发生截瘫。高翔等〔16〕报道2例神经损伤致腓骨长、短肌瘫疾，经治疗后一个月恢复。汤华丰等〔17〕报道全麻下2例产生腰神经根症状，半年后随访尚未完全恢复。鞠作金等〔18〕报道1例出现化学性脑膜炎及严重的神经根损伤，术后1年随访肌力仍未完全恢复。 ④继发性腰椎管狭窄。 尚未解决的问题 胶原酶用量问题 目前报道盘外注射胶原酶用量基本一致，都为1200u；但盘内注射用量尚未完全统一，各家报道有400u、600u、1200u三种规格。另外，椎间盘病变程度与所用胶原酶剂量问题尚未达成统一标准。 有关造影剂使用问题 目前盘外注射一致使用造影剂进行定位，而盘内注射定位时是否非要使用造影剂问题并未达成一致，各家观点不一。临床上有单纯靠腰椎正、侧位定位的，也有在此基础上注射造影剂行椎间盘造影定位。另外，造影剂是否对胶原酶的溶解作用产生影响这一问题仍未见有系统研究报道。 副作用和并发症问题 如何有效地预防和治疗胶原酶注射产生的副反应及并发症，目前尚未达成一致的方案。另外，对所有治疗的病例进行系统、完整的CT及X线复查结果方面，仍未见有完整、准确的临床报道。 综上所述，只要严格掌握适应症以及正确熟练的操作方法，胶原酶注射溶解术不失为一种有效的治疗方法。且疗效与手术治疗无明显差异。它住院时间短、操作较简单、并发症少、痛苦小、病人负担较轻且安全有效，即使失败也不影响再次手术，为腰椎间盘突出症增加了一种可供选择的治疗方法。相信随着胶原酶基础研究的不断深入及临床应用的进一步开展，胶原酶注射法必将成为继传统保守治疗之后首选的治疗方法，值得临床推广应用。参考文献1 Mixter WJ,Barr of the intervertebral disc with involvement of the spinal Eng J Med,1934,211:2102 Hirsh on the pathology of low back Bone Joint Surg,1959,41B:2373 Smith dissolution of the nucleus pulposus in (2):1374 Sussman clisolysis with Natal Med Assoc 60(may),1968:1845 Bromely JW,Varma AJ,et evaluation of collagenase injection for herniated lumbar 孙 磊，宁志杰，王培杰，等.胶原酶椎间盘内注射后的形态观察.中国矫形外科杂志，1997，4(5)：3947 Sussman NeuroSurg,1975,42:389～3958 张昌疑.主编.生物化学.第2版.人民卫生出版社，1984：85～1169 Smith of York:Mc Graw-Hill,1983:22310 王执民，王义清，吴智群，等.注射胶原酶治疗腰椎间盘突出症的临床应用研究.实用放射学杂志，1997，13(8)：458～46011 宋文阁，傅志俭，马 玲，等.硬膜外腔侧隐窝穿刺的研究.中华麻科学杂志，1998，18(4)：25012 Weinstein JN,Lehman TR,Hejna versus open discectomy-a ten year follow-up Orthop,1986,206:5013 刘 伟，杨 华，雷云坤，等.注射用胶原酶治疗腰椎间盘脱出症疗效及影像学分析.云南医药，1999，20(1)：29～3014 杨述华，杜靖远，罗怀灿，等.化学溶核术治疗椎间盘突出症的临床研究.中华骨科杂志，1996，16(7)：415～41715 谢国华，蒋慧娟.胶原酶盘内注射治疗腰椎间盘突出症.江苏中医，1999，20(2)：3216 高 翔，李加坤.胶原酶注射治疗腰椎间盘突出症.中国厂矿医学，1999，1：7～817 汤华丰.丁鑫昌.髓核化学溶解(胶原酶)治疗腰椎间盘突出症30例近期随访报道.中华骨科杂志，1989，9(2)：88～9018 鞠作金，吴旭东，赵勇进.胶原酶溶解术治疗腰椎间盘突出症严重并发症1例.骨与关节损伤杂志.1997，12(6)：325
从碱性土壤中分离得到一株高产碱性果胶酶的菌株S-2,对该菌株进行形态特征和生理生化鉴定,确定其为革兰氏阳性,杆菌,有芽孢;并用16SrDNA方法分析,该菌株与吉氏芽孢杆菌DSM 8722（Bacillus gibsonii DSM 8722）的序列相似性为99%,因而鉴定其为吉氏芽孢杆菌（Bacillus gibsonii）。 对吉氏芽孢杆菌（Bacillus gibsonii）S-2菌株产碱性果胶酶的固态发酵条件优化表明:甜菜渣是最适碳源和酶的诱导物,酵母膏为最适氮源;最佳固体培养基的组成为:甜菜渣5g,酵母膏 30mg,MgSO4·7H2O 27mg,水15mL;对吉氏芽孢杆菌（Bacillus gibsonii）S-2的培养条件进行优化的结果为:种龄为24h,接种量2ml,培养温度35℃,发酵周期48h。在此条件下产酶率为3700u/g。 对发酵后酶的提取工艺研究表明:用30倍体积的的Na2
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问题一：科研项目推荐意见怎写？ keenteeth(站内联系TA)150字？我给你写一个：“×××是目前国内外有机合成领域中的研究热点之一。本课题选题先进，有重要的研究意义。课题研究方案合理可行，有较好的创新性。课题组研究基础雄厚，预计可以取得预计研究成果。项目申请人承担过多项国家自然科学基金、863等项目，有较强的研究能力。课题申请书中的情况属实。同意申报。”不过不同的项目意见要求不一样。有的强调项目本身，有的强调对申请人科研作风和能力，有的强调项目书真实性评价。不过大致都是这些东西。robotor(站内联系TA)经审核，“...”项目具有深刻的理论意义和实际意义。其所设计的研究内容适度并有新意。特色和拟创新之处明显。项目申请书所填内容属实，课题内容设计比较科学、可行。课题组负责人科研能力突出，完全具备申报资格。课题组其他参与人员相关的科研成果比较集中，具备完成课题研究的条件和能力。同意申报。wolf3769(站内联系TA)哈哈哈，长见识!!!!:P 问题二：课题申报所在单位审核意见怎么写 编号： 安徽省高等学校思想政治教育研究会研究课题申请书 申 请 人： 所在学校： 申请日期： 安徽省教育厅社政处制2008年6月填 表 说 明1．申请书一律用A4纸双面打印。2．封面和表5右上角的编号由研究会统一编写。3．封面院系名称请写全称。4．表二课题组成员必须由本人亲自签名。5．表三的“研究类别”为基础研究、应用研究、综合研究，请申请人选择填写。“成果形式”一般为研究报告、论文、系列论文、专著。如同时有多种成果形式，应用“和”或顿号隔开，如写成“××和××”、“××、××”；不得写成“××或××”，否则视为成果形式不明确。如有校外合作单位，请在表三“合作单位意见”栏填写。6．表五―表八页不得出现申请人和课题组成员的任何背景资料，否则作废。表五―表九单独装订。 7．表八的报送部门如涉及本校科研管理部门、地方 *** 部门等，不要出现校名、地名，可写为“学校科研管理部门”、“所在市××部门”。8．表九由省教育厅聘请的专家在评审项目时填写。表一：申请人姓名性别出生年月职务所在教研室职称最后学历最后学位申请人承担省级以上（包括省教育厅）社科研究项目完成情况项目来源项目批号项目名称批准时间完成情况申请人近2年来主要研究成果（注明发表成果的刊物名称、年、期） 申请人签名： 年 月 日院系意见（申请人所在院系学科学位点情况，是否中青年骨干教师或学科带头人、上表填写情况是否属实、是否同意申报）院系（部门）负责人签章年 月 日表二：课题组其他成员情况姓名职称年龄专业外语语种及程度分工情况签名课题组其他成员近2年来主要研究成果（注明发表成果的刊物名称、年、期）： 学校科研部门审核盖章 年 月 日表三：课题名称：研究方向研究类别起止时间成果形式申请经费 万元其他经费来源学校配套： 万元或配套比例：企事业单位资助： 万元经费概算（万元）类别/年度年 年 年合计图书资料费调研费文具费上机费文印费小型会议费小型仪器设备费其他合计购置仪器设备仪器设备名称数量金额年度合作单位意见（是否同意参加合作研究，并在时间、工作条件等方面给予支持）： 合作单位盖章 年 月 日表四：学校科研管理部门审查意见（有无在研项目、形式审查是否合乎要求等）： 学校科研管理部门盖章 年 月 日学校思政研究会评审意见： ......>> 问题三：课题单位推荐意见怎么写 在baidu搜一下 问题四：由于课题主持人专业技术资格没有达到高级，需要专家推荐，推荐意见怎么写啊？ 写之前做过什么，将他的专业方面的经验作为重点 问题五：科研项目推荐意见怎写？ 我给你写一个：“×××是目前国内外有机合成领域中的研究热点之一。本课题选题先进，有重要的研究意义。课题研究方案合理可行，有较好的创新性。课题组研究基础雄厚，预计可以取得预计研究成果。项目申请人承担过多项国家自然科学基金、863等项目，有较强的研究能力。课题申请书中的情况属实。同意申报。”不过不同的项目意见要求不一样。有的强调项目本身，有的强调对申请人科研作风和能力，有的强调项目书真实性评价。不过大致都是这些东西。xi2004(站内联系TA)基本上没人看吧？robotor(站内联系TA)经审核，“...”项目具有深刻的理论意义和实际意义。其所设计的研究内容适度并有新意。特色和拟创新之处明显。项目申请书所填内容属实，课题内容设计比较科学、可行。课题组负责人科研能力突出，完全具备申报资格。课题组其他参与人员相关的科研成果比较集中，具备完成课题研究的条件和能力。 问题六：生物学研究生毕业指导教师推荐意见 研究生导师推荐意见一： 闵伟红，吉林省大安市人， *** 党员。2015年9月考入中国农业大学食品科学与营养工程学院攻读博士学位。 该生在攻读博士期间，认真学习 *** 和十八大精神，积极参加党组织和学校以及实验室的各项活动。待人诚恳热情，实验认真，刻苦，努力。完成了申请博士学位所要求的全部课程，学习成绩优良，已修学分17，平均成绩81分。在国内，等相关专业期刊上发表论文5篇。 闵伟红所承担的课题属于国际合作项目。她以我国占积压稻谷中80%的早籼稻为原料，以传统自然发酵生产米粉为基础，首次进行了纯种乳酸菌发酵生产米粉的探索，并对乳酸菌改善米粉食用品质的机理，以及乳酸菌对淀粉改性和凝胶形成机理进行了研究。对乳酸菌发酵米粉的工艺进行了探讨，建立了评价淀粉凝胶类食品如粉皮、粉丝、米粉等食品筋道感的评价模型和方法。从而奠定利用早籼米生产高品质米粉的理论基础。 该论文在研究乳酸菌发酵产物对米粉品质改善的结果和建立淀粉凝胶类食品筋道感模型上具有创新性。对乳酸菌发酵米粉的工艺研究具有适用性。 论文作者能较全面地查阅国内外的文献，掌握该研究领域的动态，论文结果反映出作者具有较坚实的相关理论基础和熟练掌握先进的微生物学、物理化学和食品工程方面的实验技能，并且具有独立从事上述科研工作的能力。 我认为该博士论文已达到申请博士学位的要求，特同意其进行博士论文答辩，并推荐其申请博士学位。 研究生导师推荐意见二： 丁长河是2015级博士研究生，该同学1990于北京农业工程大学食品工程专业本科毕业，1998年无锡轻工大学食品科学与工程专业硕士毕业，该同学还曾经在全国第六大啤酒集团河南金星啤酒厂担任技术部负责人三年。 丁长河同学在校学习期间，拥护党的路线、方针和政策，积极参加学校和学院组织的各项活动。在日常研究工作和学习中能严格要求自己，坚持真理、勇于探索、诚恳热情、乐于助人、团结同学。 丁长河同学注重基础理论知识的学习和实验技能的提高，大量阅读了研究相关的书籍资料，知识面较宽。在学期间刻苦努力，成绩优良，取得总学分17学分，平均成绩85分。研究工作期间已被国内核心期刊录用学术论文2篇。另有1篇论文已被国外SCI索引源杂志接收，正在修改中。所从事研究的研究课题为国家十五科技攻关项目功能性低聚糖的子项目，项目编号为2015BA7080406。该项目前期研究在2015年6月被教育部鉴定为科技成果，在2015年9月该成果获山东省科技进步二等奖，丁长河同学是该课题主要完成者之一。 丁长河同学所完成的毕业论文链霉菌高产木聚糖酶以及酶学性质的研究，在查阅大量国内外文献的基础上，在国内首先筛选和鉴定了一株高产木聚糖酶的卷须链霉菌菌株，并研究了诱变和优化产酶条件对卷须链霉菌产酶的影响，液体发酵酶活国内最高。论文对卷须链霉菌木聚糖酶进行了纯化，得到电泳纯的低分子量木聚糖酶，进一步对纯酶的酶学性质进行了研究，这些研究为该酶的应用打下了基础。另外，论文还对橄榄绿链霉菌的产酶条件进行了优化和中试实验，链霉菌木聚糖酶酶活国内外最高。 该研究论文与国民经济发展紧密结合，实验方案设计合理、数据准确，结论可靠， 研究结果具有重要的理论意义和实用价值，为木聚糖酶高产和工业化应用奠定了基础。 该论文主要涉及微生物学、生物物理学、生物化学、发酵工程等......>> 问题七：有什么好的课题研究题目推荐 五年高考三年模拟 问题八："扶贫之星"推荐单位意见怎么写 经常有人要单位推荐意见的模板，实际上按要求填写就可以，没有标准可言。下面给大家发一个申请成功的一个版本吧，请根据各自实际情况修改完善。祝大家成功！ 单位推荐意见： ***博士为我校******学院教师，***年晋升为教授，是我校重点培养的学术骨干。始终积极地投入到教学和科研工作当中，科学态度端正，学术作风严谨，创新意识强。近五年来，负责承担和作为技术骨干参加了近***项课题的研究工作，获得多项科技奖励和国家专利，并获*****等奖励和荣誉称号。在******技术研究等领域具有较高的学术声望。他身心健康，乐于奉献，具备独立科研的能力和良好的素质，有很好的发展潜力。他外语水平好，提出的出国研修计划必要、可行。回国后，本单位将对其加大培养力度，对其所在学科和实验室给予政策上的倾斜和资金支持，促进其所在重点学科的快速发展。 特此推荐。 问题九：新颖的课题，及开题报告 200分 您好，可以安排国家级“十三五”规划课题挂名，真实有效，网上可以查，3～5个月完成，希望我的回答对您有帮助，望采纳！！！
药学毕业论文开题报告篇3 题 目 名 称： 番泻叶对小鼠尿量的影响 研究现状： 一、普鲁兰酶 普鲁兰酶(Pullulanase，. 2. 1. 41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的脱支酶。普鲁兰酶还可以分解普鲁兰多糖，普鲁兰酶来源于微生物，R-酶则来源于植物。普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气气杆菌Aerobacter. aerogenes}(典型菌为肺炎克雷伯氏杆)发酵获得，他们报道了该酶良好的酶学性能。之后，各国的科研人员经过广泛深入研究，从不同的地区、微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。 在淀粉加工工业中，α淀粉酶最为常用，它的功能是水解淀粉的α-1,4糖苷键，单独用它时，产物中含有大量分支结构的糊精，其中就含有大量的α-1,6糖苷键。假如不把淀粉的α-1,6糖苷键彻底分解的话，势必会造成很大的浪费。自然界中，存在有能分解淀粉的α-1,6糖苷键的酶，通称为解支酶。如寡α-1,6葡萄糖苷酶( , Oligo-l,6-glucosidase )，普鲁兰酶( )，异淀粉酶( , Isoamylose )，支链淀粉一6-葡聚糖酶( )，其中普鲁兰酶要求的底物分子结构最小，故而可以将最小单位的支链分解，导致可以最大限度的利用淀粉，所以在淀粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。故而许多国家都争相开发，但是到现在为止，只有丹麦的NOVO公司具有普鲁兰酶的生产能力。我国只有向其进口，但是其价格昂贵，限制了普鲁兰酶在我国的应用。其实，我国早在七十年代就开发普鲁兰酶的产生菌，但是该菌的酶学性质不适合生产，至今我国在普鲁兰酶的国产化方面还没有报道。 在淀粉的加工行业上，对普鲁兰酶的酶学性质的要求是耐酸耐热，其原因是因为通常使用外加酶化法，由于所用酶类的限制，普鲁兰酶的添加可以在两步反应的任何一步，但必须满足上述的反应的条件。因此所开发的普鲁兰酶的酶学性质必须满足现有的酶法水解制糖的条件，也就是耐酸耐热。 二、普鲁兰酶的研究现状 1.产普鲁兰酶的微生物 普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气杆菌(Aerobacter aerogenes)发酵获得。他们报道了该酶的良好性能之后，各国的科研人员经过广泛深入的研究，从不同的地区的微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。但是迄今为止，尽管发现许多微生物能够产普鲁兰酶，但是由于当今工业生产条件(酸性，温度)，大多数微生物所产的普鲁兰酶并无商业价值。以下便介绍一下普鲁兰酶的生产菌种。 蜡状芽抱杆菌覃状变种(Bacillus cereus ) 由日本的ToshiyukiTakasaki于1975年发现。该菌同时产生两种淀粉酶:β-淀粉酶和普鲁兰酶。最佳作用条件为pH6～，温度50℃，最大转化率(淀粉水解产生麦芽糖)大约为95%.酶学研究中发现，此酶在pH5，温度60℃依然保持大部分活性，该菌的营养细胞呈棒杆状，聚集成长短不等紊乱链状，无运动性，格兰氏阳性，产芽抱时细胞无明显膨胀。该菌最适生长温度30℃～37℃ ,最高生长温度在41℃～45℃，可以利用葡萄糖，甘露糖，麦芽糖，海藻糖，淀粉和糖原。 嗜酸性分解普鲁兰多糖芽抱杆菌() 上世纪八十年代初，丹麦Novo公司获得此菌，此菌所生产的普鲁兰酶耐热 (60℃)，耐酸()。该公司经过投入巨资开发研究，1983年Nov。公司在日本和欧洲市场同时商业化销售，商品名Prornozyme。如今，它是应用最广，产量最大的普鲁兰酶。呈棒状，深层发酵几小时后，可观察到类原生质体的膨胀细胞，较稳定，饱子呈圆柱体或椭圆体。格兰氏反应阳性，37℃生长良好，45℃以上和pI-1高于以上不长，在以普鲁兰糖为碳源的培养基(( ～)上生长良好。 枯草芽饱杆菌(Bacillus subtilis) 1986年，日本的Yushiyuki Takasaki报道了一株能产生耐热耐酸普鲁兰酶的菌种，被命名为Bacillus subtilis TU。此菌种所产生的酶为普鲁兰酶和淀粉酶的混合物，可水解淀粉为麦芽三糖和麦芽搪.水解普鲁兰糖为麦芽三糖，其中普鲁兰酶最佳作用pH为～，但在时亦有约50%的酶活，此普鲁兰酶最佳作用温度60℃。 耐热产硫梭菌(Clostridum Themosulfurogenes) 1987年.德国的等报道了一株能同时产a淀粉酶、普鲁兰酶和葡萄糖淀粉酶的菌种:耐热产硫梭菌。该菌种所产普鲁兰酶有较广的温度适应范围(40℃～85℃)，在～有较高的活性，在如此广的范围内都有较强活力无疑将扩大该普鲁兰酶的应用领域. Bacillusnaganoensis,Bacillus deramificans, 上世纪九十年代，Deweer发现了普鲁兰酶产生菌Bacillus naganoensis;Tomimura筛选出Bacillus deramifrcans。这两株菌所产的普鲁兰酶的酶学性质与Bacillus. Acidopullulyticus的酶学性质相似。这两株菌都是中度嗜酸菌，在以上就不生长，温度超过45℃以上同样也不生长。这两株普鲁兰酶产生菌的发现，进一步拓宽了普鲁兰酶的应用。 产普鲁兰酶的高温菌菌种 自上世纪八十年代以来，人们逐渐意识到在通常的自然条件下，很难筛选得到极端耐热的普鲁兰酶生产菌种，于是各国的科学家便把目光转移到温泉嗜高温细菌的筛选，而且现在已经取得较多的成果。Bacillus如vorcaldarius所产普鲁兰酶的最适温度和pH分别是75～85℃, , Thermotoga maritime的最适温度和pH分别是90℃, , Thermurs caldopHilus的最适温度和pH分别是75℃,, Fenidobacterion pernnavoran最适温度和pH分别是80～85℃, 2.普鲁兰酶的分子结构 至今为止，许多普鲁兰酶的基因己经被克隆，但是还没有见到任何有关普鲁兰酶结构的报道，但是在根据序列相似性对糖普键水解酶的分类，普鲁兰酶属于第13家族，α淀粉酶家族，这个家族中包含了30多种酶，可以分为水解酶，转移酶。异构酶三大类。这些酶能够水解和合成α～,α～,α～,α～,α～,α～糖苷键。其中很多酶的结构已经被报道，它们都采取了(β/α)8的结构，通过生物信息学的研究，这个家族的蛋白都有一个共同的结构，酶的活性中心都是(β/α)8折叠筒的结构，命名为结构域A。第13家族的大多数酶还具有结构域B，它是位于(β/α)8折叠筒中，第三个β片层与第三个α螺旋之间的一段序列，其特点是结构和长度差异较大，推测其功能是与底物的结合有关。在紧接着(β/α)8折叠筒后，还有C结构域，紧接C结构域，部分家族成员还有结构域D。 3.普鲁兰酶的应用 普鲁兰酶，在食品工业中是一种用途广泛的酶制剂和加工助剂。它能专一性分解淀粉中的支链淀粉和糖原分子及其衍生的低聚糖分支中的α～l, 6糖苷键，使分支结构断裂，形成长短不一的直链淀粉。因此，将该酶与 其它 淀粉酶配合使用时，可使淀粉糖化完全。近年来，普鲁兰酶己作为淀粉酶类中的一个新酶种，应用于淀粉为原料的食品等工业部门，在食品工业中有如下几方面的作用: 单独使用普鲁兰酶，使支链淀粉变为直链淀粉 直链淀粉具有凝结成块，易形成结构稳定的凝胶的特性，因此，可作为强韧的食品包装薄膜。这种薄膜对氧和油脂有良好的隔绝性，又因涂布开展性好，故适合于作为食品的保护层。它还适合于淀粉软糖制造，也可用作果酱增稠剂，用于装油脂含量高的食品，以防止油的渗出以及肉食品加工。近年来在食品工业中提倡使用可被生物降解的薄膜，直链淀粉在这些方面具有较大的发展前途。豆类直链淀粉含量较高，因此绿豆淀粉制成的粉丝韧性比其它淀粉好，如果用普鲁兰酶处理谷物淀粉，再制成直链淀粉后，可以制成高质量的粉丝。一般谷物淀粉中，直链淀粉含量仅占20%，支链淀粉含量约为80%。工业上每生产1吨直链淀粉就有4吨副产品的支链淀粉。美国虽然通过遗传育种的方法.得到含直链淀粉60%玉米新品种，但不大适于大量生产。国外已采用普鲁兰酶改变淀粉结构，可使支链淀粉变为直链淀粉。据报道，采用此法收率可达100%.制造直链淀粉的方法为，先采用普鲁兰酶分解经液化的分支部分，使其转变为直链淀粉，并以丁醇或缓慢冷却法沉淀淀粉。再回收含少量水分的晶型沉淀物，最后通过低温喷雾干燥法制成粉状的直链淀粉。 普鲁兰酶与β～淀粉酶配合使用生产麦芽搪 饴糖是我国传统的淀粉糖产品，其中所含部分麦芽糖，广泛用于糖果、糕点等食品工业。目前生产方法是以α～淀粉酶进行液化，再用β～淀粉酶水解支链淀粉，这样只能水解侧链部分。接近交叉地位的α～糖苷键时，水解反应停止。但如果使用普鲁兰酶共同水解，便能使分支断裂，提高淀粉酶水解程度，降低了β极限糊精的含量，大大提高了麦芽糖的产率，有利于生产麦芽搪浆。目前对加普鲁兰酶进行糖化己作了较大规模的试验。 试验条件为。每批投料量约为900公斤碎米，粉浆浓度为15～16Be°数皮用量(对碎米计)，β～淀粉酶活性2,000单位/克以上，;普鲁兰酶活性45,000～55,0 00单位/克，系由产气气杆菌生产，每批用量为1公斤。试验结果表明，加入普鲁兰酶糖化的试验糖与对照糖品相比，还原糖平均增加，麦芽糖含量平均增加了，糊精含量平均减少了高浓度麦芽糖浆较之高浓度葡萄搪浆，具有不易结晶，吸湿性小的特点，所以高浓度麦芽糖浆在食品工业中有着广泛的用途。采用普鲁兰酶与p一淀粉酶配合使用，成本低廉，麦芽糖收率达到70%左右，其至更高。 用于啤酒外加酶法糖化 啤酒生产中麦芽，既是酿造啤酒的主要原料，也为酿造过程提供了丰富的酶源。在啤酒酿造的糖化过程中，麦芽中分解淀粉的主要酶是α～淀粉酶、β～淀粉酶和分解淀粉α～1. 6糖瞥键的R一酶(植物普鲁兰酶或植物茁霉多糖酶)。β～淀粉酶与另两种淀粉酶协同作用，可使淀粉分解成麦芽糖(也包括少量的麦芽三糖和极少量的葡萄糖)和低分子糊精。使麦芽汁有比较理想的糖类组成。在工业生产中为了节约麦芽用量，采用所谓外加酶法糖化，即在减少麦芽用量的前提下，增加淀粉质辅助原料的比率，并加入适当种类的酶制剂进行搪化。要使大麦及其它辅助原料糖化完全，需要外加a一淀粉酶和分解α～糖苷键的普鲁兰酶制剂等。单独使用a一淀粉酶时产生麦芽糖和麦芽三搪是很不完全的。假如分解淀粉α～糖苷键的酶活性不足，淀粉分解就不完全，其结果是可发酵性糖含量低，制成的啤酒发酵度达不到要求。若采用能分解α～和α～糖苷键的糖化型淀粉酶，则其反应产物为葡萄糖，容易使酒味淡薄。采用普鲁兰酶与α～淀粉酶协同，效果良好，其分解产物主要是麦芽糖和少量的麦芽多糖。采用外加酶法糖化时，加入酶制剂的用量为:淀粉酶6～7单位/克大麦及大米:蛋白酶，60-80单位/克，并配合以菠萝蛋白酶10ppm，普鲁兰酶50单位/克大麦。以上三种酶制剂均添加于糖化或酒化开始。 总之，普鲁兰酶无论作为酶制剂和食品工业的加工助剂均有广阔的发展前途。 研究目的和意义： 酶制剂工业是上世纪七十年代就己经形成的一个重要的产业，目前世界酶制剂总产值达100亿美元，我国的产值约为100亿人民币，并且随着其应用领域的不断扩大以及新酶种的开发，这一市场正在迅猛发展。但是全球酶制剂产业几乎被几家外国公司所垄断，其中丹麦的NOVO公司几乎占全球总销售额的一半。本研究对普鲁兰酶的开发，对酶制剂产业的发展有重要的意义。 其次我国自从七十年代开始便对普鲁兰酶进行研究开发，但是所开发得到的普鲁兰酶，既不耐热也不耐酸，这就使其在工业化应用中受到了局限。为了改变我国对进口产品的依赖，填补我国这一领域的空白，寻找一条国产化的道路，本研究的目的是利用自然微生物资源，普鲁兰酶，提高我国淀粉原料的利用率，从而提高整个淀粉加工行业的生产率，这对我国淀粉加工产业的意义是不言而喻的。 研究内容(内容、结构框架以及重点、难点)： 一.普鲁兰酶产生菌的筛选 (1)样品的采集; (2)菌种初筛; (3)菌种复筛; (4)菌种保藏方法; (5)酶活力测定方法的建立。 二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究 (1)碳源，氮源对发酵产酶的影响; (2)初始PH对发酵产酶的影响; (3)接种量对发酵产酶的影响; (4)发酵温度对产酶的影响; (5)金属离子对产酶的影响。 重点或关键技术： (1)纯菌株的分离; (2)菌株的鉴定方法的选择。 研究方法、手段： 一.普鲁兰酶产生菌的筛选 (1)样品的采集：选择适合产生的地点(面粉厂.菜地.果园等)采集土样 (2)菌种初筛：在采集的土样用无菌水稀释后，在含有淀粉类的培养基中做平板涂步， 37℃培养48h后，用碘液进行显色反应，将有淀粉酶产生的菌落接于斜面中保存。 (3)菌种复筛：将前期分离的能产生淀粉酶的菌株涂步于普鲁兰糖平板上，37℃培养48h后用95%乙醇进行透明圈实验。有透明圈产生说明菌株产生普鲁兰酶，将产生透明圈的菌落挑于斜面培养基培养。 (4)菌种保藏方法： 采用4℃低温保藏。 (5)酶活力测定方法的建立：采用发酵培养液经过离心后利用DNS显色法 520nm测定吸光值，测定标准葡萄糖标准曲线，利用标准曲线计算普鲁兰酶酶活大小。 二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究 (1)碳源，氮源对发酵产酶的影响：采用不同碳源，氮源培养基培养一段时间，测定酶活力。(其他条件相同：接种量，装瓶量，初始PH值，转速，培养时间。) (2)初始PH对发酵产酶的影响：采用相同发酵培养基，在不同初始PH下接种等量种子液。在相同条件下培养，测定发酵液的酶活。(其他条件相同：接种量，装瓶量，转速，最佳培养温度，最佳培养时间。) (3)接种量对发酵产酶的影响：在发酵培养基中分别接入2%，4%，6%，8%， 10%，14%，18%的种子培养液于最佳碳源，氮源，最佳初始PH的培养基中，在相同条件下培养，分别检测酶活。(采用以上确定的最佳碳源，氮源，最佳初始PH。) (4)发酵温度对产酶的影响：采用相同培养基，在不同温度下(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃)培养一定时间，测定酶活力。 (5)金属离子对产酶的影响：在基础培养基中加入少量不同金属离子，发酵后测酶活。(金属离子有： 锰离子，钙离子，锌离子，镁离子，铁离子，铜离子。) 研究进度 ：完成项目总体进度30%，样品土样的采集及前期的准备工作,菌株的初筛，包括(样品土样原液的涂步培养及摇床培养，产支链淀粉酶菌株的挑选及斜面培养)。 ：完成项目总体进度50%,菌株的复筛，包括(产普鲁兰酶菌株的筛选及斜面培养),葡萄糖标准曲线的测定,酶活测定方法的建立,并以酶活大小对菌株进行再次筛选。 ：完成项目总体进度80%,产酶条件的研究。包括：碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。并通过各中单因素试验确定发酵培养基的最佳碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。 2009、4—2009、5 ：完成项目总体进度100%,课题总结，撰写论文。 文献综述(包括：国内外研究理论、研究方法、进展情况、存在问题、参考依据等) 自从1961年Bender H.等人在研究一株产气气杆菌Aerobacter aerogenes(典型菌为肺炎克雷伯氏杆菌)时首次发现普鲁兰酶后，国际上对产生这种酶的微生物进行了广泛研究，发现许多微生物可以产生此酶，并筛选出一些适用于工业化生产的优良菌株。随着该酶的应用发展，对耐热性普鲁兰酶的研究也逐渐增多，已成功克隆并表达了该酶的基因。国内1976年开始对一株产气气杆菌(Aerobacteraerogenes 10016)的普鲁兰酶进行研究，对该菌株的产酶条件、酶的分离提取及酶学性质作了报道，并研究了该酶的食品级提取技术。此外，陈朝银、刘涛等人从云南温泉水样中筛选到一株产普鲁兰酶高温栖热菌菌株，通过诱导等实验将该酶的酶活从提高到170u/mL，酶产量提高了近2500倍左右，酶的最适作用温度及pH分别是75℃和，具有一定的耐热和耐酸特性。 陈金全等从温泉水样中筛选到一株产耐热耐酸普鲁兰酶的野生菌株，并根据形态、生理生化特征、细胞化学组分分析及16SrDNA序列比对、基因组DNA的G+C摩尔百分含量、同源性比对等实验，鉴定其为脂环酸芽抱杆菌属(Alicyclobacillus)的一个新种，所产酶最适作用温度为60℃，最适pH值，具有较好的耐热耐酸特性。杨云娟等利用毕赤酵母成功构建了普鲁兰酶表达量较高的基因工程菌，摇瓶发酵酶活可达，最佳发酵条件下产量可达 .酶的最适作用温度为600C，最适pH值，具有较好的耐热耐酸性。目前我国仍没有具备独立生产普鲁兰酶能力的厂商，要实现低成本、国产化的生产，还有很长的路要走。 技术应用于耐热脱支酶的研究，使耐热异淀粉酶的研究有了很大发展。Coleman等人将嗜热厌氧菌T. brockii普鲁兰酶基因克隆到中得到的克隆子分泌的普鲁兰酶数量高于出发菌株，Okada等人将Bacillus Steanther, onhiu:中编码热稳定异淀粉酶的基因克隆到:中，得到的转化菌株其异淀粉酶能在60 ℃稳定15分钟。Burchadf将。ostridium thermosulf urogenes DSM38%的嗜热异淀粉酶基因克隆并在中表达，所得酶的最适pH和最适温度与出发菌相同，而且在高温下仍能保持活性.Antranikiam等人将Pyrococcus舟riousous的异淀粉酶基因克隆到中并分离得到了酶蛋白。尽管如此，目前尚未有已将转基因的耐热性异淀粉酶工程菌应用到工业生产中的报道。众所周知，利用物理和化学诱变剂单独或复合处理微生物细胞是选育高产变种菌株行之有效的经典方法，它在为培育多种抗生素、氨基酸、核苷酸激酶(尤其是蛋白酶和淀粉酶)的高产变种菌株方面曾经起过极为重要的作用，至今仍然是方便易行和行之有效的方法之一。 主要参考文献： [1][美]惠斯特勒等编王雏文等译.淀粉的化学与工艺学[M].北京：中国食品出版社，1988 [2]张树政.酶制剂工业[M]. 北京: 科学出版社，1998 [3]邬显章.酶的工业生产技术[M]. 吉林: 吉林科学技术出版社，1988 [4]Taniguchi H, Sakano Y, Ohnishi M, Okada G(1985) Pullulanase[J].TanpakushitsuKakusan Koso. 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