前言
细胞凋亡通常称为细胞程序性死亡,是由基因控制的主动性细胞死亡过程。越来越多数据发现,细胞凋亡与多种疾病密切相关,如癌细胞具有连续增殖、抵抗细胞凋亡能力,利用流式细胞仪分析细胞凋亡可为肿瘤诊断,疗效评价和预后预测提供了重要的参考指标。然而很多实验的同学们,常会碰到上机检测时细胞死亡太多却检测不出凋亡,多次重复结果不一致等现象,本文就一起看看如何把细胞凋亡的数据变的更加漂亮,准确!
首先,明确一下细胞凋亡和坏死的区别
细胞凋亡(apoptosis) 是一件主动性细胞死亡事件,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控,是细胞为更好地适应环境而主动争取的一种死亡过程。 具体表现为: 出芽形成凋亡小体、核小体间DNA的切割,凋亡小体被吞噬和消化等几个连续过程等[1](如下图所示)。
图1:细胞凋亡的发生过程[1]
细胞坏死(necrosis) 则是一件被动的过程,是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程,即病理条件下,自体损伤的一种现象。 具体表现为: 细胞胀大,胞膜破裂,细胞内容物外溢,核变化较慢,DNA降解不充分,会引起局部严重的炎症反应(如下图所示)。
图2:细胞坏死的发生过程[1]
一、流式检测细胞凋亡的原理
Annexin V和PI双染法是流式检测细胞凋亡的经典方法 ,它是基于凋亡的早期细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine, PS)从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面这一原理来实现的(如下图3)。
图3:凋亡早期 PS从细胞膜的内侧外翻
该方法简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞,具体原理如下:
因此,将Annexin V与PI联合使用时,便可用来鉴别活细胞,凋亡细胞及死亡细胞。
二、实验操作步骤
三、数据分析
Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒是用FITC标记的Annexin V作为探针,FITC最大激发波长为488 nm,最大发射波长525 nm,FITC的绿色荧光在FL1通道检测;PI-DNA复合物的最大激发波长为535 nm,最大发射波长为615 nm,PI的红色荧光在FL2或FL3通道检测。通过软件分析,绘制双色散点图,FITC为横坐标,PI为纵坐标。
如下图所示:细胞可以分为4个象限:
图4:4个象限的细胞分布图
举例:如常用于研究药物或者基因等对细胞凋亡的影响。 通过比较Control组和药物组,发现化合物可以诱导前列腺癌细胞系PC-3M的细胞凋亡,处理组(20μM)的晚期凋亡细胞比例与Control组(0μM)相比,从1.79%上升到11.39%。进而还可根据每个象限的数据计算出活细胞、凋亡细胞和坏死细胞百分率。
图5. 药物浓度梯度依赖性的诱导PC-3M细胞凋亡[2]
四、常见问题解答
1. 如何避免出现假阳性结果?
2. 为什么必须收集细胞上清?
因为凋亡的细胞可能会脱壁,悬浮于培养基,所以必须收集上清再离心取沉淀,合并胰酶消化下来的细胞,不然检测出来的凋亡比例可能会减少。
3. 为什么在染色后1h内就要上机检测?
由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析;PI受时间的影响很大,因标记了PI后会加大细胞毒性,特别是检测早期凋亡时,如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外,误差会明显加大,所以建议在一个小时内检测。
4. 其他注意事项
参考文献:
[1]Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 2007;35:495-516.
[2]Qin M, Peng S, Liu N, et al. LG308, a Novel Synthetic Compound with Antimicrotubule Activity in Prostate Cancer Cells, Exerts Effective Antitumor Activity.[J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2015,355(3): 473-483.