08年发表非典论文

反向遗传学 被认为是一种不可或缺的工具，它彻底改变了我们对病毒发病机制和疫苗开发的认识。大型的RNA病毒基因组，如冠状病毒基因组，由于基因组较大且不稳定，很难在大肠杆菌宿主中克隆和操作。 两位通讯作者均来自瑞士的University of Bern Transformation-Associated Recombination cloning  TAR克隆 基因组DNA片段和过量的TAR载体在去除细胞壁的酵母细胞中进行混合。每个载体中都含有对目的基因特异的两段序列（标为蓝色和红色）以及酵母的筛选标记HIS3和CEN6（淡蓝色原点）。由于载体过量，酵母细胞便会将DNA片段全部接受。根据具体情况又可分为三类：1）未分到基因组DNA的；2）分到基因组DNA但未被整合到TAR载体上的；3）分到基因组DNA且通过自身同源重组被整合到TAR载体上的。显然我们是只需要第三种情况的阳性克隆，怎么把其它两种过滤掉呢？答案是进行电泳。 下图是对上述过程的简化示意： 2010年5月20日，J. Craig Venter Institute在美国 Science  杂志上报道了首例人造细胞的诞生。向山羊支原体  Mycoplasma capricolum  细胞中转入人工合成的蕈状支原体 Mycoplasma mycoides  的基因组而来，产生的人造细胞表现出的是蕈状支原体的生命特性。利用该平台，研究人员在拿到合成DNA片段后一周内，对新冠病毒进行了基因组改造和病毒拯救。研究团队于1月14日向试剂公司下单，以化学合成方式得到上述14个DNA片段，并在2月4日拿到其中的12个含片段载体（有pUC57、pUC19、pUC57mini和PCC1-His3）。其中片段5 和7 未获得，原因不详。研究团队最终通过对一位来自慕尼黑患者的新冠病毒样本（BetaCoV/Germany/BavPat/2020）进行RT-PCR 扩增，获得了第5和第7个片段。 利用TAR 克隆，研究人员获得了6 组正确组装的新冠病毒构建体的分子克隆。随后用酵母的同源重组系统依据末端重复的序列将这些DNA 序列拼到一起。获得完整的病毒序列后，用T7 RNA 聚合酶将其通过脱落转录，得到病毒RNA，将该RNA 用电穿孔技术导入到非洲绿猴肾细胞（VeroE6 cell）中，使其感染。将用于培养绿猴肾细胞（~2d），含释放出的病毒颗粒的上清液注入到别的培养基中，发现可以感染别的细胞，说明新构建的酵母合成平台可以拯救病毒。 同理，作者团队在鼠肝炎病毒A59（MHV-A59）和MERS-CoV进行病毒拯救的测试，发现效果依旧很好，测试的克隆中正确组装了病毒基因组的YAC均可达到90％，这表明病毒在酵母中的组装效率相当之高。 TAR 克隆系统的一个最重要的优点就是可以先对全基因组进行设计，通过对小的具有重复序列的片段的合成，进而再依靠酵母的同源重组系统进行片段的正确组装，极大的降低了合成的难度，也大幅提高了合成的效率。无需得到变异毒株的临床样本，通过对病毒变异的分析，可以合成构建出该变异毒株的基因组片段，再通过酵母平台进行重建与拯救。论文中还提到对局部片段的重新设计，以测试改变前后对病毒的影响。 总的来说，这一方法即利用酵母人工染色体在酵母体内将合成的SARS-CoV-2的DNA片段进行体外重组，获得全长cDNA克隆。再将cDNA体外转录为RNA，利用电穿孔将病毒RNA转染进哺乳动物细胞，实现病毒拯救。 化学合成的基因组DNA所产生的SARS-CoV-2可以绕开病毒分离物的来源限制，而且还可以对单个基因进行遗传修饰和功能表征。 对于这一篇论文，我起初有许多地方不明白。 首先是病毒的基因组合成，理论上讲，比病毒更高级的生物基因组，并不是没有人合成出来过，因此这篇论文的技术可以说是降维打击了，那为什么还可以发表在顶级杂志 Nature 上呢？ 从时间线上进行分析，我们可以得知，1月11日病毒序列正式被公布（据我所知应该是中国CDC发布的），但是国外第一个提取出病毒毒株的时间却是到了2月26日，与序列的公布整整相差1个多月。我们也可以知道这次的Pandemic，一个多月可以新增多少感染者和死亡者，时间就是生命啊！而作者在序列公布后的第3天便下出了订单，在ICTV正式公布新冠病毒名称的第2天便得到了拯救完成的病毒。可以想象，如果以后没有可能及时得到病毒的毒株，我们可以直接根据序列得到病毒的毒株， 这是本篇文章最大的亮点之一，即在此类形势下给人一种研究病毒的范式。 第二个亮点，可以关注到作者不仅做了SARS-CoV-2，还做了MHV和MARS-CoV。看不明白的话给个提示：这三种病毒都是冠状病毒科（Coronaviridae ）的！此外，作者在表格中还列出未实现拯救的人呼吸道合胞病毒（hRSV-B）、寨卡病毒（ZIKA virus）和流感病毒（HCoV）。这意味着作者想 通过对一系列冠状病毒的拯救验证来说明这一平台广泛的适用性 ，将难缠的冠状病毒，乃至其他病毒的毒株获取难度降低。这或许对科学界是件好事，但是可能也是件坏事吧… Craig Ventor；冠状病毒亚基因组； 《COVID-19全景综述》，为一张大图，涉及基本信息，免疫学过程等内容， 很震撼且 非 常华丽 ！在 公众号“炫亦”回复“cv”即可获得云盘链接！ [1] Thao, et al.  Nature  , 2020.  [2] Natalay Kouprina & Vladimir Larionov.  Nat Protocol  , 2008. [3] Daniel G. Gibson, et al.  Science  , 2010.  [4] 孙明伟, 李寅, 高福.  生物工程学报  , 2010.

在2003年的非典型性肺炎病情上，生死一瞬间，在以痛苦、哀嚎、无助无为氛围的工作环境里，每一位医护人员都必须具备强健的身体和良好的心理素质，对于叶欣而言，在急诊科一干就是几十年。每当急诊科有传染性疾病患者前来就诊，叶新总是一马当先冲在前锋，然而，对待这些病人，她护理得很周到——对于家境贫寒的病人，他甚至主动出自己的血汗钱来为病人买东西，这些钱都是用他的生命换来的，他的工作非常的荣幸。3月4日中午，极度疲倦的月薪开始出现发热症状，经过漫长的确诊后，确定是染上了非典叶欣的病情，牵动了所有人的心，直到2003年3月25日凌晨一点半，就在叶新最后所抢救的也是传染非典的不到一周，叶心永远离开了岗位，离开了战友和亲人，那年他才是17岁，抗击非典是个硬仗，在这场残酷的战争中，有的医护人员病倒了，有的则献出了，宝贵的生命但面对舆，生与死的选择，没有一个人后退，没有一个人逃离！叶欣用他自己的生命从阎王那抢就了素季十个人的生命，但最后他还是被阎王抢了去，但他这种牺牲自我的精神值得我们敬佩！

叶欣1956年7月9日出生于广东徐闻一个医学世家。1974年被招进广东省中医院卫训队。1976年毕业时，因护理能力测试成绩名列前茅被留院工作。1983年，被提升为广东省中医院急诊科护士长，是该院护士长中最年轻的。 急诊科是省中医院最大的护理单位，下设120、补液室、抽血室、注射室、留观室、治疗室六个部门。“快速、及时、有效”的工作性质、复杂多变的病情、触目惊心的状况，需要护士长不仅需要超一流的护理专长，更要有临危不惧、指挥若定的领导能力和冷静快捷的思维能力。生死一瞬间，在以痛苦、哀号、无助为氛围的工作环境里，每位医护人员都必须具备强健的身体和良好的心理素质。对于女性而言，这何尝不是对身心的超级挑战。而叶欣在急诊科一干就是几十年。每当急诊科有传染性疾病患者前来急诊时，叶欣总是一马当先，冲锋在前，尽量不让年轻的小护士们沾边。每次她总是说：你们还小，这病危险！对待这类病人，她护理得格外耐心、细致，没有一丝的嫌弃。对于家境贫寒的病人，她甚至主动出钱为病人买东西。她常常对护士们说：“病人得了传染病已经够不幸了，但社会的歧视给他们心理造成的伤害也许比病痛更难受！作为护士，我们一方面要解决他们身体的痛苦，更要给他们爱的力量，生活的力量。”一次是一位刚参加工作的护士为病人服务时引发了病人的不满，叶欣主动到患者家登门道歉，并作自我批评。广东省中医院二沙分院刚建立时，叶欣主动请缨，提出到二沙急诊科担任护士长，负责繁重的护理组建工作。 2001年，一位来自福建某山区的重症患者到急诊科治疗，病情刚稳定就急着要求回家。叶欣苦心规劝，但病人就是不听，于是科室决定用救护车送病人回家。叶欣又主动申请沿途护理。22小时的颠簸和护理，病人安全到家了，可她却累得直不起腰来。为了尽快赶回上班，第二天一上午，叶欣自己出钱乘飞机回到了广州。 2003春节前后，一种病因未明的非典型肺炎开始在广州一些地区流行。2月上旬刚过，广东省中医院二沙急诊科就开始收治确诊或疑为“非典”的病人，最多时一天5人。面对增加了两倍的工作量，叶欣周密筹划、冷静部署，重新调班时，安排了加强班。随着“非典”患者的急剧增多，广东省中医院当机立断，紧急抽调二沙分院急诊科部分护士增援位于市中心的院本部。二沙急诊科护士力量出现了明显的不足。叶欣身先士卒，从2月8日便开始加班。 3月4日中午，极度疲倦的叶欣开始出现发热症状，后确诊染上了非典型性肺炎。为了救治叶欣，医院在最短时间内成立了治疗小组。叶欣的病情几乎牵动了所有人的心。广东省委书记张德江委托蔡东士秘书长慰问她和家属；雷于蓝副省长也在省政府副秘书长黄业斌、省卫生厅厅长黄庆道的陪同下，亲自到医院了解治疗情况。省卫生厅、省中医药管理局、广州中医药大学的领导也为抢救叶欣提供了技术、物质、器械的支持。 2003年3月25日凌晨1:30，就在叶欣最后所抢救的、也是传染给她“非典”的那位患者健康出院后不到一个星期，叶欣永远离开了她所热爱的岗位、战友和亲人，享年47岁。 叶欣在担任护士长期间，始终把培养护理人才作为本科室一项重要的工作来抓。她常利用午休给护士们上业务课，让刚进急诊科的姑娘们在她身上练习扎针。 叶欣在担任护士长期间，始终没有放弃对新知识的钻研，她总是在第一时间掌握最新技术。1995年，论文《甲黄膜液对褥疮治疗护理的应用研究》获广东省中医药管理局科技进步三等奖，实现了该院护理课题在科技创新中零的突破。直到去世前，共有发表论文13篇。 叶欣是一个性格恬淡的人，她不求闻达，只讲奉献。作为领导，她的宽容、平和、正直，她的忍让、内秀和公正，无不深深折服着她的同事和朋友。科室里的小护士曾诗意地说：叶护士长简直就是阳光和微笑的化身，那么透明，又是那么明媚。加班、顶班，对她可谓司空见惯，尤其是节假日，她会主动给自己排上班。叶欣去世后，她爱人动容地说：“我和叶欣结婚22年了，但只有结婚那年我们一起在家过了春节，其余她全是在医院度过的。” 2003年4月16日《健康报》发表了《永远的白衣战士——追记广东省中医院护士长叶欣》的通讯，讲述了叶欣护士长不顾个人安危顽强抗击“非典”的感人事迹。

非典型性肺炎 （Atypical pneumonias）是指由支原体、衣原体、军团菌、立克次体、腺病毒以及其他一些不明微生物引起的肺炎。而典型肺炎是指由肺炎链球菌等常见细菌引起的大叶性肺炎或支气管肺炎。 其实在医学界，人们对03年发生的这场传染病的名称存在争议，因为已经查明，这种病其实并不是医学上通常所说的“非典型肺炎”，而是“传染性冠状病毒肺炎”。 对于这种型传染病，人们的认识有一个逐步深入的过程，概念也渐趋正确。起初人们认为，致病原因是衣原体病毒，直到03年3月份才弄清其病原体是“冠状病毒”。我国广东医生在与病魔的搏斗中，根据其临床上有发烧、咳嗽、肺部有阴影等肺炎共性症状，但与由肺炎链球菌等细菌引起的肺炎相比，症状不够典型，病原体尚未完全明确，而且有传染性强、使用抗菌药物治疗无效等特征，于1月22日首次使用“非典型肺炎”来命名它，世界卫生组织也确认了其医学名称Atypical pneumonia，简称ATP。2月底，世界卫生组织的意大利籍传染病专家卡洛·厄巴尼（Carlo Urbani）大夫根据当时已经掌握的情况将其命名为severe acute respiratory syndrome (简称SARS)，3月15日世界卫生组织正式以此取代了ATP。 事实上， severe acute respiratory syndrome这一命名也没有充分反映该病症的本质特征，早有人建议应该将其命名为“传染性冠状病毒肺炎”（果真如此，可缩略为“冠肺”）。这种建议虽然尚未被社会和医学界接受，但足以佐证了SARS和非典一样，都是反映人们一定阶段对事物区别性特征的认识。 目前已经找到治疗方法，中国和欧盟科学家联手，成功找到了15种能有效杀灭非典病毒的化合物，为合成非典治疗药物提供了新方法。中欧科学家2005/6/9日在杭州结束的“中国—欧盟非典诊断及病毒研究”项目学术年会上公布了这一成果。 香港大学的新近研究表明，蝙蝠可能是SARS病毒野生宿主 计算机汉字输入专家周钢曾于2003年建议“非典型性肺炎”可以称为“肺痶”。 不过，仍然建议应该按世界卫生组织（WHO）的命名原则，在医学界称之为SARS（音“萨斯”）。香港医学界在第一时间与WHO一样，改称为SARS，中国大陆地区，因为民间一直以简称“非典”来称之，故在词条本身，不建议更改。 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 传统医学上的非典型肺炎是相对典型肺炎而言的，典型肺炎通常是由肺炎球菌等常见细菌引起的。症状比较典型，如发烧、胸痛、咳嗽、咳痰等，实验室检查血白细胞增高，抗菌素治疗有效。非典型肺炎本身不是新发现的疾病，它多由病毒、支原体、衣原体、立克次体等病原引起，症状、肺部体征、验血结果没有典型肺炎感染那么明显，一些病毒性肺炎抗菌素无效。 非典型肺炎是指一组由上述非典型病原体引起的疾病，而不是一个明确的诊断。其临床特点为隐匿性起病，多为干性咳嗽，偶见咯血，肺部听诊较少阳性体征；X线胸片主要表现为间质性浸润；其疾病过程通常较轻，患者很少因此而死亡。 非典型肺炎的名称起源于1930年末，与典型肺炎相对应，后者主要为由细菌引起的大叶性肺炎或支气管肺炎。60年代，将当时发现的肺炎支原体作为非典型肺炎的主要病原体，但随后又发现了其他病原体，尤其是肺炎衣原体。目前认为，非典型肺炎的病原体主要包括肺炎支原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、军团菌和立克次体(引起Q热肺炎)，尤以前两者多见，几乎占每年成年人社区获得性肺炎住院患者的1／3。这些病原体大多为细胞内寄生，没有细胞壁，因此可渗入细胞内的广谱抗生素(主要是大环内酯类和四环素类抗生素)对其治疗有效，而β内酰胺类抗生素无效。而对于由病毒引起的非典型肺炎，抗生素是无效的。 --------------------------------------------------------------------------------------------- 黄杏初，中国首例报告SARS病人（即中国大陆地区俗称的“非典病人”）,也是全球首例。 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ SARS症状及体征临床诊断 1.流行病学史 1.1 发病前2周曾密切接触过同类病人或者有明确的传染给他人的证据 1.2 生活在流行区或发病前2周到过SARS正在流行的地区 2.症状与体征 发热（＞38℃）和咳嗽、呼吸加速，气促，或呼吸窘迫综合征，肺部罗音或有肺实变体征之一以上。 3.实验室检查 早期血WBC计数不升高，或降低。 4.肺部影像学检查 肺部不同程度的片状、斑片状浸润性阴影或呈网状样改变 5.抗菌药物治疗无明显效果。 SARS的临床诊断 根据病例的流行病学资料、症状与体征、实验室检验、肺部影像学检查综合判断进行临床诊断，一旦病原确定，检测方法特异，即建立确诊病例的定义。 疑似病例：1.1＋2＋3或1.2＋2＋3＋4 临床诊断病例：1.1＋2＋3＋4或1.2＋2＋3＋4＋5 SARS重症病例诊断标准 SARS病例符合下列标准的其中1条可诊断为SARS的重症病例： 1.多叶病变或X线胸片48小时内病灶进展>50% 2.呼吸困难，呼吸频率>30次/分； 3.低氧血症，吸氧3-5升/分条件下，SaO2< 93%，或氧合指数<300mmHg。 4.出现休克、ARDS或MODS（多器官功能障碍综合征）。 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 显而易见的是，由于SARS是由于病毒引起，所以，针对细菌有效的任何抗生素类药物，均对此疾病无明显疗效。 传统意义的“非典型肺炎”，可能是由于支原体、衣原体、立克次体等病原体引起，或由罕见细菌引起，则可能会对大环内酯类抗生素有敏感性，即用大环内酯类抗生素（即红霉素类）可以作为特效药物治疗。 但若传统意义上的“非典型肺炎”也是由于病毒引起，则抗生素也无效。此时，若运用抗生素，实为抗生素的滥用。