同日发表两篇新冠病毒论文

英国剑桥大学及德国学者本周发表了一篇探讨新冠病毒传播溯源的研究报告，探讨新冠病毒从武汉到欧洲和北美的传播轨迹。研究发现，病毒毒株可分为A、B、C三种类型，而较为原始的版本"A型"虽然出现在武汉，但在武汉样本中更多的是变异的"B型"毒株，A型毒株在美国和澳洲研究样本上更为常见。题为"新型冠状病毒基因组谱系分析"（Phylogenetic network analysis of SARS-CoV-2 genomes）的研究报告是由英国及德国学者共同撰写，于4月8日发表于美国国家科学院院刊（PNAS）。研究人员通过基因网络技术绘制出新型冠状病毒在人体的早期"进化途径"。该研究分析了从病患身上取得的前160份完整病毒基因组，得出新冠状病毒通过突变产生的不同病毒谱系。 "A、B、C"的全球分布 剑桥大学遗传学家、报告主要撰写人彼得·福斯特（Peter Forster）介绍，由于病毒发生了太多快速突变，研究人员无法完整追踪病毒的家族谱系，所以采用数学网络算法，同时找出所有可能的谱系。福斯特表示，这项技术最为人所知的用法是通过DNA追踪史前人类的动向。 研究团队从"全球共享流感数据倡议组织"（GISAID）的数据库中提取了2019年12月24日至2020年3月4日之间收集的160个样本，发现三种拥有密切遗传谱系的的新冠病毒类型，将其分成A、B、C三种类型。其中较为原始的毒株A型与在蝙蝠身上发现的毒株最接近。A型虽然也出现在武汉，但并非武汉最常见的毒株。 研究指出，曾经生活在武汉的美国人身上也找到此类毒株。研究发现A型更常出现在美国和澳洲感染者身上，而在武汉更常见的是从A型突变的B型毒株。总体而言，B型在东亚更为普遍，而且较少在未变异的情况下传播至其它地区。研究人员分析，原因可能是武汉出现了遗传学上的"奠基者效应"，或是东亚以外的人群更能"抵抗"这一型的毒株。 由B型变异而来的C型主要出现在欧洲，在早期的法国、意大利、瑞典和英国患者身上能找到。虽然在研究中的中国患者样本上没有出现C型，但见于新加坡、香港和韩国。 基本上，在疫情暴发的第一阶段，欧洲、美国和澳洲等东亚以外地区最常见的是A型和C型。B型则是在东亚最为常见。C型早期时出现在新加坡，这也是欧洲第一批感染者身上常见的毒株类型。 这一研究报告在中国社交媒体上引起广泛讨论，认为这份报告可以成为新冠肺炎不是起源于武汉的佐证。报告主笔之一Peter Forster在接受《环球时报》采访时表示，鉴于中美之间的政治纠纷，他明白病毒起源的议题是"烫手山芋"，但这份报告以及他们目前正在进行的研究并不能给出明确解释。 至于为何A型病毒没有在武汉大范围感染，福斯特分析可能是"A型无法适应当地人的免疫系统"因此变异成B型，另一方面A型病株则适应了美国和澳洲人的免疫系统。 该研究团队目前正将其研究样本扩大至1001个病毒基因组。虽然研究结果尚未出炉，但福斯特表示，第一批感染以及病毒传播发生在去年9月中旬至12月初之间。研究人员认为，采用基因网络技术的分析方式将有助于预测下一个疫情暴发的地点。以意大利为例，意大利的"一号病人"起初被认为是曾与前往武汉的熟人接触而感染，但后者身上并未验出病毒，寻找"零号病人"的过程最终陷入死胡同。福斯特的研究则发现，意大利最早的感染案例或可追溯至1月27日被通报感染的一名德国患者，另一名初期的意大利感染病例则与"新加坡感染群"有关。

反向遗传学 被认为是一种不可或缺的工具，它彻底改变了我们对病毒发病机制和疫苗开发的认识。大型的RNA病毒基因组，如冠状病毒基因组，由于基因组较大且不稳定，很难在大肠杆菌宿主中克隆和操作。 两位通讯作者均来自瑞士的University of Bern Transformation-Associated Recombination cloning  TAR克隆 基因组DNA片段和过量的TAR载体在去除细胞壁的酵母细胞中进行混合。每个载体中都含有对目的基因特异的两段序列（标为蓝色和红色）以及酵母的筛选标记HIS3和CEN6（淡蓝色原点）。由于载体过量，酵母细胞便会将DNA片段全部接受。根据具体情况又可分为三类：1）未分到基因组DNA的；2）分到基因组DNA但未被整合到TAR载体上的；3）分到基因组DNA且通过自身同源重组被整合到TAR载体上的。显然我们是只需要第三种情况的阳性克隆，怎么把其它两种过滤掉呢？答案是进行电泳。 下图是对上述过程的简化示意： 2010年5月20日，J. Craig Venter Institute在美国 Science  杂志上报道了首例人造细胞的诞生。向山羊支原体  Mycoplasma capricolum  细胞中转入人工合成的蕈状支原体 Mycoplasma mycoides  的基因组而来，产生的人造细胞表现出的是蕈状支原体的生命特性。利用该平台，研究人员在拿到合成DNA片段后一周内，对新冠病毒进行了基因组改造和病毒拯救。研究团队于1月14日向试剂公司下单，以化学合成方式得到上述14个DNA片段，并在2月4日拿到其中的12个含片段载体（有pUC57、pUC19、pUC57mini和PCC1-His3）。其中片段5 和7 未获得，原因不详。研究团队最终通过对一位来自慕尼黑患者的新冠病毒样本（BetaCoV/Germany/BavPat/2020）进行RT-PCR 扩增，获得了第5和第7个片段。 利用TAR 克隆，研究人员获得了6 组正确组装的新冠病毒构建体的分子克隆。随后用酵母的同源重组系统依据末端重复的序列将这些DNA 序列拼到一起。获得完整的病毒序列后，用T7 RNA 聚合酶将其通过脱落转录，得到病毒RNA，将该RNA 用电穿孔技术导入到非洲绿猴肾细胞（VeroE6 cell）中，使其感染。将用于培养绿猴肾细胞（~2d），含释放出的病毒颗粒的上清液注入到别的培养基中，发现可以感染别的细胞，说明新构建的酵母合成平台可以拯救病毒。 同理，作者团队在鼠肝炎病毒A59（MHV-A59）和MERS-CoV进行病毒拯救的测试，发现效果依旧很好，测试的克隆中正确组装了病毒基因组的YAC均可达到90％，这表明病毒在酵母中的组装效率相当之高。 TAR 克隆系统的一个最重要的优点就是可以先对全基因组进行设计，通过对小的具有重复序列的片段的合成，进而再依靠酵母的同源重组系统进行片段的正确组装，极大的降低了合成的难度，也大幅提高了合成的效率。无需得到变异毒株的临床样本，通过对病毒变异的分析，可以合成构建出该变异毒株的基因组片段，再通过酵母平台进行重建与拯救。论文中还提到对局部片段的重新设计，以测试改变前后对病毒的影响。 总的来说，这一方法即利用酵母人工染色体在酵母体内将合成的SARS-CoV-2的DNA片段进行体外重组，获得全长cDNA克隆。再将cDNA体外转录为RNA，利用电穿孔将病毒RNA转染进哺乳动物细胞，实现病毒拯救。 化学合成的基因组DNA所产生的SARS-CoV-2可以绕开病毒分离物的来源限制，而且还可以对单个基因进行遗传修饰和功能表征。 对于这一篇论文，我起初有许多地方不明白。 首先是病毒的基因组合成，理论上讲，比病毒更高级的生物基因组，并不是没有人合成出来过，因此这篇论文的技术可以说是降维打击了，那为什么还可以发表在顶级杂志 Nature 上呢？ 从时间线上进行分析，我们可以得知，1月11日病毒序列正式被公布（据我所知应该是中国CDC发布的），但是国外第一个提取出病毒毒株的时间却是到了2月26日，与序列的公布整整相差1个多月。我们也可以知道这次的Pandemic，一个多月可以新增多少感染者和死亡者，时间就是生命啊！而作者在序列公布后的第3天便下出了订单，在ICTV正式公布新冠病毒名称的第2天便得到了拯救完成的病毒。可以想象，如果以后没有可能及时得到病毒的毒株，我们可以直接根据序列得到病毒的毒株， 这是本篇文章最大的亮点之一，即在此类形势下给人一种研究病毒的范式。 第二个亮点，可以关注到作者不仅做了SARS-CoV-2，还做了MHV和MARS-CoV。看不明白的话给个提示：这三种病毒都是冠状病毒科（Coronaviridae ）的！此外，作者在表格中还列出未实现拯救的人呼吸道合胞病毒（hRSV-B）、寨卡病毒（ZIKA virus）和流感病毒（HCoV）。这意味着作者想 通过对一系列冠状病毒的拯救验证来说明这一平台广泛的适用性 ，将难缠的冠状病毒，乃至其他病毒的毒株获取难度降低。这或许对科学界是件好事，但是可能也是件坏事吧… Craig Ventor；冠状病毒亚基因组； 《COVID-19全景综述》，为一张大图，涉及基本信息，免疫学过程等内容， 很震撼且 非 常华丽 ！在 公众号“炫亦”回复“cv”即可获得云盘链接！ [1] Thao, et al.  Nature  , 2020.  [2] Natalay Kouprina & Vladimir Larionov.  Nat Protocol  , 2008. [3] Daniel G. Gibson, et al.  Science  , 2010.  [4] 孙明伟, 李寅, 高福.  生物工程学报  , 2010.