孙博兴发表的论文

生物反应器（bioreactor）经历了三个发展阶段：细菌基因工程、细胞基因工程、转基因动物生物反应器。转基因动物生物反应器的出现之所以受到人们极大的关注，是因为它克服了前两者的缺陷，即细菌基因工程产物往往不具备生物活性，必须经过糖基化、羟基化等一系列修饰加工后才能成为有效的药物，而细胞基因工程又因为哺乳动物细胞的培养条件要求相当苛刻、成本太高而限制了规模生产。另外，转基因动物生物反应器还具有产品质量高、容易提纯的特点。一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫做动物生物反应器。几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可以经过人为驯化为生物反应器。从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织或器官要方便产物的获得，例如乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器、动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。转基因动物生物反应器用微生物、植物、动物或人细胞，或者用专一性酶通过生物方法将原料转化为特定产品的容器称为生物反应器。通常微生物和细胞又涉如何维持它们的环境以提供最佳的生长条件的问题。生物反应器能通过提供合适的条件：例如最佳温度、pH、有效的底物、营养盐、维他命和氧（对好氧有机物）来支持这个自然过程，使细胞能进行生长和新陈代谢。生物反应器（bioreactor) 经历了3 个发展阶段细菌基因工程、细胞基因工程、转基因动物生物反应器。细胞基因工程产物往往不具备生物活性，必须经过糖基化、羟基化等一系列修饰加工后，才能成为有效的药物，而细胞基因工程又因为哺乳动物细胞的培养条件要求相当苛刻，成本太高，限制了规模生产。动物生物反应器具有产品质量高，容易提纯的特点，弥补了其它各类基因表达系统的缺陷。转基因动物生物反应器转基因动物是指经人的有意干涉，通过实验手段，将外源基因导入动物细胞中，稳定地整合到动物基因组中，并能遗传给子代的动物。Palmiter等（1982）将含有小鼠金属巯蛋白基因启动子的DNA片断与大鼠生长激素基因融合，用微注射的方法导入小鼠受精卵，移植给受体，产下了21 只仔鼠，6 只比同窝仔鼠生长快，10周龄时体重比同窝正常鼠大1 倍，成功地获得了超级小鼠。这一结果引起世界轰动，转基因动物的内在潜力由此而得以证实。随后世界各国普遍开展了转基因动物的研究，目前已有转基因小鼠、猪、牛、鱼、鸡等多种转基因动物问世[1]。转基因动物的主要技术步骤包括目的基因的分离与克隆；表达载体的构建；受体细胞的获得；基因导入；受体动物的选择及转基因胚胎的移植；转基因整合表达的检测；转基因动物的性能观测及转基因表达产物的分离与纯化；转基因动物的遗传性能研究以及性能选育；组建转基因动物新类群等。转基因动物最为诱人的前景是利用它生产人类所需要的生物活性产品或药物。目前世界上有很多公司正在致力于这方面的研究。而转基因家畜研究最为活跃的领域就是利用它们生产新的动物产品。通常把目的基因在血液循环系统或乳腺中表达的转基因动物称为动物生物反应器，把家畜作为一种生物反映器，生产人类所需的药用蛋白，包括治疗用药物、激素和抗体等。动物血液生物反应器近年来，动物血液生物反应器取得了很大进展。血液生物反应器比较适合生产人血红蛋白、抗体和生产非生物学活性状态的融合蛋白，而有活性的蛋白或多肽（如激素、细胞分裂素、组织血纤维溶酶因子等）由于进入了动物血液循环系统而影响动物的健康。到目前为止，已有多种通过转基因动物生产的具有生物学功能的人血红蛋白问世。动物的乳腺生物反应器乳腺生物反应器的原理是外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区，即引导泌乳蛋白基因表达的序列，将外源基因置于乳腺特异性调节序列之下，使之在乳腺中表达，通过回收乳汁获得重要价值的生物活性蛋白。从目前的研究成果看，与传统的原核系统及细胞发酵系统相比，动物乳腺生产的重组蛋白产品具有以下特点：生物活性高，无污染，纯化简单，产量高，成本低。目前，已克隆并用作构建载体的乳蛋白基因主要有-乳球蛋白（BLG）基因、s1-酪蛋白基因、-酪蛋白基因、乳清酸蛋白（WAP）以及乳清蛋白基因[2]。大多数的乳蛋白基因的启动子已用于外源基因在转基因动物乳腺中的表达。s1-酪蛋白基因和-乳球蛋白的启动子尚有未知因素的作用，它们在转基因动物中表达水平低或表达不稳定。-酪蛋白的启动子在转基因动物中表达水平也很低。绵羊-乳球蛋白、山羊酪蛋白和牛s1-酪蛋白启动子在转基因动物乳腺中维持异种蛋白的表达水平较高。如果得用目的基因的DNA序列而不是cDNA，表达效果可能会更好。不翻译的外显子和内含子的掺入可能有利于转基因的表达。值得一提的是，利用乳腺生物反应器生产的“新奇牛奶”已经问世。2003 年，Brophy 等通过共转染和嘌呤霉素筛选向牛胎儿成纤维细胞引入-s蛋白基因和-酪蛋白基因的多量拷贝，而后进行核移植生产出了8 头转基因奶牛，其产奶中酪蛋白总量较普通奶高30%。这种奶的蛋白和钙含量提高，热稳定性增强而乳糜颗粒变小，其营养价值更高，也更适于奶酪生产[3]。优越性转基因动物的问世，为利用基因工程手段获得低成本、高活性和高表达的产物开辟了一条重要途径。作为生物反应器的转基因动物，主要是利用其乳腺组织和血液组织进行定位表达，特别是用乳腺组织生产具有生物活性的多肽药物和具有特殊营养意义的蛋白质，已成为一个新兴的转基因制药业，它的优越性有如下几点[4]。3.1 表达产物能充分修饰且具有稳定的生物活性利用DNA重组技术的微生物发酵工程来生产的药用蛋白,由于细菌等微生物不能进行蛋白质合成后的加工，因而生物活性低，并且具有免疫原性，而利用转基因动物生产药用蛋白却免除这些问题。成本低可以大规模生产作为生物反应器的转基因动物可无限扩繁，且饲养成本低，可进行大规模的药物生产。而动物细胞生物反应器，虽然能生产具有完全生物活性的产品，但以商业生产为目的的大规模的动物细胞培养，成本会极高且培养条件要求苛刻。产品质量高易提纯由动物生物反应器生产的药品为纯的生物制品，避免了化学试剂及生物毒素的污染。目前，某些药用蛋白生产已达每千克乳汁含几十克，生物活性与天然蛋白几乎完全一样，极易提纯。总之，动物生物反应器弥补了其它各类基因表达系统的缺陷。应用以动物的乳腺或其它组织作为生物反应器生产贵重的医用蛋白，是动物转基因技术的另一特殊形式。由于转基因动物的遗传结构发生了变化，并能稳定地遗传给后代，外源基因不仅能在转基因动物得到整合和表达，而且能获得组织特异性（乳腺组织）和发育特性（妊娠后期和泌乳期）表达，利用这一点能产生转基因泌乳家畜，还能生产出目前短缺而又十分珍贵的医用蛋白。近十年，这方面的研究在英、美、法、瑞士和荷兰等国家已相继展开，并取得了一定进展。截至目前，世界一些国家的生物技术企业在利用转基因动物作生物反应器研究开发的转基因动物药品有以下几种。组织纤溶酶原激活剂（TPA）：由美国遗传技术公司（Genentech) 用基因重组技术开发的血栓溶解剂，1987 年11 月经联邦食品及药物管理局（FDA）批准上市。1988 年的销售额为1.5 ～ 1.6 亿美元，1989年为1.8 ～ 1.9 亿美元。今后每年的市场销售额约为2 ～ 2.5 亿美元。乳铁蛋白（lactoferrin): 用转基因奶牛生产。由于以转基因奶牛生产乳铁蛋具备产量高、成本低，以及有无限量增殖生化反应器等特征，因而备受各国瞩目。乳铁蛋白是一种口服的活性蛋白，自然产生于人乳中，它具有抗菌、传递铁素等特性。人类-1 抗胰蛋白酶（AAT）：-1 抗胰蛋白酶（AAT）缺乏是最常见的遗传代谢病，能引起肺和肝的损伤。-1 抗胰蛋白酶（AAT）为呼吸系统的非特异性可溶因子，它可抑制多种酶的活性，包括细菌的酶，以及中性白细胞溶酶体分泌的蛋白质、弹性蛋白酶、胶原酶、纤维蛋白溶酶和凝血酶。这项产品是从英国农业和食品研究委员会的动物生理和遗传研究院（IAPGR）研究成果为基础，近年由英国PPL 公司与德国拜耳公司共同尝试用转基因绵羊的羊奶生产AAT。促红细胞生成素(EPO）：以转基因猪生产。这种药物存于转基因猪的血液中。目前转基因猪血球素合成的遗传控制机制已十分清楚，用基因重组技术合成的EPO 已在多个国家上市。重组人抗凝血酶ii（i atryn）：世界上第一个动物乳腺生物反映器重组蛋白药物。Atryn的主要成分-重组人抗凝血酶iii 具有抑制血液中凝血酶活性，预防和治疗急慢性血栓血塞形成，对治疗抗凝血酶缺失症有显著效果。拒美国权威机构预测，到2010年，转基因动物生产的重组蛋白产品销售额将达到350 亿美元，生产的药物将占整个基因工程药物种类的90%以上。存在的问题与发展前景转基因动物与生物反应器是20 世纪生命科学发展的一个里程碑，但现在仍然存在着许多急需解决的问题。由于转基因动物的研究在理论和技术上尚有不完善之处，使得转入的外源基因在动物基因组中随机整合、调节失控、遗传不稳定，表达率不高。要提高转基因的效率，保证外源基因的有效表达，关键是基因构建的定点整合。转基因动物生物反应器的产品的安全性问题。这包括转基因动物的产物的分离和提纯，表达产物的结构和生物活性与人体蛋白的相似性的问题。只有从表达产物除去能引起人类变态反应的非人类蛋白，并且产品与人体蛋白有足够的相似性，才能应用于人类的健康事业。转基因动物的成活率低，出生后的部分个体表现出各种生理和免疫缺陷。如为提高生产性能而制备的转基因猪出现了雌性不育、胃溃疡和关节炎等病症； 而克隆牛已经先后死去； 转基因后获得的目的性状，通过有性繁殖后，遗传性状出现分离，如英国的一只高产1-AT 羊奶的转基因绵羊，其子代羊奶中的含仅为其母亲的1/10[6]。尽管转基因动物生物反应器的研究仍面临着许多需要解决的问题，但它潜在的社会价值是无可估量的。在未来几年内，将有多种动物乳腺生物反映器重组蛋白上市，从而形成市场前景广阔和利润巨大的新生物制药行业。参考文献：[1]陈学进，曾申明，李和平.动物生物反应器[J].国外畜牧科技，1998，25⑴：39–43.[2]袁建民，胡建宏，李青旺，等.动物乳腺生物反映器研究进展[J].中国农学通报，2006,3：20–25.[3]张忠诚.动物乳腺生物反映器的原理及研究进展[J].中国奶牛，2006,4：9–12.[4]邱磊，郭葆玉.转基因动物反映器的基因构建与表达[J].国外医学，1999，22⑸：41–44.[5]孙博兴，侯万文，欧阳红生.转基因动物生物反应器[J].动物科学与动物医学，2000，3：18–20.[6]林莉，胡佐忠.转基因动物研究进展[J].畜禽业，2005,5：19–23.

1月通过“全国现代教育技术示范校”复评。·被评为“山东教育社杯”中小学电脑制作活动“最佳组织奖”。·校内园在全县幼儿园歌咏比赛中获中班、小班组第一名，并被评为全县唯一的优秀组织奖。·学校工会被市教育局、市教育工会授予“全市教育工会先进集体”。2月被评为2005年度教育工作先进单位。被授予博兴县少先队工作红旗单位。该校承担的中央教科所重点课题《小学科学新课程的开发与教育研究》结题。3月参加全县青少年科技创新竞赛，该校六件参赛作品均获一等奖。·学校计划生育工作细致有效，被县委、县府授予“2005年度人口与计划生育工作一等奖”表彰。·学校被评为“巾帼建功先进集体”，成玉丽等六位教师分获“博兴巾帼十杰”、“巾帼建功明星”、“三八红旗手”等荣誉称号。·荣获博兴县人民政府表彰的2005年度体育工作先进单位。·德州教育局组织五十余名中小学校长到该校参观学习。4月获山东省现代科技教育研究先进单位称号。·荣获山东省校本教研重点实验基地称号。·荣获2005年度教育信息宣传工作先进集体。·8日，国家、省发改委领导就学校发展情况到校调研、视察工作。·第六届体育节启动。29日，学校春季田径运动会开幕。·学校在共青团中央、中国青基会组织的希望杯全国青少年书画写作大赛中获“全国优秀组织奖”。学生10余人次分获特等奖、一、二等奖。·29日，县督导组评价该校班子成员务实、能干、创新，学校实行了精细化管理，各项规章制度齐全，文化氛围、教研气氛浓厚，干群关系融洽，教学成果丰硕，学校管理堪称一流。·该校参加全市机器人大赛获二等奖。·该校教师盖艳伟、郑海燕分别获得省优质课评比一、二等奖。5月学校被评为“市教科研工作先进单位”。·在国家教育部《幼儿园课程资源开发与教师专业成长行动研究》重点课题会议上，该校幼儿园做了典型发言并被评为课题优秀实验基地，李爱珍等六位教师被评为先进科研个人。·第七届科技艺术节启动。27日，六一儿童节公开演出暨科技艺术节闭幕。·在“博兴新苗”评选活动中，该校幼儿园一名幼儿被评为“滨州新苗”和“双十佳新苗”、17名幼儿被评为“博兴新苗”、40名幼儿被评为“吉祥三宝”，一小幼儿园荣获“奉献奖”。·该校幼儿园26名幼儿的美术作品在“滨州市幼儿创新作品绘画大赛”中荣获一、二等奖。6月该校获全市数学创新竞赛优秀组织奖。·学校获“体彩杯”博兴县全民健身活动月活动县直组优秀组织奖。·该校张家璇、戴东雪同学荣获山东省第六届齐鲁小名士称号。·该校教师侯晓霞、张伟、赵晖共同荣获县心理健康教育优质课评比一等奖。·在全省青少年才艺大赛中，该校3个节目获省级奖励、5个节目获市级奖励、10个节目获县级奖励，获奖节目等次及人次均创新高。·高桂荣校长教育思想专访在现代教育导报发表，引起强烈反响，郑杰、高锋、卢志文等知名校长纷纷撰文给予高度评价。·该校在全县综合治理和食品卫生检查中获检查组好评并在现场会上做典型发言。7月该校教师高红梅荣获全县十大杰出青年称号。8月顺利通过山东省精神文明单位复评，实现省精神文明单位6连贯。·该校教师高红梅荣获山东省年度教育创新人物班主任提名奖。黎强获滨州市创新校长称号。陈晓红获滨州市创新班主任称号。·该校幼儿园（校内园）荣获滨州市青年文明号单位。·该校参加全市英语风采大赛，28人次获奖，在全市名列前茅。·22日，该校三届三次教代会召开。出台通过了《评聘制度》、《支教制度》等一系列新制度，学校无缝隙、制度化管理体制进一步完善。9月该校孙秋生、张智勇、韩国栋、穆永强、李云霞等5位教师被评为滨州市学科带头人。·该校在全县“我讲我的故事”演讲大赛、“中华诗文诵读大赛”中荣获一等奖。·高晓莉等6位教师荣获国家级优质课一、二等奖，杨坤等7位教师获市级优质课一、二等奖。·该校荣获渤海国际杯滨州市少儿书画大赛优秀组织奖。10月该校教师高红梅荣获滨州市优秀青年知识分子、优秀青年知识分子标兵称号。穆永强等4名教师荣获县团队工作先进个人。·该校教师王磊在全省幼儿优质课评选中荣获一等奖第一名。·该校幼儿园在全县幼儿体操比赛中荣获一等奖。·第二届英语节启动。11月该校刘浩天等6名同学创县首届校园吉尼斯记录。·该校三个中队荣获全国少先队魅力中队称号。·该校三处幼儿园在全县幼儿园督导中获好评。·高桂荣校长荣获2006年度滨州市有突出贡献的专业技术人员称号。·该校申报的山东省十五规划课题《山东版课标教材与北师大课标教材的研究》通过立项。12月山东省教育厅授予该校“首批山东省语言文字规范化学校”荣誉称号。该校王轩昂等75名同学在教育部、团中央、科技部组织的“节约在我身边---科学小调查”体验活动中获奖。 ·该校教师刘培军荣获全国“十佳班主任”。·该校赵立芹、孙清华、王玉莲、李顺玉等4名教师被评为滨州市教学能手。·中国教育报刊登高桂荣校长特稿《追寻理想的教育》。·本年度，该校教师在各级各类刊物发表、获奖论文300余篇，学生700余人次在各级各类比赛中获奖。·12日，县教研室对该校进行了教学视导。该校听课优秀率居全县之首，也是唯一没有不成功课的学校。视导组用六个字概括了学校管理工作：“严谨、细致、高效”。去年以来，学校获得：第五批山东省科普示范学校2014年度事业单位绩效考核A级单位法制博兴建设先进单位博兴县巾帼文明岗博兴县五四红旗团总支博兴县青年志愿服务先进集体荣誉称号。博兴县第17届百家人物公布，周涛老师荣获“十佳科技工作者”，吴洁老师荣获“十佳教育工作者”，柳淑敏老师荣获“十佳巾帼女杰”，王翠兰老师荣获“十佳孝德之星”称号。