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状态图基础
状态图类别
在我们开始讨论状态图设计方法以前，分清楚两种常用的状态图是很重要的。状态图（StateDiagrams）和扩展状态图(StateCharts)（后者是前者的一个扩展）。这两种类型我们都将讨论。和BetterStatePro都支持这两种类型，不过，我们关注的主要是扩展状态图。
传统上，有限状态机（FSMs）和它们的图表副本、状态图用来详细说明和设计交互（子）系统。因为它具有高度可视化和直观的特性，所以被普遍接受。FSMs可以描述有限和无限序列，这一特性再加上它的可视化功能，使它成为电子工业最受欢迎的形式之一。
传统的状态图
状态图比相应的文本解决方案更易于设计、理解、修改和文档化。传统的状态图在过去几年一直没有大的变化，因此，在今天的交互系统应用中存在局限性。在本节的后面，你将发现扩展状态图弥补了这些缺陷。传统状态图的局限性包括：
传统状态图很单调，它们不适合自顶向下的设计和信息隐藏。而且，自顶向下的设计概念需要能够交互的软件，这样可以让用户通过操作和浏览复杂的设计来获取信息。
传统的有限状态机必须是完全顺序的。然而，应用程序并不是这样。现代的交互子系统（我们称它为控制器）必须能够对环境中大多数实体发出的信号进行响应。考虑一个电话应答机控制器在接第一个电话时第二个电话等待的情况。一个传统的FSM需要计算第一个和第二个打电话者所有可能的状态组合，这会导致我们通常所说的状态溢出现象。
扩展状态图
为了弥补状态图设计的这些限制，DavidHarel在他的论文“扩展状态图：解决复杂系统的可视化方法”中描述了扩展状态图。该论文发表在计算机编程科学（1987）上。在增加了层次、并行、优先级和同步等功能的同时，扩展状态图保留了有限状态图的可视化、直观等特性。
下文讨论可用于传统状态图和扩展状态图的基础设计方法。后一部分讨论的是扩展状态图特有的设计方法。
状态图符号
状态图的主要组成部分是状态和代表状态改变和转换的箭头。状态通过大量不同类型的符号图形化表示。这些符号包括圆、矩形、圆角矩形等。BetterState使用圆角矩形来表现系统状态。
系统状态
在Webster的NewWorldDictionary（新世界字典）中对“状态”的定义如下：
“在给定时间、方法和行为的情况下，与某人或某件事相关的一组环境变量或属性集”
针对山西大同大学的档次，我想说的是，山西大同大学是一所具有较高档次的大学，它在教育质量、科研水平、学术影响力等方面都有着不俗的表现。首先，山西大同大学在教育质量方面，它拥有一支经验丰富的师资队伍，拥有一套完善的教学体系，并且不断改进教学质量，以满足学生的需求。此外，学校还拥有完善的实验室设施，为学生提供了良好的实践环境，以提高学生的实践能力。其次，山西大同大学在科研水平方面，学校拥有一支科研团队，他们不断探索新的科学理论，并在实践中进行验证，以提高学校的科研水平。此外，学校还与国内外众多知名科研机构建立了良好的合作关系，以提高学校的科研水平。最后，山西大同大学在学术影响力方面，学校拥有一支优秀的师资队伍，他们不断发表论文，参加国际学术会议，以提高学校的学术影响力。此外，学校还与国内外众多知名学术机构建立了良好的合作关系，以提高学校的学术影响力。总之，山西大同大学是一所具有较高档次的大学，它在教育质量、科研水平、学术影响力等方面都有着不俗的表现。要提高学校的档次，首先要加强师资队伍的建设，提高教学质量；其次要加强科研水平，提高科研能力；最后要加强学术交流，提高学术影响力。
山西大同大学是一所综合性大学，创建于1978年，是山西省重点支持的高校之一。学校坐落于山西省大同市云冈区，校园占地面积3600余亩，教学科研设施齐全，教学楼、实验楼、图书馆、体育馆等各种设施一应俱全。学校设有文、理、工、农、医、管、法、教育等8个学院，开设有近70个本科专业，涵盖了文、理、工、农、医、教育、法律、管理等多个领域。学校具有一支高水平的师资队伍，其中教授和副教授占教师总数的70%以上，学校还与国内外多所高校、科研机构建立了良好的合作关系，积极开展学术交流和科学研究。学校注重学生的综合素质培养，实行素质教育，学生综合素质得到了全面提升，毕业生就业率高，深受用人单位的欢迎。总之，山西大同大学的教学、科研水平以及师资、校园设施都处于较高的水平，是一所拥有一定办学规模和实力的综合性大学。
江苏省宜兴宜城。谈哲敏，1965年1月出生于江苏省无锡市宜兴市，中国科学院院士，南京大学校长（副部长级）、党委副书记，南京大学大气科学学院教授、博士生导师。近年承担了科技部、教育部、国家自然科学基金委员会各类科研项目20多项，发表专著论文数十篇。先后获教育科技进步二等奖2次、江苏省科技进步二等奖1次、中国青年科技奖、江苏省青年科技奖、赵九章优秀中青年科学工作奖、高校青年教师奖、高校优秀骨干教师、全国优秀博士学位论文、江苏省优秀共产党员等奖励。
2000年在内蒙古大学生命科学院国家基地班获学士学位。2006年在中科院上海应用物理研究所获无机化学博士学位，期间主要从事与神经退行性疾病相关蛋白的纤维化机制与其纤维化核心肽段的自组装研究。曾于2006年获得中科院优秀毕业生奖，2007年获得中科院刘永龄奖学金特别奖。2006年1月到12月，留上海应用物理所同步辐射研究室工作，期间获得自然科学青年基金3年资助。从2007年1月到2011年2月，先后在德国慕尼黑大学物理系（纳米中心，博士后）、马尔堡大学物理系（生物光学组，研究组长，校方付工资）以及美国华盛顿大学（生物医学工程系，高级研究员）从事基于纳米颗粒的生物分子检测，成像及相关应用方面研究。2011年2月到6月被内蒙古大学作为学科带头人引进，获得两项国家自然科学基金项目资助。2011年6月被内蒙古农业大学作为高层次人才引进。在ACIE、Small、Langmuir、JPCB、BBRC、Nature Nanotechnology，Chemical Society Reviews等国外刊物上发表30多篇SCI论文
华东理工大学教授张峰男，1961年5月生，硕士学位、硕士生导师，上海第二工业大学理学院应用数学系教授。 二、主要研究方向： 排序论、多目标规划。 三、发表的论文： 先后在国内外发表学术论文多篇。 四、教学情况： 承担“概率论与数理统计”“高等数学”“离散数学”等课程其他同名人员，请参见：
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CRISPR/Cas系统是细菌和古菌特有的一种天然防御系统，用于抵抗病毒或外源性质粒的侵害。当外源基因入侵时，该防御系统的 CRISPR 序列会表达与入侵基因组序列相识别的 RNA，然后 CRISPR 相关酶(Cas)在序列识别处切割外源基因组DNA，从而达到防御目的。
根据Cas蛋白的特点，可将CRISPR/Cas系统分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系统需要借助复杂的蛋白复合体发挥作用，Ⅱ型系统仅借助 Cas9蛋白和sgRNA即可对靶目标进行编辑，结构简单，操作容易，因此目前主要使用Ⅱ型CRISPR/Cas9 系统。
CRISPR/Cas自诞生以来，迅速发展，已经成为生命科学领域最耀眼、最有前景的技术。尤其是近两年，在全世界科学家的共同努力下，CRISPR/Cas相关新进展新突破不断涌现。
一、基因编辑技术的发展史
基因编辑可以分为三代，第一代：ZFN；第二代：TELEN；第三代：CRISPR/Cas。这三个基因编辑技术都利用了DNA修复机制，所以我们先来了解一下DNA修复机制（ 图1 ）。[图片上传失败...(image-8dab49-1625385468208)]
图1-NHEJ修复（左），HDR修复（右）
NHEJ（Non-homologous end joining）
非同源性末端接合
NHEJ修复机制不需要任何模版，修复蛋白直接将双股裂断的DNA末端彼此拉近，在DNA连接酶的帮助下重新接合（ 图1 ）。
HDR（Homology directed repair）
同源重组修复
当细胞核内存在与损伤DNA同源的DNA片段时，HDR才能发生。
NHEJ的机制简单又不依靠模版，因而NHEJ的活性相对于HDR高出许多。但NHEJ修复出错的概率较高，容易造成移码突变等，基因编辑正是利用了这一点（ 图1 ）。
1.ZFN的识别切割机制
融合锌指模块和FokI切割结构域形成ZFN ；以二聚体的形式靶向切割每个锌指结构；特异识别3个碱基 ；组装多个锌指结构(识别12-18bp)形成的ZFN对可特异切割基因组靶点 （ 图2 ）。
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图2-ZFN基因编辑原理图
2.TALEN的识别切割机制
两个TALE靶向识别靶点两侧的序列；每个TALE融合一个FokI内切酶结构域；FokI通过TALE靶向形成二聚体切割靶点；设计灵活识别特异性强（ 图3 ）。
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图3-TELEN基因编辑原理图
3.CRISPR/Cas9的识别切割机制
crRNA通过碱基配对与 tracrRNA结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA（ 图4 ）。
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图4-CRISPR/Cas9基因编辑原理图
ZFN、TELEN、CRISPR/Cas9比较
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图5-三种基因编辑的比较
二、CRISPR/Cas技术的介绍
CRISPR/Cas9 系统的发现
1987年，在大肠杆菌的基因组中首次发现了一个特殊的重复间隔序列——CRISPR序列，随后，在其他细菌和古菌中也发现了这一特殊序列。
2005年，发现这些CRISPR序列和噬菌体的基因序列匹配度很高，说明CRISPR 可能参与了微生物的免疫防御。
2011年，CRISPR/Cas系统的分子机制被揭示：当病毒首次入侵时，细菌会将外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的间隔区；病毒二次入侵时，CRISPR 转录生成 前体crRNA (pre-crRNA)， pre-crRNA 经过加工形成含有与外源基因匹配序列的crRNA，该crRNA与病毒基因组的同源序列识别后，介导 Cas 蛋白结合并切割，从而保护自身免受入侵。
2013年，发现CRISPR/Cas9系统可高效地编辑基因组。随后张锋等使用CRISPR系统成功的在人类细胞和小鼠细胞中实现了基因编辑。
从此开始，CRISPR/Cas9技术给生命科学领域带来了巨大冲击，CRISPR/Cas9相关研究成果频频登上CNS等顶级期刊，近两年更是成为诺贝尔奖热门候选。
CRISPR/Cas技术的原理
CRISPR/Cas9系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA（trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计 crRNA 和 tracrRNA 这两种 RNA，改造成具有引导作用的sgRNA （single guide RNA ），从而引导 Cas9 对 DNA 的定点切割（图4）。
CRISPR/Cas技术的优势
设计简单，简明的碱基互补设计原则，识别不受基因组甲基化影响，能靶向几乎任意细胞任意序列，方便同时靶向多个靶点，切割效率高。
三、CRISPR/Cas的脱靶效应
PAM**** (Protospacer adjacent motif )
前间区序列邻近基序
PAM序列区是CRISPR/Cas9系统行使切割功能的基本条件。如果靶序列 3′端没有PAM序列，即使靶序列与sgRNA序列完全匹配，Cas9蛋白也不会切割该序列位点。 PAM序列主要影响CRISPR/Cas9的DNA切割效率。在细胞水平上，NGG介导的切割效率是最高的。
sgR****NA ****(Single guide RNA )
向导 RNA
sgRNA与目标基因组相结合的 20nt 序列区决定着 CRISPR/Cas 系统的靶向特异性。CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性其实主要依赖于sgRNA与靠近PAM区的10~12 bp的碱基配对，而其余远离PAM序列 8~10 bp 碱基的错配对靶位点识别的影响并不明显。目前研究结果均提示，可能靠近 PAM 的 8~14 bp 序列是决定特异性的关键，其他序列也均在不同程度上影响脱靶效应。
CRISPR/Cas9的脱靶效应给研究带来了一定程度上的不确定性，也是限制其发挥更大潜力的主要原因之一。
2017年5月30日， Nature 杂志子刊 Nature Methods 刊登了美国哥伦比亚大学研究人员的一篇文章，研究人员通过CRISPR/Cas9成功修复了导致小鼠失明的基因后，对小鼠进行全基因测序，发现修复后的小鼠基因组有超过1500个单核苷酸突变，以及超过100个位点发生大片段插入或缺失（ 图6 ）。文章的结论无疑引发了巨大震动，也给正在进行中的CRISPR/Cas9带来了不确定性。
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图6--动物体内实验中CRISPR/Cas9编辑后发生意想不到的突变
仔细分析后，发现该文章并不十分严谨，文章仅有两只小鼠作为实验组，一只作为对照组，数量不足以证明结论是否只是个例。而且单碱基突变是生物体内自然现象，不能全归于CRISPR/Cas9。整个实验只基于一个sgRNA数据，且该sgRNA特异性评分很低，造成脱靶效应也应该在预料之中（ 图7 ）。
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图7--针对 Nature Methods 文章的回应
经过一系列的研究和改进，目前CRISPR系统的脱靶性已经很低，当然，要想达到理想的状态，还有很长的路要走。
四、CRISPR/Cas技术的进展
2016年6月，张锋在 Science 发表文章，发现CRISPR/Cas13a能有切割细菌的特定RNA序列。
2016年9月，Jennifer Doudna在 Nature 发表文章，证实CRISPR/Cas13a可以用于RNA检测。
2017年2月22日，美国纪念斯隆.凯特林癌症中心（MSK）研究人员在 Nature 杂志发文，使用腺相关病毒（AAV）介导，将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于CAR-T疗法。该研究既解决了传统CAR-T疗法的随机整合可能存在的潜在危害，又大大降低了CAR-T细胞发生分化或癌化的风险，赋予了CAR-T技术全新的高效性、稳定性、安全性。
2017年8月2日，Shoukhrat Mitalipov在 Nature 发表长文，使用CRISPR/Cas9技术修正了植入子宫前的人类胚胎中一种和遗传性心脏病有关的变异。该研究证实了通过编辑人类胚胎进行治疗遗传病是安全可行的。值得一提的是，该成果受到了基因编辑领域大牛George Church等人的质疑。
2017年8月11日，杨璐菡等在 Science 发表文章，通过CRISPR/Cas9技术敲除猪基因组中的内源逆转录病毒（PERV）序列，并克隆出多只PERV失活小猪。向最终实现使用猪器官进行人体器官移植的终极目标迈进了一大步。
2017年9月，杂交水稻之父”袁隆平院士宣布使用CRISPR/Cas9技术敲除与镉吸收和积累相关基因的水稻育种成功。该研究从根本上解决了水稻镉污染的问题，将扭转我国部分农作物重金属超标的问题，进而改善部分人群重金属慢性中毒的问题。
2017年10月4日，张锋在 Nature 发表论文证实CRISPR/Cas13a能够在哺乳动物细胞中编辑特定的RNA。CRISPR/Cas13a能够达到RNAi相似的降低基因表达的效率，而且有更强的特异性，且对细胞内天然的转录后调控网络的影响更小。
2017年10月19日，Jennifer Doudna在 Nature 发表文章，设计了高精确性的Cas9变体—HypaCas9。该研究极大地降低了Cas9的脱靶效应，且不降低靶向切割效率。
2017年10月25日，张锋在 Science 发表文章介绍CRISPR新系统--REPAIR，可以高效的进行RNA的单碱基修复。因为不改变DNA序列，所以为通过基因编辑治疗遗传病而又不永久影响基因组提供了新可能。
2017年10月25日，哈佛大学Broad研究所的David Liu实验室在 Nature 发表长文，报道了新型腺嘌呤基因编辑器——ecTadA-dCas9，可以将A·T碱基对转换成G·C碱基对，该技术首次实现了不依赖DNA断裂即可进行基因编辑的技术，即单碱基基因编辑技术。该技术高于其它基因组编辑方法的效率，且几乎没有随机插入、删除或其它突变等不良副作用，因此为今后大范围治疗点突变遗传疾病提供了极大的便利。
五****、展望
近几年CRISPR/Cas基因编辑技术飞速发展，推广应用到了生物、医学、农业以及环境等多个领域，造就了一批批科研奇迹，尤其是在遗传病的治疗、疾病相关基因的筛查与检测、肿瘤治疗以及动植物的改造、病原微生物防治等领域有着巨大的潜力，也将深远地影响整个世界。
特别感谢：BioArt主编给予的帮助和意见以及吉满生物吴晨提供图1-图5的图片。
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张锋教授简介 张锋，教授，男，1961年9月23日生，理学博士。1982年辽宁大学化学系有机专业大学毕业，理学学士。1985年辽宁大学化学系无机专业博士研究生毕业，理学硕士。1998年日本名古屋大学理学部生物无机化学专业博士研究生毕业，理学博士。1985-1993年在辽宁大学化学系任教，1985-1987年任助教，1987年晋升讲师，1993年晋升副教授。1992年9月-1993年9月在北京语言学院出国部参加国家教委日语培训班并通过选拔考试。1993-1994年国家教委公派赴日留学，在日本名古屋大学理学部化学科生物无机化学研究室做访问学。1994-1998年在日本名古屋大学研究生院攻读博士学位。1998年3月获博士学位后回国。1998年3月至今在辽宁大学化学科学与工程学院任教。1999年8月晋升教授。 主攻方向：（1）配位化学-配合物的结构与溶液稳定性。研究生命相关配体和金属离子形成三元混配配合物的分子和超分子结构及其与配合物稳定性的关系，探索配体间的分子识别规律及金属离子的结构效应。（2）生物无机化学-激素分子的结构作用解析。利用金属离子的模板作用模拟研究一些激素分子如甲状腺激素、甾类激素等与受体蛋白结合的结构作用及其与激素生物活性的关系。(3)超分子化学-配合物超分子晶体的制备和结构研究。选择和设计各种受体分子，通过与金属形成配合物，利用金属离子的模版作用，构筑特殊超分子体系，研究其结构特性
张纸欲跃明我意，润笔刻君在心间。锋刀入石且三分，我心留君将胜石。爱似流年风雪月，你自妖娆我自伴。自己编的啦，可能文笔没有大师那么好，就希望能帮到你忙好了
男baby，叫赵子龙。 女baby，叫赵萱萱。
赵柏 赵军 赵鑫友 赵霖夏 赵家 赵淑一 赵玉 赵峰伟 赵安玮 赵宏 赵丹嘉 赵宜雪 赵燕赵涵 赵山 赵元永 赵诗玲 赵元 赵莲 赵江 赵灵张堋 张雁南 张企通 张林域 张力鹏 张可伟 张文彬 张晓米 张先福 张亚军 张辉 张丽华 张光凤 张祖琅 张勇智 张润锋 张勇蓄 张嘉扬
男宝宝：赵云、赵龙女宝宝：赵一诺、赵爱章
八字：辛卯 壬辰 庚子 癸未五行：金木 水土 金水 水土 年命：【松柏木】分析：缺火！忌火！喜土！日干庚金生于土月，因为土生金。有月令所生，得天独厚，首占地利， 对自身十分有利；名字中最好用土字旁汉字。多交土性朋友（和土有关）；【远离火源， 注意安全】！如果取属水的妻子，对妻子呵护有加，妻子十分依赖他，双方恩爱；如果 取属土妻子，妻子对他呵护有加，他十分依赖妻子，双方恩爱、白头到老。建议取名：张春畾；生生于春天，畾，田多土多； 张春雷；春雷一声震天响！雷，有田就有土；
出生公历：2011年4月15日14时45分(北京时间)。出生农历：辛卯年 三月 十三日 未时。乾造 辛卯 壬辰 庚子 癸未※五行个数(计入藏干)： 4死水 3囚木 1休火 2旺土 2相金 五行个数(不计藏干)： 3死水 1囚木 0休火 2旺土 2相金 五行力量：水80(25.2%) 木63(19.8%) 火9(2.8%) 土67(21.1%) 金99(31.1%) 己生助力量:166(52.2%) 克泄耗力量:152(47.8%)。 阴气:184(57.9%) 阳气:134(42.1%)。※日主综合得分：68。 日元平和，喜用土，金(印枭、比劫)。忌仇木，水(财星、食伤)。 庚金生于辰月，土旺、金相、火休、木囚、水死。 调候用神：甲、丁，干火旺用壬，支用癸。姓名评论：从您的生辰八字来看，您的名字中宜有土、金，不能有木、水，如此才能平衡先天阴阳五行禀赋，起到扶持个人命运的作用。张锋奎 80分张锋约80张锋囿80张锋垚80张峻才 80张峻册85张峻诚85张峻锋85张峻铭85张峻仟 85张峻瑞85张峻赏85张峻生85张峻示85张峻衔85张峻需85张峻养86张峻右86张峻造85张峻增86张峻占 85张峻玮86张峻瑜85张峻鑫83
张锋教授简介 张锋，教授，男，1961年9月23日生，理学博士。1982年辽宁大学化学系有机专业大学毕业，理学学士。1985年辽宁大学化学系无机专业博士研究生毕业，理学硕士。1998年日本名古屋大学理学部生物无机化学专业博士研究生毕业，理学博士。1985-1993年在辽宁大学化学系任教，1985-1987年任助教，1987年晋升讲师，1993年晋升副教授。1992年9月-1993年9月在北京语言学院出国部参加国家教委日语培训班并通过选拔考试。1993-1994年国家教委公派赴日留学，在日本名古屋大学理学部化学科生物无机化学研究室做访问学。1994-1998年在日本名古屋大学研究生院攻读博士学位。1998年3月获博士学位后回国。1998年3月至今在辽宁大学化学科学与工程学院任教。1999年8月晋升教授。 主攻方向：（1）配位化学-配合物的结构与溶液稳定性。研究生命相关配体和金属离子形成三元混配配合物的分子和超分子结构及其与配合物稳定性的关系，探索配体间的分子识别规律及金属离子的结构效应。（2）生物无机化学-激素分子的结构作用解析。利用金属离子的模板作用模拟研究一些激素分子如甲状腺激素、甾类激素等与受体蛋白结合的结构作用及其与激素生物活性的关系。(3)超分子化学-配合物超分子晶体的制备和结构研究。选择和设计各种受体分子，通过与金属形成配合物，利用金属离子的模版作用，构筑特殊超分子体系，研究其结构特性。 男，1971年5月出生，中共党员，博士研究生，副教授。专业方向为动物学。 学术经历及成就 1996年6月毕业于河北师范大学生物系生物教育专业。2000年6月毕业于河北师范大学生命科学学院动物学专业，研究方向为土壤动物学，2000年7月获硕士学位并到河北大学生命科学学院工作至今。2005年6月获动物学博士学位。 科研方向主要为动物学，包括蛛形动物分类和系统发育、区系和生态等方面的内容，目前主持河北省自然科学基金1项，主持河北大学自然科学预研基金1项，主持河北大学青年基金1项（已完成），作为第一主研人参加国家自然科学基金重大项目子项目1项，参与国家和河北省自然科学基金3项。在SCI收录期刊、国家权威核心期刊等杂志上发表论文30余篇；出版专著1部。 近年来发表论文、承担科研 项目及研究成果 著作：《中国动物志、蜘蛛目、平腹蛛科》 宋大祥，朱明生，张 锋
革命性技术“钱”景无限
2022年2月、3月间，一则 科技 界新闻被国内 科技 媒体广泛报道：美国专利和商标局（USPTO）裁定CRISPR-Cas9基因编辑技术专利属于美国哈佛和麻省理工学院博德研究所的张锋团队，而不是加州大学伯克利分校。
华人科学家张锋
CRISPR-Cas9是第三代基因编辑技术，短短几年内，风靡全球，是现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，成为当今最主流的基因编辑系统。
2012年8月17日，加州大学伯克利分校化学家詹妮弗·杜德纳和德国马普感染生物学研究所教授埃玛纽埃勒·沙尔庞捷在一篇里程碑式的论文中概述了这项技术，成功解析了CRISPR-Cas9基因编辑的工作原理，这两位女科学家因此分享了2020年的诺贝尔化学奖。
2013年2月15日，张锋团队在美国《科学》杂志发表了论文，揭示了他们首次在体外将CRISPR/Cas9基因编辑技术对小鼠和人类细胞的特定基因完成了精确的切割，意味着将该技术改进并应用于哺乳动物和人类细胞。
基因编辑三巨头
自此，近年来生命科学领域最耀眼的技术正式宣告诞生，詹妮弗·杜德纳、埃玛纽埃勒·沙尔庞捷、张锋三人，也被人们称为CRISPR基因编辑三巨头。
革命性技术的出现，背后蕴藏着巨大的商机和市场。以杜德纳和沙尔庞捷为一方，背后是加州大学伯克利分校，以张锋为另一方，背后是哈佛和麻省理工，开始争夺这块价值数百亿美元的大蛋糕。
美国科学界的华裔“天才”
张锋，1982年出生在石家庄，11岁时，随母亲离开中国来到美国爱荷华州得梅因市（DesMoines）定居。他的辉煌履历简述如下：美国麻省理工学院 历史 上最年轻的华人终身教授（比钱学森先生获得MIT终身教职时还要小一岁），麻省剑桥博德研究所（隶属于麻省理工学院和哈佛大学）最年轻的实验室主任；被《自然》杂志评选为2013年年度十大科学人物之一；2016年10月登上《时代周刊》封面，被称为“下一代领导世界的人”；是美国人文与科学学院院士和美国国家医学科学院院士。
在遗传学和神经科学领域，张锋对两种革命性技术的发展做出了重要贡献。当他还是研究生时，他是光遗传学研究团队里的关键成员之一。这项技术为最终理解大脑如何工作，如何产生意识和 情感 ，又如何在神经退行性疾病中发生故障提供了阿拉丁神灯一般的强有力工具。
仅仅几年之后，张锋做出了另一项让他跻身于世界顶尖生物学家的工作：如何快速、简便且有效地编辑植物和动物、包括人类在内的基因组。这就是大名鼎鼎的CRISPR-Cas9基因编辑技术。
这项“基因魔剪”技术关乎一切生命体，包括动物、植物、微生物的基因，因此，它的前景似乎是任由人类想象。除了利润丰厚的生物制药领域，在农业中，CRISPR就可以用于作物育种、害虫治理、特色农产品的生产等等，也可以用来生产乳制品发酵中抵御噬菌体的材料，在新冠疫情中，也有基于CRISPR的新冠病毒诊断试剂盒获批……
张锋不愧为美国科学界的华裔“天才”。
打开成功之门的“捷径”
通过美国医疗 科技 媒体STAT关于张锋的报道，我们可以一窥张锋的成长之路。
11岁时，张锋随母亲来到美国。刚从中国来到美国，他的母亲起初靠干一些粗活，比如在一个 汽车 旅馆做保洁来养家糊口--尽管她是一位计算机工程师。张锋的父亲是中国某 科技 大学的一位行政人员，有几年的时间并没有和他们一起在美国生活。
因为一场电影，张锋的人生从此开始改变。
1993年，身在美国的张锋看到了《侏罗纪公园》，在他心里种下了一颗种子，1993年，身在国内的你在做什么
在张锋生活的爱荷华州得梅因市，中学的生物课还停留在解剖泡在福尔马林里的青蛙的阶段。而张锋却幸运地参加了一个分子生物学的“周六提高计划”。那里的指导老师很聪明，他们发现，让一群孩子全心投入的一个明智选择就是给他们看电影《侏罗纪公园》。父母从事计算机科学的背景，让张锋对编程很感兴趣，而这部1993年播出的科幻电影，则在张锋的心里种下一颗种子。他意识到，一个有机体的遗传指令可以被改写，由此改变它的特性，就像父母编写计算机代码一样。
1995年，张锋得到了第一个对活体生物DNA进行编程的机会，他那时已经高中二年级的学生。学校当时有一个“天才学生项目”，负责老师问张锋是否愿意课后去学校附近的卫理公会医院一个基因治疗实验室当志愿者。张锋回忆，那时他关于现代生物学的知识几乎为零，但实验室主任约翰·利维博士并不介意他是个“小白”。
每天下午，利维博士会坐在他的休息室，一边喝茶一边在白板上板书，解释有关分子生物学的一些概念。张锋很快就学会了关键技术，并在他的热身项目中取得成功：使用病毒将水母中的绿色荧光蛋白基因移动到人的黑色素瘤细胞中，而绿色荧光蛋白是可以在黑暗中发出荧光的。
这虽然不是复活恐龙，但张锋已经在编辑一个物种的细胞。这一年剩下的时间里，张锋研究荧光蛋白能否保护DNA免受紫外辐射的伤害，这种荧光蛋白能够吸收可能致癌的紫外辐射。他发现荧光蛋白可以做到，这一实验成为张锋参加爱荷华州科学展览的项目，吸引了很多“像我这样的孩子”，张锋回忆道，“我们都是怪才（geeky）”。
高三那年，张锋在利维的指导下使用病毒做了另外一个遗传学项目，这个项目让他于2000年获得英特尔科学天才奖（Intel Science Talent Search），并获得5万美元的奖学金。
“这个项目让我滋生了治疗艾滋病的宏大想法。”张锋说。这不是一个高中生能够做到的事情，而且一个高中生也没有条件去推进荧光蛋白的工作，试验阻止紫外光能否预防黑色素瘤。但他在这个过程中学习到了宝贵的一课：有趣的科学发现往往得不出什么结果。
从张锋在高中的经历可以看出，他在中学时期，就已经开启了生物学研究的大门。而此时在他的出生地——中国，他的同龄人正在全力以赴准备高考，为应试教育的最后冲刺做着无以复加的准备。当张锋在慢慢走进科学研究大门、获得英特尔科学天才奖的时候，中国的高中生们还在日以继夜的刷题，准备着一场场模拟考试。
应试教育还是应社教育
张锋的成功带给我们的思考
张锋在基因治疗实验室当志愿者的时候，常常晚归，他的母亲需要在车子里等好几个小时。一个秋天的傍晚，夜幕逐渐降临，驱车回家的途中，他们看到落叶纷扬飘零的一幕。母子俩被眼前的景色所触动，叶子在短短几个月的时间内就会死去或处于垂死的边缘。他们聊到一个人的时间是多么有限，母亲回忆道，一个生命是多么容易就了无痕迹地从这个世界消失。
"尽我所能，有所作为，对我来说似乎很重要。"张锋说。
从张锋到目前的人生经验，特别是他移民美国至今的成绩，似乎可以对应“因我所能，有所作为”这八个字。但张锋的成功，能带给我们什么思考？
是应社教育和应试教育理念的不同。
在应试教育的理念中，决定人生命运的考试，是最重要的节点。小升初，中考，高考。 应社教育的思路，就是尽量早的找到，比如在中学阶段就找到合适个人发展的几条备选赛道，及早去接触、尝试、准备，为自己在将来进入 社会 、进入职场，无论是做公职人员、做科研或者其他职业提前准备。
再回到张锋的例子。
张锋到美国之前，接受的是国内经典的应试教育。到美国后，接受了当地的中学教育。
但他作为新移民的一员，其成长远远快于其他人。原因何在？
一个关键就是他通过学校的“天才学生项目”，获得到卫理公会医院一个基因治疗实验室当志愿者的机会。一个中学生，就这样敲开了科学研究的大门，并凭借自己的聪明才智，获得英特尔科学天才奖（Intel Science Talent Search），让他的科研之路有了新的起点。
想想张锋在国内的同学们，同样的年纪，同样的年份，那时候在干嘛。张锋在研究荧光蛋白，他们在每天上早自习、晚自习，在做试卷。张锋获得英特尔科学天才奖并获得5万美元的奖学金，早早选定自己人生道路的时候，他们在为即将到来的高考，和要报哪所学校、哪个专业挠头。当张锋进入大学、开启加速人生时，他们有的还处于刚进大学的迷茫期，有的可能因为成绩不理想而正在复读……
人生的分水岭就此产生。
考虑到每个人的天分、性格、兴趣，以及家庭教育和背景，“最”适合自己发展的人生赛道不会太多。应社教育的思路，就是在中学阶段就找到合适个人发展的几条备选赛道，及早去接触和尝试。赛道的规划，是以人的整个职业生涯来规划，而不仅仅是围绕在高考、考研、毕业求职这样的重大节点。只有早一点找到适合自己发展的道路，才能在进入 社会 和职场后，占得先发优势，并不断维持这种优势。张锋就是这种模式的经典例子。
为普通家庭的普通孩子，提供更多这样的机会，不仅是为了发掘出更多张锋式的杰出科学家，也是为了让作为普通家庭的孩子，可以在人生之路上走的更加平顺。
从简单地剪切致病基因，到开发出不再传播疾病的工程动物，基因编辑技术已经释放出巨大的潜力。随着研究的深入，科学界还发现，除了编辑具有遗传讯息的DNA片段，编辑RNA可以在不改变基因组的情况下，帮助调整基因表达方式，此外，RNA的寿命是相对短暂的，这也意味着它的变化是可以逆转的，从而避免基因工程中的巨大风险。
2017年10月，来自Broad研究所的张锋研究团队在《自然》期刊上发表了题为“RNA targeting with CRISPR-Cas13”的文章，首次将CRISPR-Cas13系统公之于众，证实了CRISPR-Cas13可以靶向哺乳动物细胞中的RNA。仅仅时隔三周，又一篇名为“RNA editing with CRISPR-Cas13”的力作发表于《科学》期刊。在该研究中，张锋研究团队再次展示了这一RNA编辑系统，能有效地对RNA中的腺嘌呤进行编辑。
在CRISPR出现之前，RNAi是调节基因表达的理想方法。但是Cas13a酶一大优势在于更强的特异性，而且这种本身来自细菌的系统对哺乳动物细胞来说，并不是内源性的，因此不太可能干扰细胞中天然的转录。相反，RNAi利用内源性机制进行基因敲除，对本身的影响较大。但CRISPR-Cas13系统还有一个重要的问题，Cas13a酶本质上是一种相对较大的蛋白质，因此很难被包装到靶组织中，这也可能成为RNA编辑技术临床应用的一大障碍。
2018年3月16日，一项发表在《细胞》期刊的重磅成果为RNA编辑技术带来一大步飞跃，来自美国Salk研究所的科学家利用全新的CRISPR家族酶扩展了RNA编辑能力，并将这个新系统命名为“CasRx”。
CasRx（品红色）在人类细胞核中靶向RNA（灰色），Salk研究所
“生物工程师就像自然界的侦探一样，在DNA模式中寻找线索来帮助解决遗传疾病。CRISPR彻底改变了基因工程，我们希望将编辑工具从DNA扩展到RNA。”研究领导者Patrick Hsu博士表示，“RNA信息是许多生物过程的关键介质。在许多疾病中，这些RNA信息失去了平衡，因此直接靶向RNA的技术将成为DNA编辑的重要补充。”
除了高效性且无明显脱靶效应，新系统的一个关键特征是其依赖于一种比以前研究中物理尺寸更小的酶。 这对RNA编辑技术至关重要，这使得该编辑工具能够更容易被包装到病毒载体，并进入细胞进行RNA编辑。来自东京大学的科学家Hiroshi Nishimasu并未参与这项研究，他表示：“在这项研究中，研究人员发现了一种较Cas13d更加‘紧凑’的酶CasRx。从基础研究到治疗应用，我认为CasRx将成为非常有用的工具。”
此外，在这项研究中，研究人员还展示了利用这种新型RNA编辑系统来纠正RNA过程的能力。他们将CasRx包装到病毒载体中，并将其递送到利用额颞叶痴呆（FTD）患者干细胞中培养的神经细胞，最终使tau蛋白水平恢复到健康水平上，有效率达到80%。
Patrick Hsu博士最后说道：“基因编辑技术通过对DNA的切割带来基因序列的改变。在经过基因编辑的细胞中，其效果是永久的。虽然基因编辑技术能够很好地将基因完全关闭，但对调节基因的表达上并不那么优秀。展望未来，这一最新工具将在RNA生物学研究中发挥重要作用，并有望在未来凭借该技术对RNA相关疾病进行治疗。”
该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默。
3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默，证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性，通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向Pscsk9的sgRNA到小鼠肝脏，有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。
同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。
近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比，Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比，Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。
此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低Pten的质粒、尾静脉注射敲低Pcsk9的AAV8病毒、眼部注射敲低Vegfa的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到Pten基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调，Pcsk9下调造成血清胆固醇下调；Vegfa下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。
2020年3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向 Pten 基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了 Pten 的高效沉默， 证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性， 通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向 Pscsk9 的sgRNA到小鼠肝脏， 有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平 。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。
同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也 探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低 Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积**，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。
近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比， Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％ ，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比， Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的 ，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。
此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性 。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低 Pten 的质粒、尾静脉注射敲低 Pcsk9 的AAV8病毒、眼部注射敲低 Vegfa 的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到 Pten 基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调， Pcsk9 下调造成血清胆固醇下调； Vegfa 下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。
图1 CasRx介导的 Pten 体内体外的下调（ Protein & Cell ）
A.质粒示意图；B.N2a细胞中 Pten 的下调；C.Western检测PTEN及AKT的表达； D.CasRx与shRNA脱靶比较；E.尾静脉注射质粒示意图；F.G.H.免疫荧光，qPCR，western分别检测 Pten 及p-AKT的表达
图2 血清胆固醇的调节以及 Pcsk9 的可逆调控（ Protein & Cell ）
A.针对 Pcsk9 的AAV8病毒注射示意图；B.肝组织中 Pcsk9 的表达量；C.血清 PCSK9 的表达量；D.血清胆固醇水平；E.F.血清ALT和AST的测定；G.可逆调节注射示意图； H. Pcsk9 的动态调控。
图3 AAV介导CasRx减少了AMD小鼠模型中CNV的面积（National Science Review）
A.小鼠和人序列比较以及sgRNA示意图；B.C.在293T和N2a细胞中敲低 Vegfa ；D.VEGFA蛋白的表达；E.AAV病毒质粒示意图；F.实验流程图；G.CasRx的mRNA表达水平；H.I.激光烧伤之前或之后7天的 Vegfa mRNA水平；J.CNV诱导3天后的VEGFA蛋白水平；K.激光烧伤7天后，用PBS或AAV-CasRx- Vegfa 注射的代表性CNV图像；L.M.CNV面积统计。
2020 年 4 月 8 日， Cell 期刊在线发表了题为 《Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice》 的研究论文，该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室 杨辉 研究组完成。
该项研究通过运用最新开发的 RNA 靶向 CRISPR 系统 CasRx 特异性地在视网膜穆勒胶质细胞中敲低 Ptbp1 基因的表达，首次在成体中实现了视神经节细胞的再生，并且恢复了永久性视力损伤模型小鼠的视力。同时，该研究还证明了这项技术可以非常高效且特异地将纹状体内的星形胶质细胞转分化成多巴胺神经元，并且基本消除了帕金森疾病的症状。该研究将为未来众多神经退行性疾病的治疗提供一个新的途径。
人类的神经系统包含成百上千种不同类型的神经元细胞。在成熟的神经系统中，神经元一般不会再生，一旦死亡，就是永久性的。神经元的死亡会导致不同的神经退行性疾病，常见的有阿尔兹海默症和帕金森症。此类疾病的病因尚不明确且没有根治的方法，因此对人类的健康造成巨大威胁。据统计，目前全球大约有 1 亿多的人患有神经退行性疾病，而且随着老龄化的加剧，神经退行性疾病患者数量也将逐渐增多。
在常见的神经性疾病中，视神经节细胞死亡导致的永久性失明和多巴胺神经元死亡导致的帕金森疾病是尤为特殊的两类，它们都是由于特殊类型的神经元死亡导致。我们之所以能看到外界绚烂多彩的世界，是因为我们的眼睛和大脑中存在一套完整的视觉通路，而连接眼睛和大脑的神经元就是视神经节细胞。
作为眼睛和大脑的唯一一座桥梁，视神经节细胞对外界的不良刺激非常敏感。研究发现很多眼疾都可以导致视神经节细胞的死亡，急性的如缺血性视网膜病，慢性的如青光眼。视神经节细胞一旦死亡就会导致永久性失明。据统计，仅青光眼致盲的人数在全球就超过一千万人。
帕金森疾病是一种常见的老年神经退行性疾病。它的发生是由于脑内黑质区域中一种叫做多巴胺神经元的死亡，从而导致黑质多巴胺神经元不能通过黑质-纹状体通路将多巴胺运输到大脑的另一个区域纹状体。目前，全球有将近一千万人患有此病，我国尤为严重，占了大约一半的病人。 如何在成体中再生出以上两种特异类型的神经元，一直是全世界众多科学家努力的方向。
该研究中，研究人员首先在体外细胞系中筛选了高效抑制 Ptbp1 表达的 gRNA，设计了特异性标记穆勒胶质细胞和在穆勒胶质细胞中表达 CasRx 的系统。所有元件以双质粒系统的形式被包装在 AAV 中并且通过视网膜下注射，特异性地在成年小鼠的穆勒胶质细胞中下调 Ptbp1 基因的表达。
大约一个月后，研究人员在视网膜视神经节细胞层发现了由穆勒胶质细胞转分化而来的视神经节细胞，并且转分化而来的视神经节细胞可以像正常的细胞那样对光刺激产生相应的电信号。
研究人员进一步发现，转分化而来的视神经节细胞可以通过视神经和大脑中正确的脑区建立功能性的联系，并且将视觉信号传输到大脑。在视神经节细胞损伤的小鼠模型中，研究人员发现转分化的视神经细胞可以让永久性视力损伤的小鼠重新建立对光的敏感性。
为进一步发掘 Ptbp1 介导的胶质细胞向神经元转分化的治疗潜能，研究人员证明了该策略还能特异性地将纹状体中的星形胶质细胞非常高效的转分化为多巴胺神经元，并且证明了转分化而来的多巴胺神经元能够展现出和黑质中多巴胺神经元相似的特性。
在行为学测试中，研究人员发现这些转分化而来的多巴胺神经元可以弥补黑质中缺失的多巴胺神经元的功能，从而将帕金森模型小鼠的运动障碍逆转到接近正常小鼠的水平。
需要指出的是，虽然科学家们在实验室里取得了重要进展，但是要将研究成果真正应用于人类疾病的治疗，还有很多工作要做：人类的视神经节细胞能否再生？帕金森患者是否能通过该方法被治愈？这些问题有待全世界的科研工作者共同努力去寻找答案。
（上）CasRx 通过靶向的降解 Ptbp1 mRNA 从而实现 Ptbp1 基因表达的下调。
（中）视网膜下注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将视网膜穆勒胶质细胞转分化为视神经节细胞，转分化而来视神经节细胞可以和正确的脑区建立功能性的联系，并且提高永久性视力损伤模型小鼠的视力。
（下）在纹状体中注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将星形胶质细胞转分化为多巴胺神经元，从而基本消除了帕金森疾病模型小鼠的运动症状。
RNA-editing Cas13 enzymes have taken the CRISPR world by storm. Like RNA interference, these enzymes can knock down RNA without altering the genome , but Cas13s have higher on-target specificity. New work from Konermann et al. and Yan et al. describes new Cas13d enzymes that average only 2.8 kb in size and are easy to package in low-capacity vectors! These small, but mighty type VI-D enzymes are the latest tools in the transcriptome engineering toolbox.
Microbial CRISPR diversity is impressive, and researchers are just beginning to tap the wealth of CRISPR possibilities. To identify Cas13d, both groups used very general bioinformatic screens that looked for a CRISPR repeat array near a putative effector nuclease. The Cas13d proteins they identified have little sequence similarity to previously identified Cas13a-c orthologs, but they do include HEPN nuclease domains characteristic of the Cas13 superfamily. Yan et al. proceeded to study orthologs from Eubacterium siraeum (EsCas13d) and Ruminococcus sp. (RspCas13d), while Konermann et al. characterized orthologs from “Anaerobic digester metagenome” (AdmCas13d) and Ruminococcus flavefaciens (nicknamed CasRx), as well as EsCas13d.
Like other Cas13 enzymes, the Cas13d orthologs described in these papers can independently process their own CRISPR arrays into guide RNAs. crRNA cleavage is retained in dCas13d and is thus HEPN-independent. These enzymes also do not require a protospacer flanking sequence, so you can target virtually any RNA sequence ! In bacteria, Cas13d-mediated cleavage promotes collateral cleavage of other RNAs. As with other Cas13s, this collateral cleavage does not occur when Cas13d is expressed in a mammalian system.
Since Cas13d is functionally similar to previously discovered Cas13 enzymes - what makes these orthologs so special? The first property is size - Cas13d enzymes have a median length of ~930aa - making them 17-26% smaller than other Cas13s and a whopping 33% smaller than Cas9! Their small size makes then easy to package in low-capacity vectors like AAV, a popular vector due to its low immunogenicity. But these studies also identified other advantages, including Cas13d-specific regulatory proteins and high targeting efficiency, both of which are described below.
The majority of Type VI-D loci contain accessory proteins with WYL domains (named for the three conserved amino acids in the domain). Yan et al. from Arbor Biotechnologies found that RspCas13d accessory protein RspWYL1 increases both targeted and collateral RNA degradation by RspCas13d. RspWYL1 also increased EsCas13d activity, indicating that WYL domain-containing proteins may be broader regulators of Cas13d activity. This property makes WYL proteins an intriguing counterpart to anti-CRISPR proteins that negatively modulate the activity of Cas enzymes, some of which are also functional in multiple species (read Arbor Biotechnologies' press release about their Cas13d deposit here ).
Not all Cas13d proteins are functional in mammalian cells, but Konermann et al. saw great results with CasRx and AdmCas13d fused to a nuclear localization signal (NLS). In a HEK293 mCherry reporter assay, CasRx and AdmCas13d produced 92% and 87% mCherry protein knockdown measured by flow cytometry, respectively. Cas13d CRISPR array processing is robust, with CasRx and either an unprocessed or processed gRNA array (22 nt spacer with 30 nt direct repeat) mediating potent knockdown. Multiplexing from the CRISPR array yielded >90% knockdown by CasRx for each of four targets, including two mRNAs and two nuclear long non-coding RNAs.
One interesting twist to Cas13d enzymes is their cleavage pattern: EsCas13d produced very similar cleavage products even when guides were tiled across a target RNA, indicating that this enzyme does not cleave at a predictable distance from the targeted region. Konermann et al. show that EsCas13d favors cleavage at uracils, but a more detailed exploration of this cleavage pattern is necessary.
Konermann et al. compared CasRx to multiple RNA regulating methods: small hairpin RNA interference, dCas9-mediated transcriptional inhibition (CRISPRi), and Cas13a/Cas13b RNA knockdown. CasRx was the clear winner with median knockdown of 96% compared to 65% for shRNA, 53% for CRISPRi, and 66-80% for other Cas13a and Cas13b effectors. Like previously characterized Cas13 enzymes, CasRx also displays very high on-target efficiency; where shRNA treatment produced 500-900 significant off-targets, CasRx displayed zero. Unlike Cas9, for which efficiency varies widely across guide RNAs, each guide tested with CasRx yielded >80% knockdown. It seems that CasRx may make it possible to target essentially any RNA in a cell.
Since catalytically dead dCasRx maintains its RNA-binding properties, Konermann et al. tested its ability to manipulate RNA species through exon skipping. Previous CRISPR exon-skipping approaches used two guide RNAs to remove a given exon from the genome, and showed success in models of muscular dystrophy . In this case, Konermann et al. targeted MAPT , the gene encoding dementia-associated tau, delivering dCasRx and a 3-spacer array targeting the MAPT exon 10 splice acceptor and two putative splice enhancers. After AAV-mediated delivery to iPS-derived cortical neurons, dCasRx-mediated exon skipping improved the ratio of pathogenic to non-pathogenic tau by nearly 50%, showing proof-of-concept for pre-clinical and clinical applications of dCasRx.
The identification of Type VI Cas13d enzymes is another win for bioinformatic data mining. As we continue to harness the natural diversity of CRISPR systems, only time will tell how large the genome and transcriptome engineering toolbox will be. It is, however, certain that the impact of CRISPR scientific sharing will continue to grow, and we at Addgene appreciate our depositors for making their tools available to the broader community.
References
Konermann, Silvana, et al. “Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.” Cell (2018) pii: S0092-8674(18)30207-1. PubMed PMID: 29551272
Yan, Winston X., et al. “Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein.” Mol Cell. (2018) pii: S1097-2765(18)30173-4. PubMed PMID: 29551514
\1. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors
\2. CRISPR genetic editing takes another big step forward, targeting RNA
\3. How Editing RNA—Not DNA—Could Cure Disease in the Future
[ https://www.obiosh.com/kyfw/zl/aav/209.html](
男，1971年5月出生，中共党员，博士研究生，副教授。专业方向为动物学。 学术经历及成就 1996年6月毕业于河北师范大学生物系生物教育专业。2000年6月毕业于河北师范大学生命科学学院动物学专业，研究方向为土壤动物学，2000年7月获硕士学位并到河北大学生命科学学院工作至今。2005年6月获动物学博士学位。 科研方向主要为动物学，包括蛛形动物分类和系统发育、区系和生态等方面的内容，目前主持河北省自然科学基金1项，主持河北大学自然科学预研基金1项，主持河北大学青年基金1项（已完成），作为第一主研人参加国家自然科学基金重大项目子项目1项，参与国家和河北省自然科学基金3项。在SCI收录期刊、国家权威核心期刊等杂志上发表论文30余篇；出版专著1部。 近年来发表论文、承担科研 项目及研究成果 著作：《中国动物志、蜘蛛目、平腹蛛科》 宋大祥，朱明生，张 锋