干扰素的应用或研究进展论文

摘要 目的：为我国爱滋病的治疗提供一些参考方法。方法:将近年来国外用干扰素治疗爱滋病的有关文献加以综述。结果:大剂量干扰素主要用来治疗爱滋病有关的卡波济氏肉瘤及淋巴瘤,小剂量的口含干扰素主要用来改善与爱滋病有关的一些临床症状。结论:在治疗爱滋病的过程中,我们也可试用干扰素的注射剂型和口含片剂作为爱滋病治疗的辅助手段。 THE APPLICATION OF INTERFERON IN TREATMENT OF AIDS ABSTRACT OBJECTIVE：Some reference methods were provided for treatment of AIDS.METHODS:The recently available information for treatment of AIDS with interferon were reviewed.RESULTS:The large doses of interferon were mainly used in treatment of Kaposi’s sarcoma and B-cell lymphomas and small doses of interferon were mainly used in relieving clinical symptoms according to literature.CONCLUSION:Interferon injection and sublingual tablets may be tried as an adjuvant agent in treatment of AIDS. KEY WORDS Interferon；AIDS;Kaposi’s sarcoma;B-cell lymphomas 我国自1985年6月发现首例爱滋病(AIDS)病例以来，其发病率近年来呈上升趋势〔1〕。因此，寻找一条治疗AIDS的有效途径就显得格外重要。国外除研制齐多夫定(AZT)，双脱氧肌苷等药物外，还在探索干扰素在治疗AIDS及其并发症中的作用机理。干扰素在我国治疗AIDS方面未见中文资料，本文的目的在于为我国AIDS的治疗提供信息资料。 有研究表明，干扰素是机体本身抗病毒的一种内源性武器，临床上使用的干扰素按来源分为α、β、γ3型，主要来源是天然和人工基因重组技术，剂型有注射剂和口含片剂2种〔2〕。其在体内发挥抗病毒作用的3个环节是：干扰素的诱生，细胞抗病毒状态的建立和其作用的表达〔3〕。研究表明：干扰素可用来治疗慢性乙型肝炎和丙型肝炎，HIV阳性患者，与AIDS有关的卡波济氏肉瘤(KS)和慢性疲劳综合征(CFS)。 AIDS即获得性免疫缺陷综合征，临床主要表现为：发热、体重减轻、食欲不振，其并发症主要有卡氏肺囊虫肺炎、弓形体病、鸟分枝杆菌综合征、KS及淋巴瘤等〔4〕。临床上治疗AIDS的方法主要有3种〔5，6〕：① 对已经被HIV病毒感染的细胞使用抗病毒药物。② 试图重组或增强机体免疫功能。③ 给予抗体或细胞毒性T细胞，在循 环系统内使病毒失活，从而阻止它造成深部感染。 截止1996年已有11个抗HIV病毒的药物批准用于治疗AIDS。目前多使用AZT或双脱氧肌苷等作为治疗药物，同时也在不断开发新的抗HIV病毒药物。但是这些药物和抗生素一样出现了HIV病毒的耐药菌株，为了解决耐药性的问题需要开发出作用机制不同的药物。由于干扰素具有抗病毒作用和增强免疫的功能，可作为治疗AIDS的辅助药物。Poli的实验表明干扰素能抑制HIV病毒在慢性感染细胞系中的表达。在英国，α干扰素已获批准治疗AIDS有关的KS。 1 大剂量干扰素治疗和AIDS有关的KS KS是AIDS的显著临床特征，是发生在HIV抗体阳性患者中最常见的肿瘤。在美国AIDS患者中KS的发生率为11%～15%，发生部位多见于下肢、躯干上部、头颈部、硬腭、喉粘膜、枕部及耳廓周围等部位。 1.1 用干扰素单独治疗 Mitsuyasu〔6〕认为，当干扰素单独使用高剂量(＞20mu/m2)时，对KS的有效率大约为30%，而低剂量时几乎无反应。通常，干扰素的用法为肌肉或皮内注射,持续2或3个月，有反应的患者剂量可调整至3次/周。用干扰素单独治疗KS最适宜的时间尚不知道，但对于一个患者来说，最少得持续2～3月才能判断是否有效〔7〕。 1.2 干扰素和AZT联合治疗 AZT为核苷类似物，是最早批准用于治疗AIDS的药物，该类药物还包括双去氧肌苷(ddI)和双去氧胞苷(ddC)〔8〕。 Ⅰ期试验提示，干扰素和AZT联合用药的最大耐受量为α干扰素9×106IU/d，加AZT100mg，q 4 h〔5〕。Fischl〔9〕对56例患者进行联合治疗，结果发现有效率为47%，平均存活期延长，而且干扰素的用量也低于单独使用时的剂量。值得一提的是：不管是单独用干扰素，还是联合治疗KS，有效率除了与干扰素的剂量有关外，还与疾病的严重程度有关。例如α干扰素不能用于CD4+淋巴细胞数＜2×108/L的患者。Rogerio等认为：CD4+淋巴细胞数＜2×108/L时，联合治疗KS，缩小后也易复发。 两者联合最常见的副作用是中性粒细胞减少，肝功能丧失，体重减轻等。 1.3 干扰素和化学疗法联合治疗 干扰素和化学疗法联合使用，并不能提高疗效，反而使副作用加重〔8〕。Gill等报告的21例患者用阿霉素、博来霉素和长春新碱治疗，有反应的患者再使用干扰素，结果仅有2例患者对干扰素的治疗有效。在加拿大进行的一项研究中，用干扰素联合化疗，发现85%的患者因KS的加重而死亡。因此，不管是两者联合治疗或是化疗之后再用干扰素治疗都是不可取的。 2 大剂量干扰素和丙种球蛋白联合治疗恶性B细胞淋巴瘤 与AIDS有关的淋巴瘤发生率大约为15%，该病预后不好，平均存活时间为4～7月。Shapiro用α干扰素和丙种球蛋白联合治疗5例患有恶性B细胞淋巴瘤的患者，7 d内取得了满意的疗效。Bergmann等〔10〕也用同样的方法治疗了5例HIV阳性患者的恶性B细胞淋巴瘤，干扰素的用法为3×106IU/d，im，用1周，然后改为3次/周，丙种球蛋白的用法为每2周1次，400mg/kg。3～6个月后，3例患者有不同程度的缓解，其中1例患者治疗后不久又复发，但发现其存活时间有所延长。其确切疗效有待进一步临床试验。 大剂量注射用干扰素的副作用与AIDS相关的并发症相似，包括寒颤、发热、肌痛、中枢神经系统症状、极度疲倦和白细胞减少等。 3 低剂量口含干扰素治疗AIDS 有研究发现，口腔粘膜存在有干扰素受体，舌下含化干扰素可激活并提高IFN的治疗作用，而且不被消化道的各种酶所破坏，使患者容易接受。基于这种原理国外已将口含的干扰素试用于AIDS的治疗，并取得了一定的疗效。Obel等〔11〕将32例危重患者随机分为2组，每组16人，其中16例接受口含干扰素的治疗，16例仅采用支持疗法，结果治疗组中有14例患者在入院2～4周病情稳定的情况下出院，其余2例患者在入院18～42 d后死亡，对照组均在入院4周后死亡。这些结果表明口含干扰素对危重患者有帮助。Koec h等〔12〕用低剂量(2IU/kg)的口含干扰素对40例患者进行治疗，其中38例患者有症状，2例无症状，同时为了增加吸收，用麦芽糖将药品包裹，用法为qd。结果表明患者CD4+淋巴细胞数增加，体重增加，HIV感染有关的症状减轻。 Jordan〔13〕用口含干扰素治疗HIV阳性的患者，150IU/d，12个月后，CD4+淋巴细胞平均增加了14%。Val等介绍了1位进行过开胸外科手术的患者，因输血感染了HIV病毒，口含低剂量干扰素2～4 iU/(kg*d)，坚持11个月，期间没有进行其他治疗，11个月后，该患者体重增加，口腔溃疡消失，CD4+淋巴细胞计数为2.1×108～2.5×108/L。Koech〔14〕也证明HIV阳性的患者，口含α干扰素后，症状有显著改善，而且有20%的患者血清中HIV抗体转阴。Dolei也建议AIDS患者口含低剂量干扰素比大剂量效果好。Hulton〔15〕将HIV阳性的患者随机分为低剂量组(50IU)和高剂量组(100IU)，给患者口含干扰素，4～8周后，观察其CD4+淋巴细胞计数、B微球蛋白、体重等，未发现任何变化，同时也未发现任何不良反应，估计与用量过小，疗程太短有关。对口含干扰素治疗AIDS的作用机理和疗效评价值得进一步研究。 综上所述，大剂量注射用干扰素对AIDS有关的KS有一定的疗效，但是副作用较大，且副作用的表现与AIDS的一些临床症状较相似，两者不容易区分。目前为减少干扰素的注射次数，降低不良反应的发生率，减轻患者的痛苦，国外已研制出干扰素的长效制剂，即将干扰素吸收于发育不全的胶原之中，再包入缓释衣内供皮下注射，每周只需给药1次。也可使用亲淋巴给药法，先在上臂束上测血压用的缚带，将干扰素注射在前臂皮下，然后充气加压，促使药液趋向淋巴系统。口含干扰素对改善AIDS患者的一些临床症状有一定的疗效，且副作用小，费用低，服用方便，易被患者接受。

基因工程制药------浅谈摘要： 主要介绍基因工程的概念、基因工程技术开发药物的一般过程及基因工程药物，同时探讨了今后利用基因工程技术进行药物开发、研究的发展方向。正文：1 基因工程概述所谓的基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持续稳定地繁殖。基因工程的第一个重要特征是跨越天然物种屏障的能力，即把来自任何一种生物的基因放置在与其毫无亲缘关系的新寄主生物细胞中去的能力。这表明人们有可能按照主观愿望创造出自然界中不存在的新物种。第二个特征是，它强调了一种确定的DNA小片段在新寄主细胞中进行扩增的事实．才能制备到大是纯化的DNA片断，从而拓宽了分子生物学的领域，使之在生物制药领域有巨大的应用。基因工程自从20世纪70年代初期问世以来，无论是在基础理论研究领域，还是在生产实际应用方面．都已经取得了惊人的成绩。基因组核苷酸全序列的测定与分析，是基因工程技术促进基础生物学研究的一个出色范例。2001年2月12 日，由6国的科学家共同参与的国际人类基因组公布了人类基因组图谱及初步分析结果，这结果为人们提供了约3000 多个基因可用来制药，将推进基因制药产业的快速发展。由于基因克隆技术的发展，已使得基因工程技术在工业生产尤其是制药生产中发挥了重要作用。以前人们利用微生物自身生产有用的产品，如利用青霉菌生产青霉素、利用链霉菌生产链霉素等。但是从这些生物体中分离纯化这些药物，不仅成本昂贵，而且技术上也相当困难。如今将编码这些药物的基因克隆并转移到合适的生物体内进行有效的表达，就可以方便地提取到大量的有用药物。2 基因工程技术开发药物的一般过程利用基因工程技术开发一个药物，一般要经过以下几个步骤：①目的基因片断的获得：可以通过化学合成的方法来合成已知核苷酸序列的DNA片段；也可以通过从生物组织细胞中提取分离得到，对于真核生物则需要建立cDNA文库。 ②将获得的目的基因片断扩增后与适当的载体连接后，再导入适当的表达系统。③在适宜的培养条件下，使目的基因在表达系统中大量表达目的药物。④将目的药物提取、分离、纯化，然后制成相应的制剂。以上方法大部分是以微生物或组织细胞作为表达系统．通过微生物发酵或组织细胞培养来进行药物生产。近年来，通过转基因动物来进行药物生产的"生物药厂"成为目前转基因动物研究的最活跃的领域，也是基因工程制药中最富有诱人前景的行业。转基因动物制药具有生产成本低、投资周期短、表达量高、与天然产物完全一致、容易分离纯化等优势，尤其是适合于一些用量大、结构复杂的血液因子，如人血红蛋白（Hb）、人血白蛋白（HSA）、蛋白C（Protein C）等。英国的爱丁堡制药公司通过转基因羊生产α1-抗胰蛋白酶（α1-AAT）用于治疗肺气肿，每升羊奶中产16g AAT，占奶蛋白含量的 30%，估计每只泌乳期母羊可产70g AAT。另外，转基因植物制药比转基因动物制药更为安全，因为后者有可能污染人类的病原体。目前，已经开发出许多转基因植物药物，例如脑啡肽、α-干扰素和人血清蛋白，以及两种最昂贵的药物即葡萄糖脑苷脂酶和粒细胞-巨噬细胞群集落因子等。3 基因工程药物基因工程药物自20世纪70年代末期以来，有了飞跃的发展。1978年首次通过大肠杆菌生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素，1980年美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以获得专利．1982年第一个由基因工程菌生产的药物--胰岛素．在美国和英国获准使用以来，各种基因工程药物犹如雨后春笋，得到了蓬勃发展。我国的医药技术的研发和产业化也取得了长足的进展。（1） 抗生素类 传统的抗生素生产，主要利用化学合成或微生物发酵来获得，其生产过程中菌种的表达水平比较低，生产成本比较高，而且在使用过程中容易产生耐药菌群。而利用基因工程技术可以对生产菌种进行基因改造，得到表达水平高、产品目的性强的菌株，如大肠杆菌生产青霉素酞胺酶。德国一个科研小组对生产半合成青霉素的材料6APA．用基因工程来增强大肠杆菌的青霉素酰胺酶活性。将大肠杆菌的基因 PBR322的质粒克隆化所形成的菌株，其酶活力比原株提高 50倍．从而提高6APA生产能力。我国王以光利用基因重组技术对螺旋霉素产生菌进行改造，增强了丙酰基转移酶的基因在螺旋霉素产生菌中的表达，并提高了丙酰螺旋霉素的产量。（2） 活性多肽类 在人体中存在一系列含量较低，但生理活性很高，而且在人体代谢过程中起着重要的调节作用的活性多肽类物质如激素等，这些物质在临床上可以作为药物来治疗相应的因此类物质失衡而造成的疾病。此类药物的制剂多来源于各种动物的脏器，生产方法复杂，成本高，个别产品还必须从动物的尸体中进行提取，无法进行大规模工业化生产，自基因工程技术问世以来，通过基因重组技术，可以由微生动进行生产，这是基因工程技术的最大成就之一，以下是这类药物中比较典型的两个。胰岛素： Genentech公司在1978年，由Goeddel等学者应用基因重组技术开发出使用大肠杆菌生产人胰岛素。随着基因工程技术的不断发展，生产胰岛素的工艺和技术也不断得到完善，在临床上已经完全取代了由动物脏器提取得到的产品。目前，我国新疆转基因羊已能够成功表达人胰岛素原，为胰岛素的生产开发了新途径。生长素： 人类生长素临床用于治疗侏儒症和肌肉萎缩症．传统制造方法是由人脑下垂体抽提精制而得，其原料来源困难，产量受到极大限制。全世界侏儒症患者中仅有1%可以得到治疗，原因是生长素价格极其昂贵，达每克5000美元。1979年Genentech公司由Goeddel等学者应用基因重组技术首先开发出使用大肠杆菌生产人生长素．近年来还开发了以酵母菌来生产生长素，其产量可达到1.4×106～4.7× 106分子/细胞。目前，我国基因工程人生长素已研制成功，并投入市场和用于临床使用。除上述药物外，运用基因工程技术生产的这类药物还有神经生长因子（PDGH）、人基底成纤维细胞生长因子、绒毛膜促性腺激素等。（3） 细胞免疫调节因子 基因工程技术用于细胞免疫调节因子的产品较多，临床广泛应用于抗肿瘤和免疫调节等。近年来，由于基因重组和细胞融合两大技术的进步，加上高压液相层析技术、氨基酸序列分拆装置以及蛋白质的精制和解析技术的改进，使一些调节细胞免疫活性物质的研究和开发得到快速发展，如干扰素（INF）、白介素（IL）、集落刺激因子（CSF）和肿瘤坏死因子（TNF）等。干扰素是其中研究较为广泛，技术比较成熟，产业化较早的一个产品。第一代干扰素是从血液中进行提取而得到。据芬兰的K Canted报道，处理23000L血液，所得纯度1%以下的干扰素不足100mg．所以产量很低。而且由于血源质量不能保证，可能造成血源性传染病的传播。第二代干扰素是采用基因工程技术进行生产的，其生产水平可达250000分子/细胞，每升可含2.5亿单位，成本显著下降，产品纯度很高，含量可达90%以上。目前，已经商品化的基因工程干扰素有α、 β、γ三种，而且生产技术也在不断完善。俄罗斯科学家构建了以假单胞菌为载体的表达系统来生产基因工程干扰素．与传统的大肠杆菌表达系统相比其培养周期短，细胞易于破碎便于提取。随着基因重组技术的不断发展，一些研究人员对干扰素基因进行改造，构建靶向干扰素基因及表达载体。夏小兵等利用限制性内切酶分别从含有抗乙型肝炎S抗原（HbSAg）人源单链抗体与人干扰素α质粒中切出目的基因，连接到 pET22b质粒中，构建成单链抗体靶向干扰素表达载体，在大肠杆菌中表达成功。（4） 疫苗传统的疫苗是病源微生物的减毒或灭活物质，但这些疫苗都不理想，有可能发生回复突变，恢复毒性；或者因为灭活不适当引起疾病流行。利用基因工程技术生产的新型疫苗，可以克服传统疫苗价格昂贵、安全性能差等缺点，能为目前尚无有效疫苗的某些特殊疾病如艾滋病，提供有效的治疗手段。第一个商品化的基因工程疫苗是抗人乙型肝炎病毒（HBV）的疫苗。我国大约有10% 的人口受到HBV的侵害， HBV的感染通常还与特殊的肝癌（HCC）有着密切的关系，每年全世界死于HCC的病人有30万左右。HBV具有高度的寄主专一性，只能感染人类和黑猩猩，这意味着只能从肝炎患者身上才能获得有限数量的病毒，供做疫苗使用，而且从患者血液中提取制备的疫苗，还有传染艾滋病的可能。利用基因工程技术生产的抗HBV疫苗克服了传统疫苗的缺点，质量和安全性高，用量极少，一般剂量为10mg以下，接种3次，为普通药品用量的千分之一。1982年P Valenzuela等人将S基因（HBV表面抗原基因）的一个片段克隆在一种载体上，结果在酵母中合成出来HBV表面抗原（HbsAg）颗粒，其产量达25 μg/L，酵母表达系统现在已经能够大规模生产供给人类使用的重组肝炎疫苗。大约20年前，人们发现"裸露"DNA注入体内能够诱发免疫反应，科学家们进行了大量研究，开发出了新型的核酸疫苗。所谓核酸疫苗，是指将编码某种抗原蛋白的外源基因（DNA或RNA）直接转移到动物体内，通过宿主表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主对该抗原蛋白产生免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。现已开发出多种核酸疫苗，例如：流感核酸疫苗、艾滋病疫苗、狂犬病疫苗、结核病疫苗和乙型肝炎疫苗和戊肝疫苗等。（5） 基因治疗制品 基因治疗在1990年开始进行实验， 1993年美国FDA给人类基因治疗下的定义为："基于对活性细胞遗传物质的改变而进行的医学治疗，这种改变可以在活体外进行，然后应用于人体，或者直接在人体内进行"。因此，基因治疗存在两种方式，即间接体内法和体内法。间接体内法主要是通过在体外进行基因转移，筛选可表达外源基因的细胞，然后再转移到体内；体内法则是直接在体内改变与修复遗传物质。随着分子生物学、基因重组技术的发展，有关目的基因的获得方法已趋成熟，但是，目的基因的转移传递系统、目的基因的表达调控以及疗效和安全性还需进一步研究证实。目前，基因转移系统主要是两类：一类是由病毒介导的基因转移系统，主要包括逆转录病毒（Rt）、腺病毒（Ad）、疱疹病毒（HSV）和腺病毒相关病毒（AAV）载体等。Nnldini等开发出一种基于HIV的重组Rt载体，不需要辅助细胞，能广泛感染各种非分裂细胞，同时保留了能整合在宿主染色体上的特点。世界上第一例基因治疗所采用的载体即是Rt载体，治疗腺苷酸脱羧酶缺乏所致的严重联合免疫缺乏症（ADA-SCID）。另外一类是非病毒介导的基因转移系统，包括脂质体、分子偶联载体、基因枪和裸DNA等。另外，反义核苷酸技术也应用于基因治疗，尤其在抗乙肝病毒的基因治疗方面，包括反义DNA、反义RNA和核酶 RNA等。2001年，Robaczewska等首次通过静脉给予反义 DNA，选择性抑制北京鸭HBV在鸭肝脏中的复制和表达，证明了反义DNA在动物实验中的有效性。美国Viagene公司研究出一种被称为"艾滋病毒免疫制剂"，该药为一种鼠逆病毒与核心蛋白编码的基因序列和HIV表面抗原RNA结合产物，在小鼠和灵长类动物试验中确定该药能诱导出强的 HIV-特异性杀伤细胞。4 结束语基因工程技术使药品开发发生了根本性的转变。传统的药品开发方式是在大量的化学合成物质和微生物代谢产物中进行随机筛选，得到其中的有效成分作为新的药物。采用基因工程技术开发新药，是通过对致病机理的研究，找到那些可用于治疗目的的有效成分以及其编码基因，经过基因重组将其转入适当的载体，大量表达其有效成分作为治疗药物。同时，基因工程技术给药品生产技术带来了革命性变化。过去一些生产困难的产品，如激素、酶、抗体等一些生物活性物质，通过基因工程手段可以高质量、高收率地付诸生产，同时生产成本也大幅度降低，提高了患者的用药水平和生活质量。基因工程技术在传统医药不能有效治疗的一些疾病，如癌症、艾滋病、遗传病等的诊断、治疗和预防等方面提供了有效的新手段，并取得了一些重大的突破。如发现了致癌基因，可使癌症的早期诊断和治疗药物的开发成为可能。随着分子生物学和基因重组技术的发展，我们相信这些严重危害人类生命的疾病，在不久的将来会得到有效的预防和治疗。