慢病毒颗粒包装研究论文

1.个人对CRISPR-Cas9筛选的理解： CRISPR-Cas9筛选 ：使用阴性筛选，阳性筛选和对照筛选，以文章中使用全基因组gRNA文库筛选使黑色素瘤对细胞毒性T细胞介导的杀伤具有抗性的基因为例。用具有对内源性鼠科抗体相对低TCR亲和力的Pmel-1 T细胞作为阴性筛选，高亲和力的OT-I T细胞作为阳性筛选，不相关特异性T细胞作为对照组。CRISPR-Cas9编辑之后的细胞系与T细胞（Pmel-1 T细胞，OT-I T细胞和不相关特异性T细胞）共培养。 阳性筛选： 若CRISPR-Cas9编辑敲除了使肿瘤对T细胞介导的细胞毒性敏感的基因（简称敏感性基因），则与T细胞共培养的肿瘤细胞就不会被杀死，提取去除T细胞后再生细胞的基因组DNA，对具有代表性的gRNA进行Illumina测序，阳性筛选中测序得到的gRNA与对照组相比，剩余的gRNA（富集gRNA）使用 MaGeCK等生物信息学软件分析可以找到与gRNA对应的基因。该基因即为被CRISPR-Cas9编辑敲除掉的基因，且该基因使肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒性杀伤敏感，其被敲掉后使肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒性杀伤具有抗性而存活了下来。 阴性筛选 ：若CRISPR-Cas9编辑敲除了使肿瘤对细胞毒性T细胞介导的杀伤具有抗性的基因（简称抗性基因），则肿瘤细胞与T细胞共培养后，由于抗性基因被敲除而能够被细胞毒性T细胞杀死，去除T细胞再生的细胞的gRNA经Illumina测序后与对照组细胞相比，缺少的gRNA即为所筛选的gRNA（消耗gRNA）,测序得到的gRNA并非目的gRNA，因为测序得到的gRNA为去除细胞毒性T细胞后再生细胞（对细胞毒性T细胞具有抗性的肿瘤细胞）的gRNA。同样通过 MaGeCK等生物信息学软件分析可以找到与gRNA对应的基因，该基因使肿瘤细胞对细胞毒性T细胞介导的杀死具有抗性。参考材料：李欢欢, 黄承浩. 基于CRISPR-Cas9的功能基因筛选研究进展[J]. 生物工程学报, 2018, 34(4): 461-472. 2.慢病毒包装的学习笔记 ： 慢病毒包装为什么要用这么多个质粒？因为需要携带有荧光标记的目的基因的质粒及包装质粒，包装质粒提供编码病毒外壳的质粒，编码包膜蛋白的质粒，和编码聚合酶的质粒。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 3.文献： Pan D , Kobayashi A , Jiang P , et al. A major chromatin regulator determines resistance of tumor cells to T cell–mediated killing[J].Science, 2018:eaao1710. 下面是我自己简要概括该文章的大概思路 思路： 使用CRISPR-Cas9筛选出基因，pathway分析基因所属于的通路，分析得到很多使肿瘤细胞中对细胞毒性T细胞介导的杀伤具有抗性基因和通路。选择其中的一条通路（PBAF复合物）在黑色素瘤与细胞毒性T细胞介导的杀伤的关系。因此构建了编码PBAF复合物三个特殊组份的基因单独缺失的细胞系。 首先分析PBAF复合物与肿瘤免疫的临床相关性，并得出编码PBAF复合物特殊组份的ARID2和PBRM1基因影响多种人类癌症中的肿瘤免疫。那么它使如何影响肿瘤免疫的呢？该研究通过研究PBAF复合物与免疫检查点阻断疗法的相关性证明了PBAF复合物的Pbrm1基因失活不仅使肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒性敏感，而且还导致更有利的肿瘤微环境。既然该复合物的功能缺失使肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒性敏感，那么它如何起作用的呢？通过什么途径呢？因此该研究证明了PBAF复合物的Arid2和Pbrm1突变细胞中许多代谢途径的mRNA一致地下调，特别是与mTORC1活性和胆固醇体内平衡相关的基因集，而且PBAF复合物的Arid2和Pbrm1基因通过抑制应答IFNγ基因的表达来减弱B16F10肿瘤细胞对IFNγ的应答能力，因此PBAF通过调控IFNγ和mTORC1通路使肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒性产生抗性。而IFNγ是肿瘤细胞和T细胞相互作用的关键细胞因子，mTORC1也是CRISPR / Cas9筛选的T细胞介导的细胞毒性的主要抗性通路。知道PBAF通过什么途径使肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒性产生抗性后，该研究又进一步选择了这两条途径中的IFNγ途径来研究其分子机制，由于PBAF为染色质重塑复合物，并且上文中证明了Arid2和Pbrm1基因能够抑制应答IFNγ基因的表达，那么PBAF复合物是否使通过影响染色质的可接近性调控应答IFNγ基因的转录因子的结合而调节基因的表达。结果证明了Pbrm1的失活增强了染色质对许多IFNγ诱导基因的启动子/增强子的转录因子的可接近性。 最后得出结论：对细胞毒性T细胞介导的杀伤具有抗性受肿瘤细胞中许多基因和通路调控，相应的基因产物可以代表免疫疗法的靶标，因为失活突变使肿瘤细胞对T细胞介导的攻击敏感。PBAF功能缺失增加肿瘤细胞对γ-干扰素的敏感性，导致招募T细胞效应因子的趋化因子分泌增强。当Pbrm1失活时，抗肿瘤治疗对免疫疗法变得敏感。在许多人类肿瘤中，PBRM1和ARID2的表达与T细胞细胞毒性作用基因的表达成负相关，鼠科黑色素瘤的Pbrm1缺失后被T细胞细胞毒性浸润更强烈。

慢病毒（Lentivirus） 载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。特点：1、区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，常用于感染难转染的细胞，如原代细胞、神经元细胞、干细胞、不分化细胞、心肌细胞、肝细胞、内皮细胞、肿瘤细胞，且效率近100%2、可装载DNA片段容量高达5kb3、目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，形成稳定遗传物质，使得目的基因在细胞中可稳定长期表达。4、病毒载体颗粒通过包装元件和含病毒基因组质粒共转染包装细胞系。利用逆转录机制构建自我失活(SIV)的HIV-1来源的载体,一旦转移到靶细胞后,它就丧失了病毒长末端重复的转录能力,减少了产生重组病毒的机会,并避免了与启动子干扰的问题。5、目前比较广泛采用的第三代包装系统——四质粒系统只含有HIV-1共9个基因中的3个，即gag、pol、rev。由于HIV-1基因组成分中60 %被去除,因此父代病毒无法复制，是目前重组系数最低的一个慢病毒包装系统，至今未见重组报道。其更安全、更稳定、更高效的技术优势领先于市场上的三质粒及其他包装系统。综上特点决定了其应用、意义：1、用慢病毒载体携带目的基因比用质粒瞬时转染更适于稳转株构建。2、载体带有可进行高效率的包装、转染并稳定整合进靶细胞的基因组中的序列元件，其产生滴度更高，为活体动物模型实验提供高性价比的包含目的基因的病毒液。3、其高转导效率及整合到基因组的特点为RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。作为快速有效的遗传物质投递工具，慢病毒在国内已广泛流行，更有众多包装服务公司兴起。同时，克服了对病毒的恐惧心理而选择自己包装的研究者也陆续增加。外包服务和DIY（Do It Yourself）相比，后者成本会大大降低。仅需买一个包装试剂盒、构建一个慢病毒载体即可进行实验。GeneCopoeia公司提供了一款基于第三代包装系统的包装试剂盒。试剂盒中包含除慢病毒基础载体和包装细胞外的其他所有成分：包装辅助质粒混合物，滴度增强剂，慢病毒专用转染试剂（EndoFectin Lenti），eGFP阳性对照质粒。慢病毒包装实验步骤与注意事项： 材料准备：包装试剂盒、病毒质粒、细胞；（注意事项：包装试剂盒的使用遵照说明书。检测病毒质粒浓度，确保DNA的OD(260nm/280nm)处于1.8-2.0之间，并电泳检测质粒是否完整。包装实验前准备好细胞，保证细胞状态良好。） 制备DNA/转染试剂复合物：此步骤比较简单，仅需按照试剂盒说明书操作。 转染工具细胞：通常使用293Ta细胞，将DNA-Endofectin Lenti复合物加入到装有包装细胞的培养板中。在37℃、CO2环境下过夜培养（8-14小时），谨记培养6小时更换一次培养基，加入滴度增强剂TiterBoost，可增强滴度5-10倍。 收获病毒：收集转染48小时后的培养液，500 *g离心10分钟，去除细胞碎片杂质。接着用0.45 μm的聚醚砜蛋白结合过滤膜去除蛋白等杂质。收获纯度较高的病毒。 检测滴度。