jc1流式检测论文

1）原理：JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm 的理想荧光探针。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生橙色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。（2）材料与仪器JC-1购自Sigma公司，分子量652.23，用DMSO溶解，储存浓度为5 mg/ml，终浓度稀释成10 µg/ml; 荧光显微镜，多功能荧光酶标仪（3）步骤① 接种细胞：96孔板，接种细胞数为每孔1.5万；或内置盖玻片的24孔板，每孔细胞数为9万。② 处理：接种24小时后用有糖earle’s 液洗两遍, 给予相应处理（氧化应激或药物）。③ JC-1孵育：用有糖earle’s 液洗1遍，并换上终浓度为10µg/ml JC-1培养箱孵育20 min.④ 检测：用有糖earle’s 液洗2遍，盖玻片可在荧光显微镜下检测荧光变化，96孔板在多功能荧光酶标仪检测荧光值，检测JC-1单体时激发光设置为488nm，发射光设置为530nm；检测JC-1聚合物时，激发光设置为529nm，发射光设置为590nm（4）注意点稀释JC-1时要迅速，否则易聚集，不易溶解；建议用碧云天的JC-1线粒体膜电位检测试剂盒。

博凌科为生物科技-为你解答：线粒体膜电位的降低是凋亡的一个早期事件，5,5,6,6-tetrachloro-1,1,3,3-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1)可用于流式细胞术检测线粒体膜电位的变化。正常细胞的线粒体膜电位电压较高，可形成JC-1的聚集体，发出红色荧光，而线粒体膜电位降低的细胞，则会形成JC-1单体，发出绿色荧光。材料： 细胞悬液 完全细胞培养基 去极化药物：如0.1mM valinomycin或0.25mM carbonyl cyanide m-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) in DMSO 1mg/ml JC-1储存液（溶于DMSO），分装成小包装，在－20℃可保存1年。 PBS 具有488nm激发光源的流式细胞仪，配备525－590nm带宽的滤镜。JC-1染色： 收集2105的细胞，用预温到37℃的新鲜完全培养基调整至1ml。制备阳性对照（以去极化药物处理过的细胞）。标本和阳性对照的染色步骤相同。 融化1管JC-1储存液，每1ml细胞悬液中通过边振荡边加的方式加入2.5L（终浓度：2.5ug/ml）。振荡细胞悬液直至标本形成均一的红紫色。 JC-1在水相容易形成聚集体，所以需要边振荡边加。未用完的JC-1不要再保存至－20℃。 37℃避光保存10分钟。 加入2ml PBS至细胞悬液中，500g室温离心5分钟，去上清。 以0.3ml PBS重悬细胞。上机取样，注意获取细胞的速度不要250至300细胞/秒。Fig1 HL-60 cells, (A) control and (B) depolarized (treated with 100 nM valinomycin), stained with 2.5 g/ml JC-1. Note the shift to the bottom and to the right by cells with depolarized mitochondria.Fig2 After incubation with 2.5 g/ml JC-1 at 37C, peripheral blood mononulear cells usually show a single population of monocytes, while here lymphocytes give rise to two separate peaks. This could indicate the presence of a functional heterogeneity within lymphocytes (A). Such a phenomenon, however, is not always present. Treating cells with valinomycin results in a loss of orange signal either from lymphocytes or from monocytes (B).

JC-1样品分析方案

概述

用测试化合物制备细胞

添加JC-1工作溶液（100μL/孔用于96孔板或25μL/孔用于384孔板）在室温或37℃孵育1小时

移除JC-1工作溶液

读取 Ex / Em = 490 / 525nm和490 / 590nm处的荧光强度

注意：以下是我们推荐的活细胞方案。 该方案仅提供指南，实际情况应根据您的具体需求进行修改。

1.准备JC-1工作解决方案：

1.1在高质量无水DMSO中制备2至10 mM JC-1的储备液。 应及时使用原液; 应将任何剩余的溶液等分并在<-20℃冷冻。

注意：避免反复冻融循环，避免光照。

1.2制备1X JC-1工作溶液：在实验当天，将JC-1固体溶解在DMSO中或将等分试样的JC-1储备溶液解冻至室温。 在Hanks和20 mM Hepes缓冲液（HHBS）或您选择的缓冲液（pH 7）和0.02％Pluronic®F-127中制备10至30μM1XJC-1工作溶液。 通过votexing很好地混合它们。

注意：JC-1不溶于水，因此它会在溶液中聚集。 建议在将JC-1工作溶液加载到池中之前对其进行过滤。

2.用荧光酶标仪进行JC-1检测：

2.1用测试化合物细胞培养所需的一段时间（例如，Jurkat细胞可以用喜树碱处理4-6小时）以诱导细胞凋亡。对于空白孔（没有细胞的培养基），加入相应量的化合物缓冲液。

2.2将100μL/孔/ 96孔板或25μL/孔/ 384孔板的JC-1工作溶液（来自步骤1.2）加入到细胞板中。

2.3将JC-1装载板在37℃，5％CO2培养箱中培养15-60分钟。

注意：适当的孵育时间取决于所使用的单个细胞类型和细胞浓度。 优化每个实验的孵育时间。

2.4从平板上取下JC-1工作溶液，用HHBS或您选择的缓冲液清洗细胞。 将100μL/孔/ 96孔板或25μL/孔/ 384孔HHBS板加回到细胞板中。

2.5监测Ex / Em = 490 / 525nm和490 / 590nm处的荧光变化以进行比率分析。

3.用荧光显微镜或流式细胞仪进行JC-1测定：

3.1用测试化合物细胞培养所需的一段时间（例如，Jurkat细胞可以用喜树碱处理4-6小时）以诱导细胞凋亡。

3.2离心细胞，每管取1-5×105个细胞。

3.3在500μLJC-1工作溶液中重悬细胞（来自步骤1.2）。

3.4在室温或37°C下孵育10至30分钟，避光。

3.5用您选择的HHBS或缓冲液洗涤细胞。 将细胞重悬于500μLHHBS中以获得每管1-5×10 5个细胞。

3.6用荧光显微镜（使用FITC和TRITC滤光片）或流式细胞仪（使用FL1和FL2通道）观察Ex / Em = 490 / 525nm和490 / 590nm处的荧光变化。