免疫学检测法的论文

沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠道细菌科，包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。它们除可感染人外，还可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾病，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。蛋、家禽和肉类产品是沙门氏菌病的主要传播媒介，感染主要取决于沙门氏菌的血清型和食用者的身体状况，受威胁最大的是小孩、老年人及免疫缺陷个体。根据国际惯例，要求对易受沙门氏菌污染的食品进行分类管理，以使大多数食物不含沙门氏菌，从而有效预防沙门氏菌病。为此，人们在探索沙门氏菌检测方法的过程中，作出了不懈的努力，现将有关进展报告如下，并介绍两种快速检测沙门氏菌的试剂盒。自19世纪后期，沙门氏菌首次被鉴定为人类的一种病原以来，检测方法学都是建立在采取感染病人的粪便或血液作为临床病料的基础上。此后的60年间，用于从食品中分离沙门氏菌的方法实质上与那些用于临床病料的方法是相同的。但至少有三个因素限制了用于临床病料的方法应用在食品分析上。第一，通常，沙门氏菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性质会干扰病原的检测，例如，某些食品中固有菌群可能处在一个很高的水平，从而影响特定细菌的选择性分离和鉴定；第三，与临床病料不同的是，经过加工的食品，由于加热、干燥、高含盐量、酸和冷冻等因素的作用，其中的沙门氏菌受到了尚不致命的损伤或称“致伤”。这就形成了一个具有不同生长特性的细菌群。这种现象对那些希望从食物样品中分离出沙门氏菌的食品分析家来说有很大影响，因为在选择培养基上直接培养“致伤”的沙门氏菌通常是以细菌死亡和试验失败而告终。为克服这些困难，人们建立了一种简单的微生物增殖步骤，专门针对以食品为传播载体的病原。虽然这些方法本身证明是可靠的，但却很费力、耗时，需要4～7天才能完成。因此，在需要及时、快速评价食品中微生物的安全性时，通常不被采用。随着DNA和抗体技术的发展，近10～15年间发展了无数改进的方法，其中许多可以在48h内检出沙门氏菌，这些方法通称为快速检测。1 传统的培养方法用于沙门氏菌分析的传统方法是食物样品分步增菌，以增加病原的可检出率，这种培养方法总体可分4个不同阶段或步骤。第一步(预增菌)，将样品加到一种高营养、无选择性的培养基中，温度37℃，使那些“致伤”的细菌复苏及使所有微生物生长。虽然缓冲胨水被建议常规使用(由于其可保持溶液pH值稳定)，但对培养基的选择仍存有争论。第二，是选择性增菌步骤，它使沙门氏菌生长而使肉汤中同时存在的微生物数量减少，与预增菌培养基相似，对选择性培养基的选择，也存在许多不同的观点。目前应用的主要有如下3种类型：连四硫基盐肉汤(Tetrathionate broth)、硒酸盐胱氨酸肉汤(Selenite cystine broth)和RV(Rappaport-Vassiliadis)培养基。由于没有任何一种培养基可以全面地保持所有食品基质或各种沙门氏菌血清型，所以，较适当的做法就是使用两种培养基平行地进行试验。第三步是分离步骤，即选择性培养物在含一种或多种抑制非沙门氏菌生长制剂的琼脂平板上划线培养，然后对平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认，并对该菌落分离物进行一系列生化和血清学检测，以作出鉴定。传统沙门氏菌检测法全过程需时至少4～7天，才能得出明确的诊断结果。2 以抗体为基础的检测方法利用抗原-抗体反应的显著特异性，来进行细菌的鉴别和血清学定型，已有半个多世纪的历史。细菌菌体或鞭毛抗原的特异性抗体的存在，使得人们可以建立一些快速方法来检测以食品为载体的病原。已经建立的沙门氏菌免疫学检测方法有许多种，大致可分为以酶标抗体(ELISA)，荧光抗体染色(免疫荧光法)，同位素标记抗体(放射免疫试验)为基础的方法及其它多种以抗体为基础，利用乳胶凝集、免疫传感器、免疫扩散及免疫色谱技术的方法。但常规中最广泛采用的是以双位点ELISA技术即夹心ELISA为基础的方法。此法改进后用有放射活性的同位素替代标记抗体，概括地说，是指以固定在固体基质上的“捕捉”抗体来捕捉目标抗原，经洗涤除去未结合的成分，加入第二种酶标抗体，此者结合在捕捉到的抗原的不同位点上，第二次洗涤后加入酶作用基质，并令其与颜色成分反应，然后用分光光度法即很容易检 测到目标抗原。采用微量滴定板作为固态基质使反应形式标准化，并促成其自动化。最近黎兆滚等人首次在国内口岸系统应用微量板ELISA法(Salmonelle test 1)对进出口动物产品(鱼粉、肉骨粉等)进行沙门氏菌检测。该法采用预先包被了沙门氏菌(A-E群)单克隆抗体的微量板，加入经增菌处理的样品，反应后再加入一定的指示剂，作用毕后用酶标仪测定OD值来判定结果。食物样品经适当的增菌处理，也可用此法进行沙门氏菌检测。ELISA法检出沙门氏菌的极限范围在105～106个细胞/ml，因此，要得出可靠的结果，食物样品首先必需进行预增菌、选择性增菌，通常还要在含有D-甘露糖的肉汤(M肉汤)中进行后增菌，以促进鞭毛发育。总的来说，标准的ELISA法样品的制备，约需要经过40～48h的孵育才能完成。黎兆滚等人的微量板ELISA法(Salmonella test 1)样品制备过程分三步，共耗时24h：①选用营养肉汤进行预增菌(6h)，使“致伤”、冷冻的沙门氏菌复苏。②使用选择性培养基RV进行增菌(14h)，使沙门氏菌大量繁殖，同时抑制其它杂菌生长。③使用营养肉汤(蛋白胨水)进行后增菌(4h)，使沙门氏菌的数量大大增加。比上述标准的ELISA法样品制备过程缩短了一半的时间。ELISA方法本身，则仅需要大约2h而已(其中30min是操作时间，90min是孵育时间)。相比之下，黎兆滚等人的方法可在27h内完成，比上述方法缩短了一半的时间，颇值得推广应用。最新式的沙门氏菌免疫学检测法，利用经特异性抗体敏化的免疫色谱卡片为基础。几滴样品加到卡片上，结果可以直接用肉眼读出。免疫色谱卡片极易操作，且由于无需要特殊设备，很适合小型实验室使用。尽管卡片检测法与ELISA法一样需要对样品进行增菌处理，但它(卡片法)本身通常需时不超过10min，如果采用黎兆滚等人的样品制备法，则可使操作时间更为缩短。3 以核酸为基础的方法细胞核酸DNA和RNA是唯一一类可以携带信息的大分子。由于所有的细胞都含有这种分子，可以利用它作为检测的标靶。标靶通常是一个特异性核酸序列，它可通过以补体核酸分子作为探针来检出。与免疫学方法相似，探针也需要加附适当的标记，如放射性同位素、酶或发光的标识物。Fitts等人在食品沙门氏菌检测中引入了第一代DAN—RNA杂交技术，此法应用的探针含有用放射性同位素标记的伤寒沙门氏菌DNA片段，其敏感性高，经大约48h的增菌步骤后，检测极限可达108个细菌/ml，但由于要使用放射性同位素，只能在专门的实验室应用，此方法的优点都被抵消了。为此，以核酸杂交为基础的第二代技术—比色计目前已发展起来。这种方法依赖于沙门氏菌核糖体RNA(rRNA)—核糖体发育过程中储存的核酸成分的检测。核糖体是细胞蛋白质合成器的一部分，每个细菌细胞中存在5000～20 000个复制体，而相比之下染色体DNA复制体仅2～10个。这种天然富含rRNA标靶序列的情况使得用无辐射计检测成为可能，同时又保持了与放射性同位素方法相当或更高的敏感性。其另一优点是由于rRNA为单链(而DNA为双链)，杂交前无需经过变性步骤。要得到阳性结果，此法需要105个靶细胞/ml，因此对沙门氏菌检测来说，需要进行预增菌和选择性增菌，总共约50h。rRNA探针法比沙门氏菌ELISA法更耗时，但二者成本相近。食品细菌检测法的最新进展是在化学扩增体系方面的发展，即聚合酶链反应(PCR)，用该体系可对制备好的样品进行细菌DNA扩增，以便更易于用诸如凝胶电泳法或比色型ELISA法检测。用于检测沙门氏菌和其它以食物为载体的病原的PCR方法业已建立，其中一些方法显示了极好的敏感性。但该法较难自动化，且必需经选择性增菌以稀释可能干扰检测反应的某些成分。一个完整的以PCR为基础的方法，需要2天才能完成，很大程度上抵销了其高敏感性的优点，但这种方法对那些含沙门氏菌较少或沙门氏菌“致伤”严重难以复苏而仍保有沙门氏菌rRNA的样品尤其有效。尽管目前用来检测沙门氏菌的方法各有优缺点，但随着科学发展，技术进步，人们探索、实践的继续深入，我们可以期待，将会有更多，敏感性更高，特异性更强，诊断时间更短的新方法出现。4 两种沙门氏菌快速检测法4.1 Transia沙门氏菌平板检测法 与耗时、昂贵的传统方法相比，此法快1～2天，且每次检测所需的操作时间缩短。该法建立在夹心ELISA法的基础上，利用多抗体混合物以保证检出所有的沙门氏菌血清型。反应的固相载体是一种有可见或不可见条纹的微量反应板。其小孔内包被有沙门氏菌的特异性单克隆抗体。第一阶段，在小孔内加入样品和抗体联合物(沙门氏菌属特异性单克隆和多克隆抗体的混合物)。孵育期间，沙门氏菌抗原和包被抗体形成了一种复合物：包被单克隆抗体-沙门氏菌抗原-抗体联合物。洗涤后，通过每孔加入基质溶液(过氧化脲)和色素原溶液(四甲基氨基丙苯)来显示上述复合物；酶催化色素原的氧化，结果产生蓝色。加入反应终止液终止催化反应，并使反应混合物酸化，颜色由蓝变黄。这种ELISA方法可对经选择性增菌及热休克作用后，释放了特异性沙门氏菌抗原的食品和环境样品进行检测。如采用黎兆滚等人的样品制备法，可大大缩短检测时间；此法可在没有酶标仪的实验室进行，从这点来说，Transia沙门氏菌平板检测法比黎兆滚等人的微量板ELISA法(Salmonella test 1)更适应于一般的实验室使用。4.2 Transia沙门氏菌卡片检测法 此法以单步免疫反应即夹心型免疫色谱反应为基础。反应固相包括一块用“抗沙门氏菌抗体-染料”偶合物浸透的染料衬垫和一张薄膜条，抗沙门氏菌抗体就固定在薄膜的反应区上。增菌后，增菌肉汤用移液管加到样品小孔内并令其吸收，如样品存在沙门氏菌抗原，它们会与偶合物作用，然后依次迁移到膜上，与固定在膜上反应区的抗体结合，在反应窗上呈现一条色带。最后结果可在5～7min内读取。此法也适用于没有酶标仪的实验室。如采用黎兆滚等人的样品制备法，可更加缩短检测时间，可在普通实验室条件下进行。参考文献1.黎兆滚，陈博文,等.用ELISA法快速检测沙门氏菌.中国进出境动植检,1997，(3)：34.2.Frank Axelsson,Marie-laure Sorin.Transia Salmonella technical handbook 1997,16～22.Backa bergogata 5,S-422 46 Hisings Backa,Sweden.3.Kevin Engler.Salmonellosis in laboratry animals.NAL.SRB 89-01,October 1988,1～2.National agricultural Libraty,Beltsville,MD20705.Animal Welfare Information Center (AWIC).(301)344～3212.

浅谈酶联免疫吸附试验实验教学思考的分析论文

【摘要】 酶联免疫吸附试验是广泛应用于临床检验诊断的免疫学检验技术，实验教学中采用该技术检测“乙肝两对半”。为适应中职生教育人才培养模式的教学改革，使学生符合具有“理论知识适度、技术应用能力强”的要求，我们对实验教学内容和方法进行改革，从适用性角度选题，通过实验操作考核，采取以考促学的手段，加强酶联免疫吸附试验的训练力度，提高学生实验操作能力，培养学生独立工作的能力。

【关键词】 酶联免疫吸附试验；免疫学检验；实验；考核

酶联免疫吸附试验(enzyme－linkedimmunosorbentassay，ELISA)是广泛应用于临床检验诊断的免疫学检验技术。该技术集基本理论、基本技能为一体，能使学生能对前期所学的理论知识及技能进一步加强和提高，是一个能为学生进人临床实习打好基础的系统实训。目前该技术的临床检测多采用商品化的ELISA试剂盒，实验步骤较少，操作简单。然而，参与反应的成分很多，如抗原抗体浓度、酶结合物浓度以及试剂的质量控制等等，影响因素众多。传统的实验教学中，实验材料的准备、仪器的准备及调试、标本及试剂的处理等工作基本上是由教师包办。实验的许多环节学生没有亲自做，因而在实验完成后，部分学生对实验还是一知半解，更谈不上能力的锻炼和培养［1］。为适应中职生教育人才培养模式的教学改革，使学生符合具有“理论知识适度、技术应用能力强”的要求，对免疫学检验实验教学内容和方法进行改革势在必行。为此我们通过实验技能操作考核，采取以考促学的手段，加强了酶联免疫吸附试验内容的训练力度，也收到了一定的效果，以下谈谈我们的做法及效果。

1精选考核内容，以适应临床实践的需要

考核内容的选择上以围绕临床实际进行选择，真正使学生做到学以致用。不但要让学生了解、掌握先进的免疫学检验技术和操作方法，还必须着重培养学生的创造性思维和综合分析问题的能力，从而全面提高学生素质［2］。ELISA由于操作简单、灵敏度高、可定性定量，在临床检验诊断中应用最为广泛。常用于如病毒性肝炎、艾滋病、疱疹等传染性疾病的检测诊断，还常用于补体、免疫球蛋白和肿瘤标志物的检测。要想在有限的课时里完成诸多的内容训练，显然是不现实的。因此我们仅选择了最具有代表性的“乙肝两对半”检测作为该技术的训练及考核内容。“乙肝两对半”共有五项检测项目，即HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，实验中所需要的实验器材均能由检验实验室提供，易于准备，给学生提供了选择和发挥的空间。实验过程中所需要的待测血清标本为阳性或阴性标准物，不具传染性，保证了学生实验的安全性。学生只要掌握了“乙肝两对半”的检验程序和检验方法，其他在临床上需要用ELISA技术检测的常见项目则触类旁通，能起到事半功倍的效果，至于少见的、较为复杂的检测项目可以在日后的实习及工作中继续学习。

2调整考核内容，可行性及针对性强

酶联免疫吸附试验教学内容在学时安排上有6课时，理论与实验课课时之比为1．1。以往的教学形式为先理论授课，教师讲解实验的原理及检验程序，实验教学中教师讲解后进行示范教学，学生照葫芦画瓢的再做实验;实验操作考核只设HBsAg项目的考核，考核项目单一、形式单一。学生只需完成实验操作，报告结果即可。而现行的考核内容是“乙肝两对半”的共五项检测项目，各个项目的检验过程如标本的稀释、试剂选择、加样顺序有所不一。从限制考核时间的角度考虑，学生在考核时随机抽考其中的一个项目，由考生自主选择所需物品进行实验操作，这样增加了考试的随机性和灵活性。虽然抽考使得考核难度增加，但能强化学生对ELISA检测乙肝两对半操作步骤的理解。当学生抽到题目后，在熟悉操作步骤的基础上，只要懂得该项目检测时需注意的细节，如检测HBcAb需将血清稀释50倍，HBeAb的检测需加入中和试剂，学生在对离心机、水浴箱及微量移液器的使用相当熟悉的基础上，不难将标本中的结果如实地检测出来。

3考核的形式

学生重理论、轻实验的现象普遍存在，有的学生每操作一步就看一下笔记，或者是询问其他同学，有的学生甚至希望教师能一步步的教，因而学生对酶联免疫吸附试验缺乏系统的认知。我们将考核的形式设计有理论测试(占30分)和操作考核(占70分)。通过调整考核内容，将能力培养贯穿于整个训练过程，将单纯理论教学融合于实验教学中，能把理论知识激活，也强化了学生的实验操作能力及解决问题、分析问题能力。理论测试采用本教研室的计算机交互平台进行，根据教学内容特点，理论测试我们进行这样的设计，首先收集乙肝两对半检测相关试题，建立题库，内容涉及实验原理、操作、材料、结果观察及临床意义。如(1)乙肝两对半检测涉及ELISA的哪些原理?分别检测什么项目?(2)通过各反应孔显色，判断疫苗接种者、病毒携带者、“大三阳”、“小三阳”;(3)手工洗涤有何要求;(4)加终止液的目的是什么;(5)ELISA常用的酶是哪种?其底物是什么。共组10套试题，学生抽签后通过计算机交互平台指向性地发布试题、进行考试。考虑到学生对理论考试容易产生畏难情绪，在题型的设计上，设有填充题，标示题、连线题及填空题等，内容直观、清晰，学生“寓考于乐”，在轻松愉快的心理环境下地完成理论测试。

4考试评分严谨，设计合理

理论考核从试题集中抽取出6道题组卷，每题5分，共30分。操作考核的评分项目包括:专业素质(衣着仪表、考试态度、纪律)5分;实验准备(实验用品、试剂的预处理、标本处理、标记记录)5分;实验步骤(加样、微量移液器的使用、孵育、洗涤、显色)35分，结果观察10分;操作后清场(试剂、器材归位、实验台面清理)5分，综合评价(规定时间完成、实验后清场、消毒等)10分，共70分。评分标准于考试前告知学生，给学生能充分地复习和准备，注意操作细节，提高考试质量。考试时每个学生独立完成试验，教师全程监考，及时对出错环节扣分，评出总分。

5效果分析

在酶联免疫吸附试验的实验教学中，采用考核方式，取得了以下成效。

5．1利于调动学生的主观能动性，激发起学习的热情

实验操作考核综合反映出学生的实验预习、实验过程和实验态度等各方面的表现。考核成绩占期末总成绩的30%，将学生实验考核计入课程总成绩后，学生上实验课的目的性增强，课上都抢着做实验，从以往实验缺乏主动性，不预习，不复习，变为积极思考，认真准备。实验报告抄袭现象也明显减少，改变了重理论轻实践的现象［3］。从学生提出的'问题，如溶血标本可以检测“乙肝两对半”吗?如果用溶血标本检测，会有什么影响，会影响什么试剂?从这些问题的提出可以看出，学生懂得对实验进行思考，也懂得遇到问题主动和老师商量，学生不断发现问题、思考问题、解决问题的能力得到提高。

5．2独立工作能力的培养

独立工作能力是一个医学检验工作者最基本素质，中职生毕业后就业单位多是基层医院，基层医院的检验科可能只有1至2名检验员，每天的检验工作任务都要独立完成。因而学生在就学期间即应注重独立工作能力培养。在实验考核过程中，实验物品的选择、摆放，实验结束后操作台的清理等，是学生自己准备和独立完成。学生在考核时需考虑到考核时间的限制，因此只有熟悉基本的理论知识、熟练基本操作，才能在规定时间内完成实验，得出正确的结果，考试前不做好准备实验将无法顺利完成。

5．3实验基本技能的训练

由于酶联免疫吸附试验涉及环节多，通过考试能综合考核学生的基本实验技术，如移液管的准确吸样，血清等倍稀释的方法;能考察学生对常用仪器设备如离心机、恒温孵育箱、酶标仪、洗板机的操作;在对血清标本进行检测时，使用过的物品如棉签、试管、注射器的正确处置，能增强学生的无菌操作技术和观念。

5．4学生的评价及反馈

此考核方案在两届学生进行了实施，通过操作考核，学生们得到较为系统的训练，对ELISA检测乙肝两对半的整个流程有了较为深刻的认识。有必要开展，通过考核能更好地将理论与实践相结合，学生能自如地、成功地检测出标准物血清标本的正确结果，同时也很有成就感，增强了对实习及将来的工作的信心。在对2013级的学生进行实习情况跟踪、访谈中得知，学生普遍认为，ELISA技术在临床免疫检验诊断中应用广泛，用此技术检测的项目多，工作量较大。由于在操作考核强化了技能，在实习老师的指导下，能很快地进入角色，增强了工作自信心。对学生进行实验考核的同时，也对教师提出了更高要求。教师准备的理论测试问题在内容上需与临床免疫检验接轨，使考核更科学合理化。规范实验教学，严谨、规范示作好示教。学生操作过程中，巡视督查，及时纠正学生的错误。以考促学法强化酶联免疫吸附试验的实验教学，补充和完善了免疫学检验实验教学的内容和方法，也希望能以此提高学生对其他课程学习的主动性及激发起学习的热情。