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我非常支持这项措施，因为我觉得这样可以进一步增加大家主动检测核酸的积极性。
对那些经常需要出差或跨地旅行的小伙伴来说，很多人在返回目的地的时候需要进行核酸检测。在此之前，核酸检测的成本非常高，有些地方的核酸检测的费用甚至已经达到了80元左右。正是因为核酸检测需要一定的成本，并不是所有人都愿意主动进行核酸检测，这也进一步加大了疫情的防控难度。我认为如果降低核酸检测的费用的话，更多的人会主动愿意进行核酸检测。
一、北京的核酸检测费用已经降到了35元。
在全国各地的其他城市陆续降低核酸检测费用之后，北京也降低了核酸检测的费用，最低的费用只需要35元。核酸检测的费用需要按照人次来收取，如果是单人检测的话，核酸检测的费用是58元。如果是5人检测和10人检测的话，核酸检测的费用分别是35元和18元。
二、我非常支持这样的措施。
正是因为核酸检测的成本在进一步降低，所以核酸检测的费用才能慢慢降下来。从某种程度上来说，当核酸检测的费用降下来之后，更多的人会愿意主动进行核酸检测。毕竟核酸检测是一件非常方便的事情，同时也可以保障大家的基础安全问题。
三、希望其他城市也能够响应这个措施。
除了北京地区之外，全国已经有多个城市开始降低核酸检测的费用。因为核酸检测涉及到大家的安全问题，在有必要的情况下，我觉得每个小伙伴都需要主动进行核酸检测。如果一个人曾经到过中风险区或高风险区，这个人更需要在回到自己的城市的时候进行核酸检测，通过这样的方式保护自己和他人的安全。
无论在学习、工作或是生活中，大家最不陌生的就是作文了吧，作文要求篇章结构完整，一定要避免无结尾作文的出现。那么问题来了，到底应如何写一篇优秀的作文呢？下面是我精心整理的写让我紧张的核酸检测的作文800字，欢迎大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
8月22日，班主任在微信群里发了一条通知：明天上午9：00，到学校做核酸检测。带上20元现金。
我看到消息，赶紧给妈妈打电话，问：妈妈，您看到群里的消息了吗？核酸检测是什么玩意儿呀？
我看见消息啦。核酸检测就是看看你有没有病毒，为开学做准备。明天我带你去学校就知道啦。妈妈可能在工作，着急忙慌地说了两句就挂断了电话。
核酸检测和接种疫苗一样，在手臂上打针吗？我最害怕打针了！我开始胡思乱想起来。
第二天，九点不到，我和妈妈就去了学校。没想到，学校门口已经有许多家长带着孩子进进出出了。
进了学校大门，妈妈打听了几句，问了问情况。他们说，让孩子自己先去班级里面等。还没等妈妈开口说话，我就快速地跑进了教室。
推开教室的门，很多同学已经在自己的座位上了。班主任在讲台上站着，手里握着一大把钱。原来，是回教室交钱的。我心里想着，赶紧把钱交给了老师。
回到座位上，我问同桌：你知道核酸检测是什么吗？他说不知道。
班主任拿着人名单，说：5人一组。我读到谁，你们5个，按顺序到楼下站队，等待检测。
我随着队伍站在操场上。我看见妈妈和其他家长有说有笑的。我有点儿纳闷儿，他们在说什么呢，不会又是在讨论我们的学习吧？算啦，先不管她们了。核酸检测到底怎么做呢？望着前面的长龙，我的心里比头顶的大太阳还燥呢。
等了好久，才轮到我们组。我看着医生拿着湿棉签，伸进同学的嗓子。我心跳加快，扑腾扑腾的，心里越发紧张起来。棉签儿那么长，还有点儿尖，往嗓子里面伸，会不会疼呢？这样想着，身体不由得机灵了一下。
站在我前面的同学，转身走了。我屏住呼吸，等待大夫的发号施令。我的心里慌乱极了，就像十五个吊桶七上八下的。
把口罩摘掉，张开嘴。
我把嘴张得大大的。
‘啊’一下。
我赶紧拉着长音啊起来。
医生拿着棉签，轻轻地在我嗓子里蘸了一下。
好啦，出去玩吧！
我瞪大眼睛，有点不敢相信。这就好啦？这么简单？不痛不痒的。看来，我真是大惊小怪啦！
原本我以为这个夏天会有一个愉快而充实的假期，没想到天说变就变，突如其来的疫情，打破了这一切，所有的旅行计划全都泡汤，到后来连小区里都不能走动，我们开始足不出户，并且每天都要进行一次核酸检测，这也成了每天唯一的放风时间。
还记得第一次做核酸检测，我很疑惑地问妈妈，核酸检测是什么？妈妈告诉我，核酸检测就是将一根棉签插进你的嘴巴里，从喉咙中提取一些液体，然后进行化验，化验过后，如果呈阳性，就表示你感染了新冠病毒。
我和姐姐怀着好奇地、忐忑不安的心情排在了队伍后面，只见队伍像一条长龙，一眼看不到尽头，我们等了很很久，我不停地问妈妈，还要多长时间？妈妈让我们耐心等待，她也不知道需要多久。我们排了两个多小时，终于快到了，工作人员安排我们进入等候区域，我们这一批的10个人坐在了间隔一米的凳子上，等前一组的人检查完，才能进去。没过一会儿，我们就被工作人员安排进做核酸的房子里。
一进门，一股浓浓的药水味扑进了我的鼻子，我开始紧张、害怕起来，站在那里不敢往前去，医生说：“小朋友快点过来，不要紧的。”我说：“能不能轻一点儿？”医生说：“当然可以，但是你要把嘴巴张大了哦。”我把嘴巴张大，可当棉签碰到舌头后面时，我立刻呛了起来，本能地闭上嘴巴，推开医生的手。这时，旁边的人都看着我，我感到自己的脸颊开始发烫。
医生又耐心地对我说：“我们再来一次，千万不要推开我的手，你的手也不要碰这里的任何东西，等会儿做完就用免洗酒精擦擦吧！”我点点头，再次张开口，医生小心的地将棉签伸进去，可刚伸到里面我还是感觉要呕吐，但这次我使劲憋着，棉签终于抽走了，我的眼泪也快要出来了，我假装看着地上，不想让其他人看到我的狼狈……
回家的路上，我还在想着做核酸情景，虽然没有特别恐怖，可以克服，但是确实是很不好受，我好希望不要再做了。
现在，我已经完全习惯了每天的'核酸检测，但我知道这种的习惯是不正常的，不是好事。我不希望有更多的人习惯每天的核酸检测，那将意味着新冠病毒越来越严重。
你知道吗？现在我们小区认识的大人们每天排队时才能见面，并且似乎只会说那两句话了：你做完核酸啦？或者是，你们来啦，我刚做完……唉，我还是喜欢不戴口罩时的夏天，晚上大人们聚在在一起谈天说地，小朋友踢球打闹……
好希望好希望，疫情快点结束呀！
真是一个一波三折的晚上。
晚上回到家，刚端起碗，准备吃饭时。妈妈冲了出来，拿着手机念到：“今晚七点十分到班，要进行核酸检测。”我听完，飞快地吃了半碗饭，收拾了书包去了学校。
到了班上，如果不是天黑和几个同学穿着自己家的衣服，还真分辨不出来是上课还是下课。
人到了差不多了，广播中传来人到齐的班级可以检测的消息。老师从第四组向第一组扫视，一边看一边问：“还有谁没来？”“陈乐希！”几个人异口同声说到。老师的视线也停在了第一组那个空位上。原来有一位同学姗姗未来，没办法，只能耐心等待了。
我们在班上等了一会儿，那个同学才来。可我们已经错过了出发的最佳时间，只能等广播通知了。我们在班上有的人看书，有的人写作业，也有的人画画。可时间老人还是在那小碎步前进。实在无聊。
终于在等了“一个世纪后”，让人充满未知的核酸检测来了。我们来到了地下篮球馆。看着人山人海的篮球馆，看着穿着防护服的医生，让我想起了隔离的画面。吹着空调，听着噪杂声，闻着消毒水味，我打着一个哆嗦，一种莫名的恐惧涌上心头。
经过了一会儿的排队，就差一个人就轮到我了。仔细看了看医生的操作：先打开一个包装袋，取出一根类似棉签的东西。再放到嘴里戳了两下……这下我放心了，不是从鼻子放进去就好。
轮到我了，突然医生的动作变快了。恐惧充满了我的全身，我什么也没感觉到，而且我还隐隐听到医生说了什么，可是我还没来的急听，就被噪杂声掩盖了。整个过程就持继了两三秒。
做完检测，我咳了两声，试图让喉咙好受一些。刚才没有任何感觉，但现在我才感觉到，刚才好像有根针在扎我的喉咙。
突如其来的核酸检测线束，我们排着队回家了。
最后全福清二十八万师生无一例阳性。我突然有一股说不出的爱国情怀由然而生。我们祖国做的防控真的是很到位，医护人员坚守一线，不抛弃任何一个人。大家虽然不知道他们的名字，可还是被他们所感动，向他们致敬，他们才是最可爱的人！
9月10日，在仙游枫亭，一场突如其来的疫情风暴打乱了我们美好生活的节奏。一学校在例行学生核酸抽测中发现了阳性病例，而且是德尔塔毒株，这种毒株来势汹汹，疫情防控工作刻不容缓。
9月12日，全民核检，一个都不能少。上午，我们一家人整装出发，一起去社区做核酸检测。到达时，我发现检测点早已被围得水泄不通。只见有的人一边撑伞一边悠闲地玩手机，十分安静地排队，有的人因为排队时间太长而变得心情烦躁，甚至还想插队，也有的人把口罩脱到了下巴，与旁边的人窃窃私语，还有一些大妈们因为起了大早，拿了号早早地排队，却因为临时改变成按栋来检测，而气得火冒三丈，脸都涨红了，还破口大骂……整个场面乱成了一锅粥。只见志愿者不厌其烦地耐心劝解，人们才乖乖地排起了“长龙”。
妈妈拿起手机，扫描了二维码，并截好了图。该轮到我们了，妈妈便把早已准备好的截图给医护人员看，医护人员向妈妈核对姓名确认信息无误后，便用免洗洗手液消毒了双手，然后拿出一根棉签。此时，我的心紧张地像一只小兔子乱蹦乱跳。因为之前在我们学校也做过一次核酸检测，那时我的喉咙十分难受，恶心地想吐。这时，温柔的医护人员用甜美的声音对我说：“小妹妹，别害怕，放轻松，张大嘴巴。”于是，我发出了“啊——”的声音。我感觉棉签就像一位调皮的孩子在我的喉咙中遛了一个弯。随后医护人员微笑地说“很好，你真勇敢，可以了。”我暗自庆幸，这次幸好听了妈妈的话，做核酸前没有吃东西，才不会恶心难受得想吐。最让我们惊讶的是：胆小怕事的弟弟这一次竟然不哭也不闹，还十分配合医护人员做核酸检测，做的过程非常顺利，结束后得到了全家人的赞赏。
采集点都设在空旷暴露的地方，再加上这几天秋老虎发威，室外气温异常闷热，给我们采集核酸的医护人员还要裹在厚厚的防护服里，检测时我看到了他们的玻璃面罩下挂满汗水的脸，和一双双疲惫不堪的眼睛。听妈妈说这些医护工作者很多都是其他城市过来支援的，他们星夜驰援，分秒必争，一来就投入“疫”战之中！
我深深地感受到了哪有什么岁月静好，只是有人在为我们负重前行。我们每个人都应该向这群勇敢的无私奉献的人们致敬和学习，环境再艰苦恶劣他们也没有退缩和抱怨，他们的坚持和勇敢像一缕缕阳光照进我们心里，温暖我们的生活。疫情无情，但人间有爱，我们应该宅家好好学习，做好防疫工作，不给国家添乱。让我们团结起来共同打赢这场“疫战”，争取早日回校上课！
这是一件特别好的事情，这样做的话，也不会让国家有很大的损失，所以我非常认可这样的做法。
在最近卫健委关于新冠疫情召开召开新闻发布会上，相关的专家表示：查验核酸检测不应该成为一种常态。
我觉得“查验核酸检测不应该成为一种常态”这一个观点是相关部门根据新冠疫情的实际情况得出的建议。这一个建议是比较切合事迹，既考虑到了对于新冠疫情严格防范的措施，又考虑到了新冠疫情在国内各个地方的情形不一样而做出的建议。
按照新冠疫情的发展，我们国家的相关人员已经掌握了应对新冠疫情的科学、行之有效的方法，面对新冠疫情，我们国家的相关人员已经有了很丰富的经验。要是不管三七二十一，就对所有的地区都进行常态性的查验核酸，是不符合实际情况的。要是该地区没有新冠疫情，也没有输入风险，实行常态性的核算查验，无疑是在浪费人力和物力，也是在浪费市市民的精力和时间。
我觉得这一个观点也是考虑到国计民生，也考虑到我们新冠疫情防疫的实际情况。考虑到当前我国的新冠疫情时保持相对较好的水平，只是在某些地方需要进行重点关注，低风险地区、低风险人群、长期居家人群要是还进行常态性核酸检测，就不符合实际。我国面对新冠疫情，在从开始到现在，采取的措施都是遵循科学原理，尊重事实，采取的措施也是行之有效的，对于疫情的反应也是迅速的，所以，要是在低风险地区、低风险人群、长期居家人群中还是实施常态性的核酸检测，是在浪费医疗资源。
我们国家的人口基数大，医疗资源相对不平衡，要将有限度医疗资源用在实处，用在有用之处，才是真正在应对疫情。
其原理如下：1、查重系统一般是通过检索关键词和关键语句来实现检索的。对比数据库为：中国学术期刊数据库、中国学位论文全文数据库、中国专利全文数据库、中国重要会议论文全文数据库、英文论文全文数据库、港澳台学术文献库、法律法规数据库、PaperRight云论文库等。2、论文提交检测后，系统会自动检测该论文的章节信息，如果有自动生成的目录信息，那么系统会将论文按章节分段检测，否则会自动分段检测。3、查重系统的灵敏度设置有一个阀值，该阀值为百分之五，一段落计，低于百分之五的抄袭或引用无法检测出来。知网毕业论文查重的原理：查重原理以知网作为依据，其它查重方式相差无几（论文中字体灰色部分不参与查重，重复处有红色标记）：关于目录：毕业论文上传后，系统会按照论文的目录合理划分章节信息，此时目录不参与查重，然后按章节信息检测各部分的复制比；如果没有目录信息，系统就会按照1万字左右进行检测，目录有可能也会被查重，如有重复会标红；查重阈值：知网对查重系统设置一灵敏度为5%，假如一个段落有1000个字，那么引用单篇文献50个字以内，是不会被检测出来的；标红的条件：满足上一条（超过5%比例），同时一个段落13个字相似或抄袭，会被标记为红色；参考文献：在论文查考文献格式正确的前提下，知网查重系统不对参考文献查重，否则会被用来查重；论文格式：知网查重系统可以识别PDF格式和WORD格式，由于pdf格式相比word的格式，多了一个文本转换，因此可能导致目录、参考文献的格式变成系统不识别的正确格式，从而使查重比例升高（特别注意英文部分格式会更高）；关于引用：引用尽量整段引用，否则知网查重系统不会知道你具体引用的那篇文献；
论文查重通常是国内高校或者期刊对于即将发表的论文或者毕业论文进行原创性审核，以及为打击学术论文创作过程中可能存在的学术不端行为，而采取的一种审核制度。论文查重一般是将检测的论文与查重软件数据库中所收录的文献资料，根据一定科学且严格的识别规则算法，将论文中的重复内容检测出来，并最终统计出论文中的重复文字占全文字数的比重，也就是计算出论文查重率。
高校和杂志社一般都没有会明文规定不能提前查重，但是会给出一个查重标准以及论文格式等要求，按照所规定的要求进行论文写作和查重即可。查重率结果如若符合高校或者杂志社的规定标准，那么投稿论文有着较大机会被成功发表，而毕业论文也可以获得论文答辩的资格，从而顺利毕业。
进行论文查重就需要用到专门的论文查重系统。目前国内主流的论文查重系统是知网、维普和万方，但是查重的费用比较高。所以小编建议大家前期可以使用paperpp论文查重系统，性价比很高，并且参与活动能够获得免费查重机会。
对于大学毕业生来说，同样的最终评估是毕业论文，所以他们也需要完成毕业论文的写作，然后使用论文查重软件，等待检测报告的生成。下面paperfree小编将向您分享怎样正确的使用论文检测系统？ 面对市场上各种各样的查重软件，没有太多经验的学生不知道如何选择。下次，让小编一个接一个地教你。目前，市场上的主流查重软件主要包括paperfree、papertime等。 一般学校有自己规定论文查重系统，包括庞大的数据库。但是学校论文查重系统在校外是找不到查重入口的，我们如果想提前检测自己的论文，只能找一个正规靠谱的论文查重系统来检测，然后定稿查重在学校检测，学校一般会提供1-2次免费查重机会。 此外，面对市场上的免费查重软件，学生必须擦亮眼睛。俗话说，世界上没有免费的晚餐。不要贪图暂时的小恩小惠，随意将论文上传到所谓的免费查重软件上，因此无法保证查重率的准确性。同时，一些正规的查重软件也会泄露其论文，给学生带来不可挽回的后果。 因此，学生在进行论文查重检测时，必须选择合适的查重软件。这样才能保证查重结果的准确性和论文的安全性。
本科论文、硕士论文、博士论文、职务论文都需要论文检测，这对所有毕业生来说都是不可或缺的一环，只有通过重复检测的论文才能成为合格的论文。那篇论文查重检测系统的原理是什么？接下来介绍这个内容，希望能帮助到大家。论文抄袭检测系统的原理是什么？1.论文抄袭检测系统将学生上传的论文与资源数据库中的所有论文进行比较，并在论文中标出相似或相同的句子，最后在此基础上找出相似的论文，计算出重复比，作为大家的参考。2.同时，论文抄袭检测系统采用多级对比方法，句号一般为最小对比单位，然后对句子、段落、全文进行多级对比。如果对比句超过系统设定的阈值，将被判定为抄袭。3.当段落中5％的字符与其他论文相同时，也将被视为抄袭。因此，简单地改变单词的顺序不会有太大的用处，每个人都不应该随意处理他们写的论文，因为他们有这种幸运的心理。论文检验抄袭率的要求及对比内容。1.本科论文、硕士论文和博士论文的抄袭率有不同的要求。一般来说，本科论文的重复率应控制在30％以内，硕士论文的重复率应控制在20％以内，博士论文的重复率应控制在10％甚至5％以内。2、论文检测系统的内容一般以正文为主，论文目录、参考文献、原始声明、附录等通常不在检测范围内。以上是关于论文抄袭检测系统原理是什么的问题解答，希望能够对大家有所帮助。
用数学的眼光看世界、用数学的眼光看医学，数学无处不在，核酸检测也不例外！今天我们要跟大家讨论的话题是：从核酸检测的“混检”谈起。 大家知道：核酸检测是尽早发现新冠病毒感染的最有效的途径，在防疫抗疫中具有不可或缺的重要作用，因而，如何及时、准确、高效开展核酸检测就成了我们必须高度关注的重大问题。从数学的角度来看，就是一个实验设计的最优化问题，也就是说：要在最短的时间内、以最少的检测量、花费最少的成本、检测尽可能多的人群。 目前通行的核酸检测方法，有“单检”与“混检”两种：什么是“单检”呢？就是将每个人的采集样本分别放入每个人的专用试管，进行“一对一”的检测，检测的结果谁阴、谁阳、谁是病毒携带者，精准无误；但是，如果需要检测的人数比较多，比如几十万、上百万甚至上千万，“单检”的工作量太大，成本太高，很难及时完成检测工作。 在实际的检测中，经常面临需要检测的人数成千上万甚至更多的情况，只靠“单检”难以胜任。这时候，就需要“混检”，也就是将几个人的采集样本混合后放入同一试管，进行“多对一”的检测，如果检测结果为阴性，那么这几个人就全部通过；如果检测结果为阳性，说明这几人当中有病毒携带者，就需要对这几个人再做进一步检测。 假设某个疫情的地区，有100个“密切接触者”需要核酸检测，已经采集了这100人的核酸样本，如果采用“单检”，需要检测100次；而中低风险地区，病毒的感染率不足1%（也就是说，平均每100个人当中，至多只有1人可能携带新冠病毒），为了检测出这100个人当中的1个病毒携带者，我们花费了成百倍的时间与成本；如果采用“混检”，就可以提高效率、缩短时间、降低成本。 目前国内通行的“1:10均匀混检”是这样的：先把这100人的采集样本依次编号、并按每10人一组均分成10组，1至10号为第一组、11至20号为第二组、……、91至100号为第十组。 然后，对每一组中的10个样本，都分别进行一次“混检”（也就是把10个人的样本混合在一起，作一次检验）；哪一组“混检”结果为阴性，哪一组就一次性全部通过；哪一组“混检”结果为阳性，说明这组10人当中有病毒携带者，就需要对这10个人再分别做一次“单检”。 最乐观的情况是：十个组的“混检”结果都是阴性，100个人的检测全部通过，只花了“单检”十分之一的时间与成本就完成检测工作。 最有可能发生的情况是：十个组的“混检”结果出现了一个组阳性（假设是第二组），其余各组检测结果都是阴性，除第二组10个人之外，其余90个人全部通过检测。 然后，再对“混检”呈阳性的第二组进行一对一的“单检”，就可以精准找出病毒携带者。于是，对这100人的样本，一共检测20次，只花费“单检”五分之一的时间与成本，就完成了同样的检测。换句话说，最大的可能是：“混检”只花“单检”五分之一的时间与成本，就完成同样的检测。 不知道大家是否还记得我们在《晓星说数学：小白鼠试毒问题》中曾经介绍过“实验设计最优化”的一种“二分法”？ 从理论上说，目前通行的“均匀混检”，还可以用“二分法”进一步改进为“二分法混检”；采用“二分法混检”最可能的情况是：只花费“单检”七分之一的时间与成本，就完成同样数量的检测。 “二分法混检”的关键，是一步步地将待检测的样本尽可能“对半”分组：仍然假设待检测的样本为100人，将这100人依次编号，并“对半”分组，1至50号为A1组，51至100号为A2组。 然后，A1与A2两组分别进行“混检”…… 最理想的情况是：A1与A2两组“混检”结果均为阴性，100人全部通过检测；仅两次就完成了检测工作。 最可能发生的情况是：A1与A2两组“混检”的结果，一组为阴性而另一组为阳性，假设阳性为A1组，A1组还需要继续用“二分法混检”；阴性为A2组，A2组50人全部通过检测。 A1组的“二分法混检”，仍然再对半分组，1至25号为B1组，26至50号为B2组。 然后，B1与B2两组又分别进行“混检”： 上一步检测已知A1组呈阳性，所以这一步B1与B2两组“混检”的结果，不可能出现两组皆阴，最大的可能仍是一阴一阳，假设阳性为B1组，B1组还需要继续用“二分法混检”；而阴性为B2组，B2组25人全部通过检测。 继续对B1组用“二分法混检”，将B1组分成两个尽可能接近的组，1至13号为C1组，14至25号为C2组，对C1与C2又分别进行“混检”，最大的可能仍是一阴一阳，假设阳性为C1组，C1组还需要继续用“二分法混检”；而阴性为C2组，C2组12人全部通过检测。 继续对C1组用“二分法混检”，将C1组分成两个尽可能接近的组，1至7号为D1组，8至13号为D2组，对D1与D2两组又分别进行“混检”，最大的可能仍是一阴一阳，假设阳性为D1组，D1组还需要继续用“二分法混检”；而阴性为D2组，D2组6人全部通过检测。 继续对D1组用“二分法混检”，将D1组分成两个尽可能接近的组，1至4号为E1组，5至7号为E2组，对E1与E2两组又分别进行“混检”，最大的可能仍是一阴一阳，假设阳性为E1组，E1组还需要继续用“二分法混检”；而阴性为E2组，E2组3人全部通过检测。 继续对E1组用“二分法混检”，将E1组中4人均分成两组，1、2两号为F1组，3、4两号为F2组，对F1与F2又分别进行“混检”，最大的可能仍是一阴一阳，假设阳性为F1组，F1组只剩两人，需要继续“单检”；而阴性为F2组， F2组两人全部通过检测。 呈阳性的F1组只剩两人，继续检测只能“单检”，检测结果最大的可能仍是一阴一阳。无论如何，通过六次“二分法混检”与两次“单检”，一共14次检测，我们完成了100人的检测，所花时间与成本仅仅是“单检”的七分之一。 其实，以上的检测方法还可以改进，不需要六次“二分法混检”再来两次“单检”，而是在第五次“二分法混检”之后，紧接着就来四次“单检”，一共也是14次检测，就完成100人的检测。 以上我们所讨论的“1:10均匀混检”与“二分法混检”，有个重要的前提，那就是：已知病毒的感染率不足1%；如果疫情加重，风险等级提高，病毒感染率达到了5%，又应该如何进行核酸检测呢？。限于篇幅，不再赘述，仅留个问题供大家思考： 仍然是100人的采集样本的检测，假设阳性率为5%（即每100人当中最多有5个病毒携带者），现在按“1:5均匀混检”，也就是按每组5个人把这100人均分为20组，请问：应该如何安排“混检”与“单检”，最少需要检测几次？最多需要检测几次？ 提示：只需要考虑两种极端情况：（1）5个阳性样本恰好被分在了同一个组；（2）5个阳性样本恰好被分在了五个不同的组。 用数学的眼光看世界、用数学的眼光看医学，数学无处不在，核酸检测也不例外！在核酸检测这样的重大实际问题中，我们再次看到了数学方法的强大威力！
用适当的单位 填空。疫情来了，收到通知全体人员都要进行核酸检测，六六老师迈着一步50（ ）的脚步赶到离家800（ ）的检测点，发现排队的队伍有100（ ）那么长，而且每个人之间都要隔着1（ ）！ 轮到我了，身高1（ ）60（ ）的白衣天使拿出差不多10（ ）长的小棒，插入我喉咙下大约6（ ）深，检测结束，医护人员奖给了我价值5（ ）的棒棒糖。 虽然检测有点痛苦，但为了生命安全，还是要检测的！听有些人说，如果去医院检测，一次要花30（ ）呢！排队问题： 66老师，排队去做核酸检测。发现我的前面有4人。后面有8人，问整个队伍一共有几人？66老师第二次排队去做核酸检测，发现前面有4人，后面的人数是我前面的3倍，问整个队伍一共有多少人？66老师第三次排队去做核酸检测。发现后面有5人，前面的人数是后面的2倍。问这只队伍一共有多少人？疫情来了，白衣小队组织去救援，这只小队有9组，每个小队有8人。问，这次救援小队一共有多少人？分到石柱镇的白衣天使，男生有8人，女生的人数是男生的3倍，问：分到石柱镇的白衣天使一共有多少人？医护人员搭了4个帐篷，每个帐篷需要5名白衣天使的协助。问有几名白衣天使在帐篷下工作？一辆大巴车能坐30名乘客。大巴车能乘坐的人数是小面包车的5倍，问：两辆大巴车，一共能坐多少人？六六老师准备坐大巴车去酒店隔离，一辆大巴车能坐30名乘客。排队时，老师发现我前面有8人，后面有19人，问：这辆大巴车 够坐吗？ 六六老师在酒店隔离，酒店的一桶泡面要8元，买9桶，六六老师带了100元， 够吗？ 如果有钱剩下，买4元一瓶的牛奶，能买几瓶？ 如果六六老师45元买了9桶泡面，妈妈，36元买了6桶泡面。问：谁买的泡面便宜？月刘老师拿了20元 去买3元一根的火腿肠。买了6根，应找回多少钱？妈妈买了三个面包和一箱牛奶，一个面包要5元，一箱牛奶要45元，还剩下40元。问：妈妈一共带了多少元钱？到了酒店，66老师看一本36页的故事书。如果每天看6页，几天看完？如果打算4天看完，平均每天看几页？66老师每个星期工作5天，每天工作6小时。问：一个星期工作多少时？如果66老师每个星期工作5天，一共工作了40小时，问：平均每天 工作多少小时？
【综述】几种用于发现未知病毒核酸序列的技术及其应用翁康生 病毒是引发人类传染性疾病的主要病原体之一, 它们极大地威胁着人类健康。目前还存在人类尚未认知或新出现的病毒, 随时可能严重危害人类健康安全〔1 - 3〕。及早地发现,鉴别未知的或新出现的病毒, 是有效的预防和控制的先决条件之一。因此, 建立、储备、改良、发展、乃至创新应用于发现、鉴别未知或新出现病毒的技术方法是十分必要的。近20 多年来, 常采用传统的微生物学技术方法和现代分子生物学技术方法相结合的途径, 发现和鉴别未知病毒。通过细胞培养的方法分离病毒、电镜观察、用已知病毒的抗血清建立的免疫学方法作排他性检测、用已知病毒核酸序列建立的PCR、杂交等方法, 作特异核酸序列的检测、用分子生物学技术获得未知病毒核酸序列, 查询基因数据库, 检出并确定未知病毒基因组序列, 最终发现鉴别出未知病毒。对于无法用细胞分离培养的未知病毒, 有的采用免疫学与分子生物学技术相结合, 筛选获取病毒特异抗原编码基因的克隆, 进而发现鉴别出该病毒。更多的则是采用相应的分子生物学技术, 从被检样品中发现获取未知病毒的核酸序列,进而发现鉴别未知病毒。无论未知病毒是否可以用细胞培养分离, 最终对其基因组序列的测定分析, 是鉴别和判断的决定性依据之一, 而获取未知病毒的核酸序列是前提条件。从少量样品中, 从高度复杂的宿主细胞核酸物质中, 分离、扩增、获取足够量的无基因序列资料的未知病毒的核酸片段, 供进一步克隆、测序、生物信息学分析, 是用分子生物学技术发现、鉴别未知和新出现病毒的关键之一〔4〕, 也是最终测定分析, 拼接出未知和新出现病毒基因组序列的瓶颈步骤。病毒所携核酸物质有DNA 和RNA 之分, 可采用的技术方法也有所不同, 现将有关技术与其应用作一简介, 以供参考。1 代表性差异分析法代表性差异分析法是为寻找分析两个生物样品复杂的基因组间有何差异而发展建立起来的分子生物学技术方法, 并不断得到演化, 发展和应用。病毒感染宿主细胞后, 与未感染的同类细胞相比, 二者核酸物质间的差异主要在于是否存在病毒核酸。消减去二者核酸间相同序列的背景部分, 扩增、比较、选取余下可能存在差异的部分, 进一步分析以发现未知病毒的核酸序列。病毒的核酸结构各有不同, 可选用相应的代表性差异分析法, 见表1 。111 DNA 代表性差异分析法(DNA Representation differenceanalysis , DNA RDA)此方法是Lisitsyn 等〔5〕利用核酸消减杂交技术〔6〕、PCR 方法和双链DNA 热变性后互补链退火复性的二级动力学原理〔7 - 8〕作者单位:上海市疾病预防控制中心 200336表1 病毒核酸类型与各代表性差异分析法的选用病毒核酸类型DNA RDA c DNA RDA非rRNA 序列6 核苷酸引导c DNA RDAds DNA 线状√ds DNA 环状√ss RNA polyA( + ) √ss RNA polyA( - ) 3 √ds RNA polyA( - ) √ 3 负链ss RNA polyA( - ) 视病毒在宿主细胞的转录机制而定。而建立的。方法中将需分析的样品DNA(Test DNA ,T- DNA) 和对照DNA(Driver DNA ,D - DNA) 设为二组,分别用同一种限制性内切酶酶切处理,并接上5′端去磷酸化的人工接头,补齐接头后,加入与接头序列互补的引物作PCR 扩增。切除扩增产物上的人工接头后,切出的T - DNA 连上第二种人工接头,变性后与过量的变性D - DNA 杂交。通过杂交,消减去T- DNA 中与D - DNA 中同源的核酸序列,而只存在于T - DNA 中的靶序列DNA(Target DNA) 则自我退火复性,其两端连有第二种人工接头。加入与第二种接头互补的引物作PCR ,只有靶序列DNA呈指数扩增,因而得到进一步富集。进过如此重复的几个轮回后,以电泳检测比较T- DNA 和D - DNA ,将T- DNA 中呈现的差异部分作分离,克隆,序列分析。Lisitsyn 等以10μg 人淋巴细胞基因组DNA 作为D - DNA ,在相同的人DNA 中加入相当于单拷贝量的120 pg 腺病毒DNA作T- DNA。以此作为实验模型,用DNA 代表性差异分析法成功的寻找、鉴定出外加入的腺病毒DNA 序列。应用此技术,Chang 等〔9〕在艾滋病相关的卡波西肉瘤(Kaposis Sarcoma) 中发现一段类似人类疱疹病毒的基因, 并由此发现一种新的病毒HPV8。以后人们又以此技术发现鉴定了HPV6、TTV 病毒、黄热病毒样基因组、MDV 等〔10 - 13〕DNA 病毒。112 cDNA 代表性差异分析法(cDNA Representation differenceanalysis , cDNA RDA)Hubank 等〔14〕针对mRNA 所含序列相对简单的特点,提出了cDNA 代表性差异分析法。它的基本原理与DNA RDA 相同,主要不同在于,采用识别4 核苷酸序列的限制性内切酶,它的识别位点在mRNA 反转录成的cDNA 中出现的频率更高,平均酶切片段长度约256 bp ,保证了cDNA 序列群中绝大多数序列,至少被切出一个片段可扩增,供差异分析,分离鉴定。cDNA RDA 技术相对经济,可高效灵敏地用于非常少的起始材料而获得结果〔15〕。具有polyA( + ) - RNA 病毒,其核酸可类似于mRNA 分离纯化,因此可应用此技术。利用cDNA RDA技术,发现鉴定了TiV、MenV ,等〔16 ,17〕RNA 病毒。113 非rRNA 序列6 聚核苷酸引导反转录的cDNA RDA中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13 ·317 ·© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.netpolyA( - ) - RNA 病毒,其核酸物质不似于mRNA ,需和宿主细胞总RNA 同时分离,并用随机引物作反转录。因为宿主细胞总RNA 中rRNA 约占80 % ,由于竞争反应、靶序列信号被湮灭等原因,从这样的总RNA 抽提物中,用随机6 聚核苷酸引物引导反转录的cDNA RDA 技术,发现鉴别polyA( - ) - RNA 病毒核酸序列是困难的。Endoh 等〔18〕罗列了6 聚核苷酸所有可能的排列组合,共计4 096 个序列模式,以大鼠18S、518S、28S 等rRNA、微卫星重复序列、SARS - CoV、BI - 3 病毒等的序列数据为模型,筛选出在rRNA 序列中出现频率极低或不出现的6 聚核苷酸序列模式共96 种。将这些序列分别合成并混合后,称之为非rRNA 序列6 聚核苷酸引物。生物信息学分析96 种序列模式在哺乳动物病毒科具代表性的1 791 个病毒基因组序列中出现的频率,数据表明,非rRNA 序列6 核苷酸引物可引导绝大多数病毒的cDNA 合成。分别用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物和随机6 核苷酸引物作cDNA 反转录效率、cDNA RDA 试验,结果表明,二类引物对人工合成的RNA (二类引物在其序列中出现的频率相似) 反转录效率几乎相等,而前者对细胞总RNA反转录效率远低于随机引物。用二类引物作cDNA RDA ,检测人工合成的RNA ,前者灵敏度是用随机引物的30 倍。在模拟实验中用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物引导反转录,串联cDNARDA 技术,检测鉴别出感染细胞的BI - 3 和SRAS - Cov 核酸序列片段。此方法能从1μg 总RNA 中检测出3 ng 的外来RNA ,其检测灵敏度不及普通的PCR 检测方法,但对于检测鉴别在宿主细胞中复制,但不知其基因序列的poly A( - ) - RNA 病毒而言,也是一个可选择的方法。114 抑制消减杂交cDNA RDA 技术结合消减杂交和PCR 抑制作用〔19〕的技术原理,Diatchenks 等〔20〕等发展出了抑制消减杂交技术( suppressionsubtractive hybridization ,SSH) 。与前两种RDA 技术不同点在于,SSH 技术将内切酶酶切处理的T - cDNA 分为两份,分别接上不同序列的去磷酸化的接头1 和2 ,分别于过量的D - cDNA作第一轮杂交。杂交过程中两组中的单链T - cDNA 浓度趋同,T- cDNA 中的非靶序列单链cDNA 与D - cDNA 中相应序列形成杂交双链而被消减, T - cDNA 中差异表达的单链cDNA被显著富集。合并一轮杂交物,加入过量变性D - cDNA ,作第二轮杂交。合并的二组份一轮杂交物中剩下的趋同化、经消减杂交后的单链T - cDNA 能互补杂交, 可以形成: 原组内T- cDNA 单链间的杂交、T - cDNA 与D - cDNA 单链间的杂交、二组间T- cDNA 单链间的杂交。补齐杂交反应后双链cD2NA 末端,用分别与接头1 和2 的外侧部分序列互补的寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。二组份间T- cDNA 互补单链杂交物,因两端分别具有接头1 和2 ,可被指数扩增;T - cDNA 与D -cDNA 杂交物和剩余单链T- cDNA ,因一端具接头序列,被线性扩增;而同组间T- cDNA 杂交物两端具反转重复长序列,因抑制性PCR 效应,在PCR 反应循环中分子内退火形成稳定的“锅柄结构”〔19〕而不被扩增。因此,SSH 技术通过二轮消减杂交和抑制性PCR 特异扩增,使假阳性大大降低,提高了检出低丰度靶mRNA 的灵敏度。Hu 等〔21〕应用SSH 技术,结合反转录酶的模板切换(tem2plate - switching) 功能, 以HCV RNA 阳性血清体外感染的人MOLT- 4 急性淋巴母细胞白血病T 细胞系为模型,通过反转录合成全长cDNA、抑制性消减杂交、消减的cDNA 文库构建、反相斑点杂交筛选,在被筛的96 个克隆里,T- cDNA 探针杂交呈特异阳性的16 克隆中,序列分析后得到4 个插入HCV 序列的克隆。2 非特异多重引导滚环式扩增法乳头瘤病毒、痘病毒等,其基因物质为环状DNA 分子。在事前未知基因序列的情况下,发现和鉴别这类病毒核酸序列还可选择非特异多重引导滚环式扩增法(multiply primed rolling -circle amplification ,RCA) ,扩增、分离、获取其基因片段供进一步分析。自然状况下,环状DNA 经常以滚环方式进行复制。Dean等〔22〕应用随机6 聚核苷酸作引物,加入φ29 DNA 聚合酶,以质粒DNA 和噬菌体DNA 为模型,建立了多重引物引导的滚环式扩增法。φ29 DNA 聚合酶可长距离( > 70 000 nt) 地结合于DNA模板,进行链置换DNA 合成。而随机6 聚核苷酸引物可多位点的与单链环状DNA 互补复性。在φ29 DNA 聚合酶作用下,以随机引物引导,合成与模板互补的DNA 链。当合成链延伸到与模板结合的随机引物5′端时,在φ29 DNA 聚合酶的链置换活性作用下,下游被延伸的随机引物链被“甩”出模板。而上游的延伸链继续在环状模板上复制合成。同时,被从单链环状模板上“甩”出的互补链,又成为新的模板,随机引物与之结合,在φ29 DNA 聚合酶作用下,继续以枝杈的形式进行链延伸和链置换,最后以双链DNA 串联体形式释放。用此法可使1 ng 纯pCU18 环状DNA 模板延展式地扩增至107倍。Rector 等〔23〕以此原理建立了不依赖已知的特定基因序列(非序列依赖性) 的多重引导滚环式扩增环状DNA 病毒基因组方法,并应用其扩增获取了HPV 16 的基因组DNA。在接近实样的试验样品中,由于稀释倍数和环状DNA 分子较大等原因,将HPV 16 基因组DNA 扩增了214 ×104 倍。3 病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增病毒核酸可包裹于病毒外壳内,病毒的蛋白外壳或脂膜对病毒核酸具有保护作用。而病毒颗粒具有不同于细菌或其他真核细胞的理化特性。利用这样的特点Allender 等〔24〕和Stang等〔25〕各自建立了病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增方法(sequence - independent amplification) 。两种方法的共同点在于,依据病毒颗粒小、具一定密度,用0122μm 滤器过滤、或再串上超速密度梯度离心,从样品中分离出病毒颗粒,DNA 酶酶解游离的DNA ,裂解病毒颗粒,抽提获取较纯的病毒颗粒相关核酸。Allender 等〔24〕借鉴RDA 原理,对病毒颗粒相关核酸用限制性内切酶酶切后,作非序列依赖性单引物PCR 扩增( sequence -independent single primer amplification ,SISPA) :将抽提获取的DNA或RNA 分别补齐,合成第二链DNA ,或反转录,合成双链cDNA。限制性内切酶酶切后,酶切片段两端连接一种接头,并以与接头同序列的单一寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。扩增产物进一步克隆与序列分析。用此法检验HBV 阳性血清和GBV - B 阳性血清样品,结果在相当于106/ ml 个基因组拷贝浓度的50μl样品中,可重复试验检出相应的病毒基因片段。Stang 等〔25〕则在得到双链DNA 或双链cDNA 后加入k - 随机引物,此种引物5′端含有20 个固定序列的核苷酸,3′端则有·318 · 中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 核苷酸随机简并序列。与变性模板退火时,6 核苷酸随机简并序列随机地与模板相应序列互补退火,在T4 DNA聚合酶作用下作链延伸。然后在延伸产物中加入k - 随机引物中固定序列部分的20 寡核苷酸作引物,进行PCR 扩增。扩增产物电泳分析、克隆、测序。用此方法检验由实时- PCR 定量,包括病毒颗粒相关核酸及游离核酸在内的病毒基因组拷贝数为109/ ml 的Cox - 3 和MAV - 1 培养物。前者的12 克隆中,9 个克隆插入有肠道病毒的四个不同区域的同源基因片段;而6 个MAV - 1 中分离的克隆内,5 个含有99 % 同源MAV - 1 基因片段。基于病毒颗粒分离纯化、DNase 处理、病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增,获取、鉴定未知病毒的基因片段,尽管灵敏度不够高,但其实验时间较短,步骤相对简单,对于病毒拷贝数高,时间紧急的样品鉴别,是较适宜的一套方法。病毒的种类、结构、特性多种多样,感染病毒后需要检验的样品又各不相同,因此用于发现鉴别未知病毒的核酸序列的技术,也不是固定不变和完全通用的。以上的技术方法各有优缺点和适用范围。而针对扩增获取未知病毒基因组序列片断,这一发现鉴定未知病毒的分子生物学技术的要点或瓶颈,必然还会有新的改进、创新技术出现,将会更快、更灵敏、更简便、更准确的发现鉴别未知病毒。参 考 文 献〔1〕 Drosten C , Gunther S , Preiser W, et al1 Identification of novel corona2virus in patients with severe acute respiratory syndrome1 N Engl J Med ,2003 , 348 : 1967 - 19761〔2〕 ven den Hoogen BG, de Jong JC , Groen J , et al , A newly discoveredhuman pneumovirus isolated from young children with respiratory tractdisease1 Nat Med , 2001 , 7 : 719 - 7241〔3〕 Fouchier RA , Hartwig NG, Bestebroer TM, et al1 A previously unde2scribed coronavirus associated with respiratory disease in human1 ProcNatl Acad Sci U S A , 2004 , 101 : 6212 - 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PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。下面是我整理的关于pcr技术论文，希望你能从中得到感悟!
技术的研究进展
摘要 PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，已被广泛地应用于水产、微生物检测等许多领域。该文从PCR技术的原理及应用方面进行了综述，并对其发展做出了展望。
关键词 PCR技术;研究进展;应用
中图分类号 Q819 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2012)10-0047-02
PCR(polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。1985年，美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR(mutiplex PCR)技术[4]、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术[5]、单分子PCR技术[6]。
1 PCR技术原理
PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94 ℃的条件下变性解链;第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55 ℃退火;第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。
2 PCR技术的分类
在传统PCR技术的基础上，根据人们的需要以及各个领域的应用要求，又衍生出很多种类的PCR技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进，为进一步的研究提供了基础。
2.1 实时荧光定量PCR技术
1996年，学者经过研究，在传统PCR技术的基础上，首创了实时荧光定量PCR技术，新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃[8]。
荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[9]。实时监测这一特点是常规PCR技术所不具有的，因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[10-11]。一个PCR循环反应结束之后，定量PCR仪可以收集1个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况，这样就可以得到1条荧光扩增曲线[12]。荧光信号在指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析[13]。
2.2 多重PCR技术
多重PCR(mutiplex PCR)技术是PCR技术的一种，为同一管中加入多对特异性引物，与PCR管内的多个模板反应，在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段[14]。
在同一反应体系中，多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR的扩增效果[15]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率，如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR扩增效果[16]。
2.3 单分子PCR技术(SM-PCR)
单分子PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展的，基本循环过程相同，但在反应条件、模板数量、DNA 聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[17]。
单分子PCR技术反应中，DNA 模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应该严格控制GC的含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物[18]。由于单分子PCR技术反应的变性温度(96~98 ℃)大多比常规PCR技术(94 ℃)略高，因而对DNA 聚合酶热稳定性的要求也更加严格，需要有较好的热稳定性，以防止温度过高而使其失活。其变性时间(5~15 s)、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术[17]。
3 PCR技术的应用
3.1 PCR技术在水产上的应用
基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化，或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-time PCR技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK以及PEPCK表达量的影响[19-21]，研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据。孙淑娜等[22]研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响，表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer et al[23]以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料，采用实时荧光定量PCR技术，检测了P450aromA和P450aromB在不同组织的表达量，表明在各组织中均有2种基因的表达，但表达量显著不同，呈现组织特异性。
3.2 PCR技术在微生物检测上的应用
1990年，Bej et al[24]在利用多重PCR的方法检测了Leg-ionella类菌种和大肠类细菌，其结果是通过点对点方法固定的多聚dT尾捕捉探针和生物素标记的扩增DNA进行杂交来检测的。张志东等检测口蹄疫病毒(FMDV)持续性感染的带毒动物，表明实时荧光定量PCR技术具有快速检测、准确、客观等优势，较优于传统的检测方法[25-26]。Metzger-Boddien et al[27]对PCR-ELISA的方法进行了评价，结果显示，样品中沙门氏菌的检出率可以达到98%。
4 展望
传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用。多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用;未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面，其次是整合应用多重PCR与其他技术，必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。
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