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Front Oncol.  2020; 10: 586580. Published online 2020 Dec 10. doi:  循环单核细胞和组织驻留巨噬细胞都有助于 TAM 的积累。肿瘤细胞和基质细胞分泌的趋化因子，如 M-CSF 和CCL-2 ，可以诱导和募集单核细胞到肿瘤微环境。值得注意的是，已经发现 TAM 被骨肉瘤细胞释放的 IL-34 募集并大量浸润到骨肉瘤组织中。这些单核细胞在局部信号分子的刺激下可以分化为巨噬细胞。 与组织驻留巨噬细胞不同，活化的巨噬细胞会发展出显示不同极化状态和功能的特定表型。传统上，包括 M1 和 M2 表型的二分谱代表了巨噬细胞激活范围广泛的两个极化终端：经典激活的巨噬细胞 (M1)，受干扰素 -γ 、脂多糖 (LPS) 和 Toll 样受体 (TLR)刺激；和替代激活的巨噬细胞 (M2)，被细胞因子如 IL-4 和 IL-13 以及其他信号分子激活。  M1 样特征的 TAM 有可能杀死肿瘤细胞并增强免疫反应。然而，在大多数肿瘤中通常表现出 M2 样免疫抑制表型的 TAM 往往会 促进血管生成 并促进血管外侵袭和免疫逃逸，最终导致肿瘤进展和转移。 ①、TAMs 可以促进肿瘤血管生成。TAMs的含量与肿瘤血管的数量和密度呈正相关，分泌各种促血管生成因子，如 血管内皮生长因子 (VEGF)、成纤维细胞生长因子 (FGF) 和基质金属肽酶 9 (MMP-9)， 参与肿瘤血管生成过程。 ②、TAM 还可以 通过以下方式 介导免疫抑制与各种免疫效应细胞相互作用。目前有报道称，TAMs 表达程序性死亡 1 (PD-1) 和细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原-4 (CTLA-4) 的配体受体，可抑制 T 细胞的活化。TAMs 不仅可以产生免疫抑制性细胞因子（ IL-10 和转化生长因子 -β （TGF-  β ） ），还可以产生 CCL5、CCL20 和 CCL22 等趋化因子，将 调节性 T 细胞 募集到肿瘤组织中。 ③、TAMs 通过增加血管外渗、促进转移细胞的存活和生长以及抑制效应 T 细胞来支持肿瘤细胞的 侵袭和转移 。最终，在巨噬细胞的帮助下，在特定转移器官的远处部位建立了转移前生态位。 （略） 骨肉瘤微环境中的炎症被认为具有抗肿瘤作用。Coley's Toxins 含有热灭活的细菌或细菌产物，在 19 世纪后期被用于治疗骨肉瘤。炎症可能通过增加浸润巨噬细胞和分泌细胞因子的水平来增强抗肿瘤作用。 一项基于慢性细菌性骨髓炎小鼠模型的研究表明，感染 通过 调节巨噬细胞引发的先天免疫反应，增加了 TAM 的数量并抑制了小鼠肿瘤的生长。此外，巨噬细胞的消耗逆转了这些抗肿瘤反应。此外，感染上调炎性巨噬细胞的细胞因子分泌，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素 -γ （IFN-  γ ），并重新激活免疫系统对抗肿瘤反应以减轻骨肉瘤诱导的免疫抑制。虽然这些模型不能精确模拟骨肉瘤的局部炎症微环境，但这些临床前研究与上述临床数据一起，为巨噬细胞在骨肉瘤中的作用和炎症反应提供了新的认识。 首先，TAM 可以通过分泌细胞因子、生长因子和外泌体来维持细胞存活 。这些因素可能有助于激活抗凋亡程序和调节 CSC 活动。还发现巨噬细胞通过表达组织蛋白酶 B 和 S 部分地保护免受紫杉醇诱导的肿瘤细胞死亡。 其次，巨噬细胞诱导的免疫抑制也与肿瘤的化疗耐受性有关。德纳多等人。发现 CSF1R 拮抗剂 对巨噬细胞的抑制通过 CD8 + T 细胞依赖性机制提高了荷乳腺肿瘤小鼠对紫杉醇的存活率。此外，Ruffell 等人。证实 M2 型巨噬细胞分泌的 IL-10 抑制树突细胞表达 IL-12 ，从而 阻断 CD8 + T 细胞的反应 。 第三，巨噬细胞也可能影响血管化，间接调节肿瘤对化疗的敏感性。巨噬细胞中 VEGF-A 的清除导致血管生长正常化，并增强了肺癌肿瘤对环磷酰胺和顺铂等细胞毒性药物的敏感性 。 新辅助化疗反应不佳的骨肉瘤患者的肿瘤组织中浸润的 CD68 +细胞较高。此外，在化疗药物治疗后，巨噬细胞分泌IL-1β，可激活下游癌症信号通路，降低骨肉瘤对化疗药物的敏感性。  M2 型 TAM 分泌的 CCL18 促进骨肉瘤的增殖和转移,这些效应归因于 lncRNA UCA1/Wnt/β-catenin 通路的上调。M2 巨噬细胞通过分泌基质金属蛋白酶 12（MMP-12）促进骨肉瘤的转移，基质金属蛋白酶 12 已被公认为转移相关因子并参与降解细胞外基质。TAMs促进骨肉瘤细胞环氧化酶2（COX-2）的表达，激活COX-2/STAT3轴和上皮间质转化（EMT），促进骨肉瘤侵袭和肺转移。 人类骨肉瘤细胞产生的趋化因子配体 5 (CCL5) 的增加促进了巨噬细胞的募集。骨肉瘤表达的单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1，也称 CCL2 ） 通过以下途径 参与巨噬细胞募集和浸润的调控MCP-1/CCR2 轴。  M2 巨噬细胞相关细胞因子，如 IL10 和转化生长因子-β2 (TGFB2) ，并将巨噬细胞调节为促肿瘤 M2 表型。 CD47 被认为是一种“不要吃我”的信号，它与巨噬细胞表面的信号调节蛋白α (SIRP α )结合，导致吞噬作用逃逸和细胞死亡  Mifamurtide     激活巨噬细胞和单核细胞，增强杀瘤活性，抑制肿瘤生长和转移。可溶性细胞因子如 TNF-α 和 IL1-β 的诱导在 L-MTP-PE 对巨噬细胞的作用机制中起作用。 许多因素将 TAM 重新极化为 M1 样表型，例如 IFN-γ、IL-12，导致 STAT 信号通路的激活 。TLR 是抗原呈递细胞（包括巨噬细胞）表达的重要病原体识别受体。的TLR激动剂诱导M2转化为M1表型引发抗肿瘤作用。除了细胞因子和 TLR 激动剂外，还使用 抗 CSF1 和抗 CD40 等抗体来改变 TAM 极化 吉非替尼是一种表皮生长因子受体 (EGFR) 抑制剂， 通过 抑制巨噬细胞受体相互作用蛋白激酶 2 (RIPK2)改变肺巨噬细胞表型以阻止骨肉瘤侵袭并减少转移负担。

前言 骨肉瘤是最常见的原发性骨实性恶性肿瘤之一，好发于青少年和年轻人。患者的标准治疗包括化疗和手术。随着各种先进治疗方法的发展，患者的存活率大大提高了。然而，目前还没有已知的预防方法。因此，深入了解其发生机制，开发新的骨肉瘤治疗药物迫在眉睫。 N6-methyladenosine (m6A) 是真核生物mRNA中最丰富的可逆甲基化修饰。近年来，许多研究集中在m6a修饰的mRNA的生物学功能上。m6A修饰被发现参与多种生物学过程，并在癌症进展中发挥重要作用。如，FTO在急性髓系白血病(AML)中起着致癌因子的作用。ALKBH5已被证明与胰腺癌、胶质母细胞瘤有关，并影响雄性小鼠的生育能力。然而，对于m6A修饰在人骨肉瘤中的功能和潜在机制仍有很大程度的未知。 研究结果 1. m6A去甲基化酶ALKBH5在人骨肉瘤中下调 作者首先采用m6A ELISA和免疫荧光(IF)法定量人骨肉瘤细胞系U2OS、Saos2、143B和人成骨细胞(hOB) 细胞系中m6A的含量。结果显示，骨肉瘤细胞中m6A含量显著升高。此外，与hOB细胞相比，所有三种骨肉瘤细胞系中去甲基化酶ALKBH5 mRNA与m6A含量呈负相关显著降低，但在METTL3、METTL14、WTAP和FTO中无此现象。同时，免疫染色证实，与hOB细胞相比，U2OS、Saos2、143B骨肉瘤细胞系中的ALKBH5显著降低。此外，在人骨肉瘤组织中检测到ALKBH5的蛋白表达低于正常骨组织。我们进一步应用免疫组化(IHC)检测含102个组织芯的骨肉瘤组织微阵列(TMAs)中ALKBH5蛋白的表达。与正常骨组织相比，在恶性骨肉瘤核心部位，特别是IVB期（最高程度的骨肉瘤）检测到ALKBH5蛋白表达显著降低。来自TCGA数据集的Kaplan-Meier生存分析显示ALKBH5高表达的患者存活率较高，而低ALKBH5表达的患者存活率较低。以上结果表明，在人骨肉瘤中ALKBH5普遍下调，可能介导m6A修饰，在人骨肉瘤中发挥重要作用。 2. ALKBH5-依赖的 m6A去甲基化严重影响骨肉瘤细胞的生长和运动 为了确定ALKBH5调控m6A修饰是否在骨肉瘤细胞中起作用，作者分别过表达、敲降ALKBH5的表达来验证其细胞功能。我们检测了ALKBH5对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。与预期一致，过表达ALKBH5显著抑制U2OS细胞的增殖、侵袭和迁移能力，而抑制ALKBH5的表达则诱导相反的作用。此外，当ALKBH5过表达时，早期和晚期凋亡细胞百分比均显著增加，而ALKBH5敲低对细胞的凋亡影响甚微。细胞克隆实验也产生类似的结果。 3. 鉴定ALKBH5 / m6a - pre - miR - 181 - b - 1 / miR -181b-5p-YAP轴作为一种新的通路抑制骨肉瘤肿瘤的进展 （1）ALKBH5通过调控pre-miR-181b-1的表达水平抑制骨肉瘤细胞增殖 如上所示，作者已经证明了ALKBH5依赖的m6A rna去甲基化对骨肉瘤肿瘤抑制的重要性。接下来，进一步深入了解其具体的分子机制。MiRNA的加工过程也受到骨肉瘤的特异性调控。然而，尚无报道显示m6A修饰在骨肉瘤miRNA加工过程中的生物学功能。因此，作者使用m6A 芯片在对照和过表达ALKBH5的U2OS细胞中鉴定ALKBH5修饰的miRNAs前体。通过微阵列检测到773个pre- miRNA，鉴定出11个在ALKBH5过表达的细胞中，比对照细胞减少20%(>减少倍)的pre- miRNA。值得注意的是，在pre- mirna中，pre-miR-181b-1再过表达ALKBH5后，甲基化显著降低。更重要的是，pre-miR-181b-1序列在不同物种间广泛保守。这些发现表明在骨肉瘤中pre-miR-181b-1是ALKBH5的一个潜在的作用靶点。进一步发现，premiR-181b-1在m6A-RIP中富集，而在IgG-IP中不富集。此外，pre-miR-181b-1和成熟miR-181b-5p在骨肉瘤细胞中明显低于hOB细胞。过表达ALKBH5可显著增加U2OS细胞中premiR-181b-1和miR-181b-5p的表达水平。相反，抑制ALKBH5产生相反的效果。正如作者所猜想，miR-181b-5p导致细胞迁移和细胞增殖的减少。miR-181b-5p下调(AMO-181b-5p)部分挽救了U2OS细胞中ALKBH5过表达导致的细胞迁移和增殖下降。 （2）YAP是人骨肉瘤细胞中miR-181-5p的关键靶基因 然后通过计算预测寻找miR-181-5p候选靶基因。通过这种方式，作者发现Yesassociated protein 1 (YAP)是miR-181-5p潜在的靶基因。有报道称YAP是一种致癌基因，在多种肿瘤发生发展中具有重要作用。接下来，作者证实了过表达的miR-181b-5p确实直接抑制了其靶基因YAP在骨肉瘤细胞中的表达，且发现过表达ALKBH5明显抑制了U2OS细胞中YAP的mRNA和蛋白水平，而抑制ALKBH5则使YAP的表达升高。同时，作者证实了YAP对骨肉瘤细胞生长的影响。siRNA沉默YAP显著抑制了U2OS细胞的增殖、侵袭、迁移和集落形成能力。 （3）YAP消除了ALKBH5对骨肉瘤细胞活力和小鼠异种肿瘤生长的抑制作用 为探究ALKBH5与YAP的相互关系，作者进一步分析了细胞生长的影响。与单独过表达ALKBH5相比，ALKBH5与YAP共表达组的细胞增殖明显增加。YAP还抵消了ALKBH5对U2OS细胞侵袭和迁移的抑制作用，YAP显著提高了活细胞百分率，减少了凋亡细胞，恢复了集落形成能力。并且，作者利用异种骨肉瘤小鼠模型评估了ALKBH5介导的m6A去甲基化的体内有效性。肿瘤体积和重量的降低，证明了ALKBH5过表达降低了骨肉瘤肿瘤的生长，而这一效果通过共转染过表达的YAP而抵消。 4）m6A读取蛋白YTHDF2正调节pre-miR-181b-1的稳定 因为ALKBH5介导的m6A去甲基化似乎增加了pre-miR-181b-1的表达，猜想pre-miR-181b-1是YTHDF2（促进m6A甲基化RNA降解的m6A读取蛋白）的一个靶点，与作者的猜想一致，再YTHDF2-IP组分中观察到pre-miR-181b-1的强烈富集。进一步，在U2OS细胞使用siYTHDF2敲降其表达后，pre-miR-181b-1和miR-181b-5p的表达均增加。此外，siYTHDF2可进一步增强ALKBH5过表达的抑瘤作用。以上数据表明ALKBH5介导的pre-miR-181b-1 m6A去甲基化在骨肉瘤中起关键作用。 4. 鉴定YAP mRNA作为ALKBH5在骨肉瘤中的直接靶点 （1）ALKBH5直接调控YAP的mRNA和蛋白稳定性 有趣的是，根据基于序列的m6A修饰位点预测网站( SRAMP)，作者观察到YAP基因的mRNA携带9个潜在的m6A修饰位点。接下来作者验证了ALKBH5是否可以直接调控YAP的m6A甲基化和基因降解。采用基因特异性m6A-qPCR检测YAP的表达。过表达ALKBH5后，m6A- RIP组YAP mRNA中m6A丰度明显降低，IgG-RIP组未见明显变化。此外，与siNC组相比，siALKBH5在转录抑制剂actinomycin D (ActD)存在的情况下增强了U2OS细胞中YAP mRNA的稳定性。同时，siALKBH5在翻译抑制剂环己酰亚胺(CHX)的作用下抑制了YAP的降解。然而，过表达ALKBH5产生相反的作用，导致骨肉瘤细胞中YAP-mRNA稳定性显著下降，YAP蛋白降解增加。 （2）m6A-依赖的YAP的翻译增强与YTHDF1呈正相关 以上结果表明，ALKBH5介导的m6A去甲基化抑制了YAP的表达，我们推测甲基化的YAP转录本是YTHDF1（促进甲基化转录本翻译的m6A读取蛋白）的潜在靶点。与IgG-RIP组相比，YTHDF1组YAP mRNA中的丰度明显增加，说明YTHDF1能够识别YAP mRNA中的m6修饰位点。接下来，作者发现YTHDF1 siRNA (siYTHDF1)降低了YAP蛋白水平。且在ALKBH5过表达的U2OS细胞中，过表达YTHDF1导致YAP增加。此外，与预期一致，上调YTHDF1水平可部分恢复对U2OS细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡和集落形成能力的抑制作用。 总结 总的来说，作者的结果首次表明ALKBH5是一种抗肿瘤或促凋亡因子，至少部分地通过直接m6A甲基化YAP及甲基化pre-miR-181b-1间接下调YAP水平的双机制抑制YAP的表达来发挥作用。同时，作者也证明了pre-miRNAs可以被ALKBH5甲基化调控其成熟加工的过程。