癌症队列研究应用论文

期刊：Cell；影响因子：   发表单位：休斯敦贝勒医学院     肿瘤与正常组织之间的蛋白质组差异对于癌症生物标志物的发现至关重要，但尚未在大型结肠癌肿瘤队列中进行系统表征。在这篇《Cell》文章中，报道了110例结肠癌患者的遗传、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的综合信息。通过比较分析和多组学数据的整合，发现了许多新的生物标志物和药物靶标，以推进精确治疗。     这篇文章为我们展现了多维组学服务于临床治疗的巨大潜力，并强调系统整合多组学分析能够揭示仅通过基因组评估无法获得的潜在临床价值。特别是，蛋白质组学能够发现基因组学不能发现的治疗靶点和致病机制，是需要临床疾病研究重要的前进方向。     对前瞻性收集的结肠癌队列进行了首次蛋白质组学研究。对配对的肿瘤和正常相邻组织进行的蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析比较，得出了与结肠癌相关的蛋白质和磷酸位点，包括已知和推定的新生物标记、药物靶标以及癌症/睾丸抗原。蛋白质组整合不仅将基因组推断的靶标（例如拷贝数驱动器和突变衍生的新抗原）确定为优先事项，而且还产生了新发现。磷酸蛋白质组学数据将Rb磷酸化与结肠癌的增殖增加和凋亡减少相关联，这解释了为什么这种经典的抑癌基因在结肠肿瘤中被扩增，并为在结肠癌中靶向Rb磷酸化提供了理论依据。蛋白质组学确定了在高度微卫星不稳定性（MSI-H）肿瘤中CD8 T细胞浸润减少和糖酵解增加之间的关联，这表明糖酵解是克服MSI-H肿瘤对免疫检查点封锁抵抗的潜在目标。蛋白质组学为生物学发现和治疗发展提供了新途径。 结肠癌相关蛋白和磷酸化位点的系统鉴定； 蛋白质组学支持的新抗原和78％的肿瘤中的癌症/睾丸抗原； Rb磷酸化是结肠癌的致癌驱动力和可能的靶标； 糖酵解抑制可能使MSI肿瘤对检查点封锁更敏感。     第一部分是样本整体概述。收集了110例结肠癌患者的肿瘤标本、配对的正常相邻组织（NAT）和血液样本，进行了全外显子测序、拷贝数阵列、RNA-Seq、miRNA-Seq、蛋白质组学和磷酸蛋白组学分析。与TCGA队列结肠肿瘤相比，mRNA表达谱高度相关，蛋白组的主成分分析显示肿瘤和NAT的有效区分。证实蛋白质组学在评估基因功能方面的附加价值。    首先描述了样本的体细胞突变特征和微卫星不稳定性，并根据突变频谱区分患者亚群以及鉴定显著突变基因。随后对基因突变与蛋白组的关联进行了分析，揭示一些高协同的基因。APC中的终止和移码突变导致无义的mRNA衰变或蛋白被截断，TGFBR2中移码突变导致磷酸位点TGFBR2-S553的丰度降低了。高迁移率组（HMG）转录因子SOX9蛋白水平明显过表达，大多数截短突变都发生在HMG-box域的下游和进化保守的泛素靶位点K398的上游，通过截短的突变去除K398泛素化位点可以稳定SOX9蛋白并增加蛋白丰度，支持SOX9在原代CRC细胞中的致癌作用而非肿瘤抑制作用。     该部分主要通过体细胞突变分析寻找并描述结肠癌中显著突变基因的特征，以及联系突变位点和蛋白表达和磷酸化水平的变化提示仅凭突变无法预测蛋白功能复杂性。    进行体细胞拷贝数改变（SCNA）分析，确定了与TCGA队列非常相似的臂级SCNA，包括1q、7p/q、8p/q、13q和20p/q的扩增，以及1p、14q、15q、17p/q、18p/q和22q的缺失。队列中发现了先前大量报道的SCNA，第20号染色体（、、）和第18号染色体（）中分别包含最频繁扩增和缺失的焦点区域，还确定了18q局灶性缺失区域中的著名肿瘤抑制物SMAD4。SCNA与mRNA和蛋白质丰度的相关性比蛋白质丰度更强。SCNA基因和显著突变基因显著富集的术语包括细胞增殖、细胞死亡、Hippo信号通路。位于整个基因组不同局灶性缺失区域的六个基因富集了内吞作用，表明多个缺失事件会收敛以抑制内吞途径，这可能使肿瘤获得生长信号的自给自足。     继续描述基因组全局的拷贝数变异特征，并讨论了拷贝数变异区域中的一些重要基因，及对拷贝数扩增和或缺失水平、mRNA和蛋白丰度作了关联。结合富集分析阐述突变基因或扩增/缺失基因参与的通路激活或抑制是否与肿瘤信号有关。    成视网膜细胞瘤（RB1）基因的蛋白（Rb）是一种肿瘤抑制因子，Rb的丢失会通过消除细胞增殖的阻碍而促进细胞不良行为并促进癌变。然而在结肠癌中，发现Rb的扩增和过度表达与其在其它癌症中的频繁突变和缺失相矛盾，值得深思。通过观察Rb的磷酸化，发现即使细胞中有更多的RB1拷贝或表达水平，但Rb蛋白由于被高度磷酸化而失活，这种构型使其不像肿瘤抑制因子一样起作用。     抑癌基因RB1由于同时的高度磷酸化而失活，因此高拷贝或高丰度并未表现出抑癌功能，蛋白组和磷酸化联合分析颠覆了单一基因组或蛋白组学的一般推论，这是多组学分析优势所在。    作者分析了肿瘤和正常组织之间的差异蛋白，并将分析的重点放在肿瘤中升高了2倍以上的31种蛋白上，这些蛋白被定义为结肠癌相关蛋白。这31种蛋白质与人类分泌蛋白、膜蛋白质组和酶相关联，发现这些蛋白质中有15种具有临床实用性，可作为诊断标志物、结果标志物或治疗靶标，包括临床实践中使用最广泛的CRC标志物CEACAM5。还根据磷酸化位点丰度的差异，定位了与癌症相关的50种蛋白质的63个磷酸位点，其中4种符合与癌症相关的蛋白质的标准。蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学数据的互补提示可寻找基因组研究中遗漏的结肠癌基因。激酶底物富集分析鉴定了4种激酶，除了已知的药物靶向激酶CDK、MELK和PFKFB3外，激酶PI4KB作为新的候选治疗靶点可能值得进一步研究。     该部分集中在蛋白组，通过传统的差异分析、功能富集等比较并鉴定了结肠癌肿瘤中的标志物蛋白和磷酸位点。通过进一步联系已知的药物研究，提供了潜在的治疗靶点。    综合考虑转录组、蛋白质组以及MSI分型各因素占比，总结得三个新的结肠癌分子亚型特征，并根据其将结肠癌病人分为四个亚型，且对每个亚型的特征展开研究。其中CIN亚型的肿瘤显示出更高的染色体不稳定性。许多miRNA和磷酸位标记与亚型特异性特征具有已知关系，包括在MSI亚型中miR-552、miR-592和miR-181d的表达降低，在间充质亚型中miR-200家族的表达降低， MSI和间充质亚型中STAT1和STAT3的磷酸化水平分别升高。CIN亚型中RB1的拷贝数更高，且Rb-S811和S807显著增加，并进一步表明CDK2抑制在CIN亚型中可能是最有效的。管MSI和间充质亚型均比CIN亚型具有更高的免疫浸润性，但MSI亚型特别富含细胞毒性免疫细胞。MSI亚型中的糖酵解酶广泛增加，揭示了蛋白质水平的适应性在MSI亚型中产生了强烈的Warburg效应，并建议将检查点和糖酵解抑制相结合的治疗可能为治疗对检查点封锁有抵抗力的MSI肿瘤提供有效的策略。     最后是肿瘤分子亚型及其特征分析，这在大规模肿瘤组学研究中是必不可少的，以试图为不同亚型的患者制定更合适的靶向治疗方案提供线索。    本篇研究对人类结肠癌进行了前所未有的分子表征，证实了蛋白质组学整合在揭示新型癌症生物学中的价值，并进一步证明了蛋白质组学在治疗假说产生中的实用性。     除了加强或补充基因组数据外，蛋白质组学整合还可纠正基于基因组数据的不准确推论，并带来意想不到的发现和治疗机会。一个例子是蛋白质组学将SOX9鉴定为致癌基因，而根据体细胞突变数据预测它是一种肿瘤抑制因子。另一个例子是磷酸蛋白质组学数据使Rb磷酸化成为结肠癌的致癌驱动因素，这表明通过CDK2抑制靶向结肠癌中Rb磷酸化的独特机会。     基于多组学的亚型分析提供了基于三种UMS亚型（即MSI、CIN和间充质）的结肠癌分子异质性的统一视图。蛋白质组学数据将MSI肿瘤中CD8浸润减少与糖酵解增加相关联，这支持了新出现的观点，即肿瘤糖酵解增加会损害T细胞功能并增加肿瘤微环境来抑制抗肿瘤免疫力，因此可以考虑通过糖酵解抑制来克服MSI肿瘤对免疫检查点封锁的抵抗力。     综合蛋白质组学表征揭示了靶向结肠癌治疗中信号蛋白、代谢酶和肿瘤抗原的新治疗机会。尽管这些治疗假说的验证不在当前研究的范围之内，但这些新假说最终可能使结肠癌的分子指导精确治疗取得实质性进展。

m6A RNA甲基化是最常见、最丰富的真核生物mRNA转录后修饰。研究表明，m6A 在不同组织，细胞系中是一个复杂的调控网路，m6A RNA 甲基化参与 RNA 的代谢过程，并与肿瘤的发生和发展密切相关。本期着重解读两篇癌症中的 m6A 研究，看一下 m6A RNA 甲基化如何玩转高分期刊。 2020年10月，南京医科大学汪秀星课题组和美国 UCSD Jeremy Rich 等课题组在Cancer Discovery上发表题为“The RNA m6A reader YTHDF2  maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells”的研究论文。该研究为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。 研究背景 胶质母细胞瘤（GBM）代表了最常见的原发性，内在性脑肿瘤，患者的平均生存期限制在一年以上。鉴于胶质母细胞瘤干细胞（GSC）在治疗抗性，血管生成，免疫逃逸和侵袭中的作用，临床和临床前观察表明，靶向GSC可以改善肿瘤预后神经肿瘤学上的精准医学研究。 研究方法 研究结果 1. 在 GSC 中上调的致癌转录本以 RNA m6A 修饰为标志 作者利用 MeRIP-seq 对 GSC 和神经干细胞（NSC）进行 m6A 标记的检测，结果发现，与非肿瘤对应物相比，GSCs 的m6A 分布发生了改变。通过38个 GSCs 和5个 NSCs 的队列中的 RNA-seq 数据进行 GSEA 分析，具有 m6A 峰的基因在GSC 高度富集，而且在 GSC 中获得的具有 m6A 峰的基因均被上调。相反，相对于 NSC、GSC 中丢失 m6A 峰的基因通常在 GSC 中被下调。而且，在 GSC 中，与癌症干细胞相关的重要基因上获得了 m6A 峰，包括表达增加的 OLIG2  和 MYC 。 2.  YTHDF2  在 GSC 中表达上调，对 GSC 的维持至关重要 作者为研究 m6A YTHDF  在胶质母细胞瘤中的功能作用，利用 CRIPR 技术检测了 YTHDF2 ，相对于对照 sgRNA，敲除 YTHDF2  会降低细胞活力及减少 GSCs 中细胞球形成。为研究了 YTHDF2  耗竭是否会诱导 GSC 分化，正交实验发现，shRNA 介导的 YTHDF2  敲低会降低 GSC 的活性，过表达的 YTHDF2  可以挽救 GSC 的活性。结果表明， YTHDF2  是胶质母细胞瘤维持的一个特异性和有效的调节因子。 3.  YTHDF2  通过 m6A RNA 修饰支持 GSCs 中的基因表达 作者利用 RNA-seq 检测 YTHDF2  的下游靶点，敲除 YTHDF2  可引起 GSCs 中广泛基因表达的改变， MYC  靶点显著富集，而且，GSCs 中获得 m6A 峰的基因更频繁地下调。通过 qPCR 也验证了 YTHDF2  敲除对 MYC、VEGFA  mRNA 水平降低的作用。为了预测 YTHDF2  在 GSCs 中的作用，作者结合 TCGA 胶质母细胞瘤基因表达数据，发现 YTHDF2  相关基因 MYC  和 E2F  靶点以及 G2M  调节因子和氧化磷酸化介质高度富集。这些数据表明 YTHDF2  作为与 m6A 差异修饰相关的转录程序的调节因子。 4.  YTHDF2  通过保持  MYC  转录稳定发挥 GSC 特异性依赖作用 为了确定 YTHDF2  介导作用于 GSCs 中 MYC 的特异性，作者比较了在 NSCs 和 GSCs 之间 YTHDF2  缺失的影响。NSCs 中 YTHDF2  敲低并不影响 MYC mRNA 水平，但降低了 GSCs 中 MYC mRNA 水平。而且， YTHDF2  耗竭降低了GSC 的活性，而不影响 NSCs。因此， YTHDF2  代表了一种 GSC 特异性依赖，通过 MYC  基因的特异性稳定支持胶质母细胞瘤的生存。 5.  IGFBP3  是 GSCs 中  YTHDF2-MYC  轴的下游靶点 因为 IGFBP3  是 YTHDF2  耗尽后最高下调基因之一，作者研究了 IGFBP3  是否调控 YTHDF2-MYC  轴下游的细胞活力。 IGFBP3  的缺失降低了 GSC 的活性和细胞球形成。 IGFBP3  过表达挽救了 GSCs 免于 YTHDF2  下调介导的细胞死亡。最后，作者利用20个胶质母细胞瘤和20个非肿瘤脑组织中 IGFBP3  的表达进行验证，观察到 GSC 中 IGFBP3  mRNA 表达升高。结果表明， IGFBP3  是 GSCs 中 YTHDF2-MYC  信号轴的关键下游效应子。 6.  YTHDF2-MYC-IGFBP3  轴促进体内肿瘤生长 为了探讨在体内靶向 YTHDF2  治疗的潜在益处，作者利用 CRISPR 敲除技术对原位异种移植物的小鼠进行检测。结果表明，与携带对照 sgRNA 的 GSCs 的小鼠相比，敲除 YTHDF2  延长了肿瘤潜伏期并减少了肿瘤体积。 IGFBP3 过 表达恢复了 YTHDF2  缺失的 GSCs 体内成瘤能力。 研究结论 通过结合体外和体内的 GSCs 研究，该研究阐明了 m6A 介质在 GSCs 中的功能，并确定 YTHDF2  是 GSCs 特异性依赖，通过稳定 MYC  转录物调控 GSCs 中的葡萄糖代谢。这些发现为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。 2020年4月，上海交通大学医学院附属仁济医院洪洁团队在 Molecular Cancer 上发表了题为“m6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression”的研究论文。研究表明，靶向 METTL3  及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。 研究背景 结直肠癌 (CRC) 是全球第四大常见恶性肿瘤和第三大癌症死亡原因，而以乳酸作为糖酵解的最终产物，被认为是治疗癌症的一种有前途的方法。m6A 调控基因的改变在多种人类疾病的发病机制中起着重要的作用，但 m6A 修饰是否在 CRC 的葡萄糖代谢中起作用尚不清楚。 研究方法 研究结果 1.  METTL3 与结直肠癌糖酵解密切相关 为了探讨结直肠癌（CRC）中 m6A 修饰与糖酵解代谢之间的相关性，作者对47例 CRC 患者进行 RT-PCR分析，CRC患者中FDG 摄取与 METTL3  表达之间存在最显着的相关性。进一步分析发现 CRC 患者中 FDG 摄取与 METTL3  免疫组化染色存在显著相关性。最后，作者利用 RNA-seq 比较 METTL 3 敲除和野生型(WT) HCT116 CRC 细胞的基因表达谱， METTL3 敲除细胞表现出更高的 METTL3 表达。这些结果表明 METTL3  可能介导 CRC 患者糖溶解代谢和癌变。 2. METTL3  在结直肠癌中促进糖酵解代谢 为了弄清 METTL3  的改变是否直接影响糖酵解代谢，研究发现敲除 METTL3  可显著降低 HCT116 和 SW480 细胞的胞外酸化速率(ECAR)水平，过表达 METTL3 显著提高了 DLD1 细胞的乳酸生成、葡萄糖吸收和 ECAR  水平。为了阐明 Mettl3  诱导的 CRC 糖酵解是否依赖于其甲基转移酶功能，作者通过 Mettl3  野生型和突变型的研究，发现 Mettl3  的 MTase 结构域的缺失阻断了 Mettl3  诱导的糖酵解过程。这些数据表明 Mettl3 通过其甲基转移酶结构域调控结直肠癌糖酵解代谢。 3. 在结直肠癌中， METLC3  诱导的增殖依赖于糖酵解的激活 METLC3  的敲除消除了 HCT116 细胞的细胞增殖和集落形成，并且降低了 HCT116 肿瘤的生长和异种移植小鼠模型中的肿瘤重量。在功能分析中， METTL3  的过表达增加细胞增殖、集落形成、肿瘤的生长和肿瘤的重量。2-DG（糖酵解途径的抑制剂）处理在体外和体内显着阻断了 METTL3  诱导的细胞增殖和菌落形成，这些结果表明 Mettl3 通过调控结直肠癌糖代谢促进 CRC 进展。 4. METTL3  在结直肠癌中的潜在靶点 为了鉴定 METTL 3 的潜在靶标，作者选择了 METTL3  敲除和 WT HCT116 细胞进行 MeRIP-seq和RNA-seq，最常见的motif ' GGAC '在 m6a 峰中显著富集，大部 分 METTL3  结合位点位于 CDS区，在 5'UTR 和 3'UTR 高度富集，并且 m6A在转录水平上发生了全局低甲基化。联合RNA-seq数据，确定了429个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被下调，595个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被上调。基于甲基化水平与 mRNA 表达水平都下降，找到与糖酵解密切相关的靶基因 HK2  和 SLC2A1(GLUT1) 。 6.  HK2  和  SLC2A1  是  METTL3  在 CRC 中重要的功能靶基因 作者通过 HCT116 WT 和 mettl3  敲除细胞转染 control、 HK2  或 SLC2A1  过表达实验发现， HK2  或 SLC2A1  的异位表达部分恢复了敲除 mettl3  细胞的增殖、集落形成能力和肿瘤生长，而且，也能恢复 HCT116 mettl3  敲除细胞中乳酸产量的下降。同时，在体外和体内，过表达 SLC2A1  显著恢复了 HCT116 mettl3  敲除细胞葡萄糖摄取下降的趋势。因此， HK2  和 SLC2A1 介导了 CRC 细胞中 METLL3 的调节功能。 研究结论 METTL3  是 CRC 的一种功能性和临床致癌基因。 METTL3  通过 m6A- IGF2BP2/3— 依赖机制稳定 CRC 中 HK2  和 SLC2A1 的表达。靶向 METTL3  及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。 参考文献 [1] Dixit D, Prager B, GimpleShen R, et al. The RNA m6A reader YTHDF2  maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells[J]. Cancer Discovery, 2020. [2] Shen C, Xuan B, Yan T, et al. M6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression[J]. Molecular Cancer, 2020, 19(1).