western论文检测

固相支持物包括NC（硝酸纤维素）膜、尼龙膜及PVDF（聚偏氟乙烯）膜等。通常使用的PVDF膜的规格是 μm，如果靶蛋白的分子量小于10KD，则选用μm的PVDF膜。转膜的的方式有湿转和半干转。用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与膜进行杂交，使抗体与靶蛋白特异性结合后，再与经辣根过氧化物标记的二抗结合，最后用ECL试剂反应，经X线片曝光、显影等一系列反应，达到检测靶蛋白的目的。

一.实验步骤1. 组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟5. 移入离心管4℃ 约20,000 g（约15,000转）15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液9. 沸水浴中3分钟10. 上样11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色14. Westernblot 试剂盒显色15. 分析比较记录western blot的实验步骤及注意事项的资料1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜）9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。10. 将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。11．按步骤9洗涤。12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS），于室温下摇动。注意事项：western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。Western可以参考如下步骤进行操作。1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白.(3) 上样与电泳冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。3. 转膜(Transfer)我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。4. 封闭(Blocking)转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以在4℃ 封闭过夜。在整个Western过程中我们推荐使用碧云天生产的侧摆摇床，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。7. 蛋白检测(Detection of proteins)参考相关说明书，使用BeyoECL, Western 荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白。洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。8. 膜的重复利用(Membrane recovery)如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。

上一期我们聊了期刊杂志的新要求，总结如下： ▶  不建议跑平行胶，因为平行胶和剥离膜，孵育体系，操作条件的不一致，影响定量的准确性，因此最好内参和目的蛋白要在同一张印迹膜上。 ▶  选择宽动态范围的方法，确认信号强度与所上样量之间的线性关系，例如用胶片做化学发光方法的动态范围就很窄，不建议使用。 ▶  强烈推荐使用总蛋白进行归一化，因为看家蛋白容易受处理条件影响而发生变化，影响定量的结果，使用总蛋白定量更真实地反映目标蛋白表达量的变化。 ▶  提交原始数据，例如：JBC，PLOS和CELL等杂志都要求要提供原始数据。 Azure公司除了有Sapphire双模式多光谱激光成像系统可满足需求， Azure600多功能分子成像系统也可帮助您获得期刊杂志要求的Western Blot数据： ▶ Azure600标配有5个荧光光源，可同时在一张印迹膜上进行4通道荧光成像 ，同时也具有高灵敏化学发光检测功能，灵敏度可达fg级 荧光Western Blot使用荧光基团标记的二抗进行检测，膜上的靶标蛋白浓度与可见荧光信号强度呈线性关系，实现真实可靠的定量分析。荧光染料发射光谱不同，因此在一张印迹膜上可实现多个蛋白检测。这样目标蛋白和内参蛋白在同一张膜上，可以避免数据造假的情况发生，更容易被期刊杂志接收。 图1：通过使用四种光谱不同荧光基团标记的二抗，可以同时检测多达四种不同的蛋白。HeLa细胞裂解物上样， Anti-Tubulin (550nm, 绿色), Anti-Actin (700nm红色), Anti-GAPDH (800nm, 灰色), 和Anti-Transferrin (490nm, 蓝色)这四种蛋白同时成像，没有交叉。 ▶ Azure600近红外采用激光光源， 激发强度大，单色性好，减少光泄漏，在更短的时间内达到更好的信噪比，Western Blot精准定量的金标准 ▶ Azure600配合AzureRed总蛋白荧光染色剂可以做总蛋白归一化和定量三个靶标蛋白，生成可以信赖的定量Western Blot数据 使用总蛋白归一化，以校正泳道和样品之间的差异。传统的方法无法准确知道条带灰度值和强度的变化是由于样品的生物学变化引起的，还是由于上样不一致性或样品制备的差异引起的。总蛋白定量的优势如下： ★ 总蛋白比看家基因等内参的线性检测范围更宽； ★ 在整个实验和系统中更加稳定； ★ 能有效排除实验条件和体系对结果的影响； ★ 更真实地反映目标蛋白表达量的变化。 图2.总蛋白归一化和定量三个靶标蛋白. Tubulin 红色通道, Actin 蓝色通道, GAPDH绿色通道, AzureRed/Total protein 用灰色表示 图3.使用总蛋白对Tubulin信号进行归一化纠正上样误差 ▶Azure600标配的高分辨CCD，动态范围可达，保证结果的准确性 图4.过饱和检测可防止定量误差，相同的印迹膜分别使用胶片成像和Azure成像系统， Azure成像系统具有过饱和提醒，自动计算曝光时间以避免饱和 ▶ Azure600可做彩色Marker与化学发光条带的自动整合，分子量查看更直观 ▶ Azure600提供原始数据16bit的tiff图给到期刊，这里的tiff原始数据是指未经裁剪，像素修改，对比度调整等任何操作的图，保证结果的真实性和可靠性 Azure600除了进行荧光印迹膜，化学发光印迹膜检测外，还可以进行普通凝胶成像，EMSA检测，菌落筛选，小动物成像，植物成像等。