微生物检测中新技术的应用论文

PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。下面是我整理的关于pcr技术论文，希望你能从中得到感悟!

技术的研究进展

摘要 PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，已被广泛地应用于水产、微生物检测等许多领域。该文从PCR技术的原理及应用方面进行了综述，并对其发展做出了展望。

关键词 PCR技术;研究进展;应用

中图分类号 Q819 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2012)10-0047-02

PCR(polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。1985年，美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR(mutiplex PCR)技术[4]、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术[5]、单分子PCR技术[6]。

1 PCR技术原理

PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94 ℃的条件下变性解链;第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55 ℃退火;第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。

2 PCR技术的分类

在传统PCR技术的基础上，根据人们的需要以及各个领域的应用要求，又衍生出很多种类的PCR技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进，为进一步的研究提供了基础。

实时荧光定量PCR技术

1996年，学者经过研究，在传统PCR技术的基础上，首创了实时荧光定量PCR技术，新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃[8]。

荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[9]。实时监测这一特点是常规PCR技术所不具有的，因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[10-11]。一个PCR循环反应结束之后，定量PCR仪可以收集1个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况，这样就可以得到1条荧光扩增曲线[12]。荧光信号在指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析[13]。

多重PCR技术

多重PCR(mutiplex PCR)技术是PCR技术的一种，为同一管中加入多对特异性引物，与PCR管内的多个模板反应，在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段[14]。

在同一反应体系中，多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR的扩增效果[15]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率，如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR扩增效果[16]。

单分子PCR技术(SM-PCR)

单分子PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展的，基本循环过程相同，但在反应条件、模板数量、DNA 聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[17]。

单分子PCR技术反应中，DNA 模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应该严格控制GC的含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物[18]。由于单分子PCR技术反应的变性温度(96~98 ℃)大多比常规PCR技术(94 ℃)略高，因而对DNA 聚合酶热稳定性的要求也更加严格，需要有较好的热稳定性，以防止温度过高而使其失活。其变性时间(5~15 s)、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术[17]。

3 PCR技术的应用

PCR技术在水产上的应用

基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化，或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-time PCR技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK以及PEPCK表达量的影响[19-21]，研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据。孙淑娜等[22]研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响，表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer et al[23]以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料，采用实时荧光定量PCR技术，检测了P450aromA和P450aromB在不同组织的表达量，表明在各组织中均有2种基因的表达，但表达量显著不同，呈现组织特异性。

PCR技术在微生物检测上的应用

1990年，Bej et al[24]在利用多重PCR的方法检测了Leg-ionella类菌种和大肠类细菌，其结果是通过点对点方法固定的多聚dT尾捕捉探针和生物素标记的扩增DNA进行杂交来检测的。张志东等检测口蹄疫病毒(FMDV)持续性感染的带毒动物，表明实时荧光定量PCR技术具有快速检测、准确、客观等优势，较优于传统的检测方法[25-26]。Metzger-Boddien et al[27]对PCR-ELISA的方法进行了评价，结果显示，样品中沙门氏菌的检出率可以达到98%。

4 展望

传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用。多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用;未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面，其次是整合应用多重PCR与其他技术，必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。

5 参考文献

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微生物检验技术试验教学是重要的组成部分,该学科具有较高的实践应用性,下面我给大家分享微生物检验技术论文，大家快来跟我一起欣赏吧。

微生物检验技术在感染控制中的应用

摘要：目的：对微生物检验技术在感染控制中的应用价值进行探讨和研究。

方法：选取我院2012年1月-2013年6月收治的尿路感染患者288例，经中段尿培养临床分离的大肠埃希氏菌288株，随机分成两组，每组144株，其中进行常规治疗的同时进行微生物检验的一组设为观察组，另一组只进行常规治疗设为比对组。对微生物检验的临床感染控制中的应用价值进行研究和探讨。

结果：观察组患者的感染率、感染程度均明显低于比对组患者，P<，差异具有统计学意义。

结论：微生物检验对感染的发生率有明显的降低，对临床感染的控制和治疗有明显的提高，具有较好的临床价值，值得在临床中广泛推广和应用。

关键词：微生物检验感染控制监测

【中图分类号】R9 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801(2013)09-0470-02

随着现代医学技术的不断提高，许多化学药物治疗、介入性治疗和放射性治疗等在临床中的应用也日益广泛，而这些治疗容易引发耐药菌株的出现，导致医院感染的发生率逐年增高。患者在医院治疗的过程中，发生感染，并且出现感染的临床症状，这便是医院感染，这种感染一般情况下，具有一定的潜伏期，因此，只要患者的感染症状具备医院感染的范畴，都属于医院感染。医院感染已经成为医学领域亟待解决的重要问题，我院于2012年1月-2013年6月，选取收治的尿路感染患者288例，对微生物检验技术在感染控制中的临床应用效果进行研究，效果显著，现报道如下。

1资料与方法

一般资料。选取2012年1月-2013年6月，我院收治的尿路感染患者288例，经中段尿培养临床分离288株大肠埃希氏菌，随机分成两组，每组144株。其中，男性患者156例，女性患者132例，年龄在2-58岁，平均年龄为(±)岁。住院时间平均(±)天。两组患者在年龄、性别和住院时间等临床资料都没有没有明显的差异，P>，具有可比性。

方法。观察组的144例患者采集的144株大肠埃希氏菌，采用微生物检验技术进行检测。具体操作如下：①采用ID32E试条，对大肠埃希氏菌标本进行纯菌种后，进行细菌鉴定;②采用ATB-5试条进行药敏实验;③检测时使用法国梅里埃半自动微生物分析仪进行;④采用K-B法进行确诊实验;⑤观察组患者根据检验结果进行药物治疗，比对组进行常规治疗。

统计学处理。软件;t检验;P<，具有统计学意义。

2结果

观察组患者经过微生物检验结果显示，感染程度和感染率均低于比对组患者，P<，具有统计学意义，详见表1和表2。

3讨论

随着各种化学药物治疗、介入性治疗以及放射性治疗、抗生素等在临床中的频繁应用，致使医院感染现象频发，发生率逐渐增高，严重影响着患者的健康，因此，对于医院感染的诊断势在必行。目前，诊断最为精确地方法是微生物检验技术，通过检验可以为医生提供更多，更准确的诊断信息，为医生制定进一步治疗的科学依据。尿路感染的诊断标准为：患者出现尿频、尿急和尿痛、以及尿不尽等现象，但是情况不严重，只是偶尔出现，尿液中细菌尿、血尿、气尿和脓尿等情况都只是微量的，患者也出现比较轻微的腰部酸痛，这种情况为轻度感染;患者出现经常性的尿频、尿急、尿痛和尿不尽，尿液中出现细菌尿、血尿、气尿和脓尿等现象比较多，患者出现腰部酸痛，但是还能够忍受，这种情况为中度感染;患者开始出现频繁的尿急、尿频、尿痛和尿不尽现象，患者甚至无法自身控制，尿液中细菌尿、血尿、气尿和脓尿等现象严重，患者腰部酸痛无法忍受，这种情况为重度感染。

微生物检验已经成为当前医学领域研究的重要方向，成为最重要的生命科学之一。通过微生物检验可以对临床感染进行有效的监测，指导进一步的临床感染的诊治，以及抗生素的合理使用。控制医院感染的重要途径，要从传染源、传播途径和易感人群三个方面进行，才能有效的控制感染的发生率。在医院里，不管是患者，还是医生、护士，甚至是医院的环境都可能是感染源，因此，医院要做好每天的消毒工作，不可忽视。医护人员也要注意个人卫生，经常洗手消毒，医疗器械等用品也要进行灭菌消毒，减少感染媒介。医院里聚集了多种病原体，病原体适合存活于潮湿的环境下，因此，要对医院的环境进行控制，保持空气畅通，降低医院感染发生率。另外，医院里的患者，身体都比较弱，容易感染，多为易感人群，因此，一定要在进行病房环境保持的同时，加强患者的病原菌的耐药性监测，以及环境细菌的监测。

本研究中，观察组采用微生物检测结果显示，不管是患者感染程度还是感染率都低于比对组，两组比较，P<，具有统计学意义。可见，微生物检测在医院感染控制方面有明显的效果，能够对病原菌和易感人群进行有效的监测，同时，对传播途径也起到很好的预测作用。通过本研究，充分显示了微生物检验技术在感染控制中的应用作用，有着不可代替的位置，是进一步治疗的理论依据，有效降低了医院感染的发生率，具有显著的临床价值，值得在临床中广泛应用和推广。

参考文献

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