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血细胞分析仪检测血小板影响因素影响策略论文
在当前医疗技术的发展与促进作用之下，血细胞分析仪被广泛应用于基层医院的检验科室当中。实践经验显示：血细胞分析仪作用于检验，具有操作简单，响应迅速、重复性好、以及数据精确度高在内的多方面确切优势[1-2]。但受到自身检测原理的限制性影响，导致在临床对血细胞分析仪进行应用的过程当中，会受到大量内外部因素的影响。特别是对血小板的检测而言，计数结果会受多种因素影响而出现偏差，成为了临床中反应较多的问题之一。从这一角度上来说，如何明确血细胞分析仪在检测血小板过程当中的影响因素，落实相应的纠正与控制方法，这一问题备受医务工作者的关注与重视。本文选取2014年1-3月，健康体检对象共计50例作为研究对象，应用血细胞分析仪对其血小板计数结果进行分析，具体总结如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取自2014年1-3月，健康体检对象共计50例作为研究对象。对所有入选对象的一般资料进行回顾分析：男27例，女23例，年龄1～72岁，平均(34.5±2.6)岁。
1.2 方法
使用希森美KX-21型全自动血细胞分析仪，对所有入选对象进行血小板计数检测工作。由希森美公司提供溶血剂以及稀释液。在空腹状态下，分别实施静脉抽血(血样剂量为2 ml)以及末梢采血(血样剂量为120 μl)，使用0.15 mg单位EDTA抗凝管储存分析。分别实施仪器法以及手工法两种检测方案。计数作业分别进行3次，取平均值作为最终计数结果。
1.3 观察指标
对仪器法以及手工法下，不同时间状态下所对应的血小板计数情况进行观察对比，同时对静脉血以及末梢血下的血小板计数检测结果进行对比。
1.4 统计学处理
采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，比较采用t检验;P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
在分别应用仪器法以及手工法进行血小板计数的过程当中，即刻测定状态下，仪器法检出数据明显低于手工法检出数据，对比差异有统计学意义(P<0.05);静置10 p="">0.05);静置8 h后，仪器法检出数据明显低于对照组，对比差异有统计学意(P<0.05)，见表1。在不同采血区域进行血小板计数的过程当中，采集静脉血血小板计数为(165.1±5.9)×109 p="">0.05)。
3 讨论
血浆中血小板体积小，无色，且黏附性高。当血液自血管破损位置流出后，血小板一旦与破损血管的内皮细胞或组织成分发生接触反应，则势必会迅速粘附于血管壁之上。再加上在应用血细胞分析仪对血小板进行检测的过程当中，血浆标本需要与抗凝管表面发生接触反应，故而最终导致血小板大量粘附于抗凝管内壁并发生聚集反应，造成血小板计数上的偏差问题[3]。从这一角度上来说，无论是在仪器法还是手工法作用下，所采集血小板数均较实际数据更低。同时，本次研究中数据显示：采集末梢血与静脉血进行对比中，两者所对应的血小板计数结果差异无统计学意义(P>0.05)。但需要注意的是：相较于静脉血而言，末梢血采集中潜在大量的影响因素(包括扎针深度、取血速度等等在内)，都将对最终所生成的血小板计数结果产生影响。因此，在条件允许的情况下，推荐采集静脉血样完成血细胞分析工作。若必须以末梢血进行分析，则要求满足扎针3 mm深度，且血样应当自然流出，以保障血小板检出数据的精确性。
同时，有关研究报道中显示：对于抗凝剂而言，在应用血细胞分析仪对血小板展开检测作业的过程当中，检测结果很大程度上会受到抗凝剂类型的影响[4]。当前，国际化学标准委员会所推荐的抗凝剂为EDTA二钾抗凝，应用该推荐抗凝剂，可最大限度的保障检测结果的`精确性。同时，血液与抗凝剂之间的比例关系也会对检测质量产生相当重大的影响。有关临床研究中指出：在受检血液比例过高的情况下，由于抗凝剂无法与之形成匹配关系，进而可能导致待检测血浆样本当中出现微血块。而微血块的产生势必会导致血细胞分析仪被堵塞，造成检测结果上的偏差。反过来说，在受检血液比例过低的情况下，抗凝剂同样无法与之形成匹配关系，主要表现为浓度的提升，带动血浆样本当中血小板的肿胀与崩解反应，产生大量与血小板大小基本一致的碎片，导致计数过程当中容易发生偏差[5-6]。
同时，本次研究数据中显示：在分别应用仪器法以及手工法进行血小板计数的过程当中，即刻测定数据以及放置8 h后的测定数据组间对比差异有统计学意义(P<0.05)。这一研究数据提示：一方面，在抗凝剂对血小板黏附性以及聚集性进行一致的同时，会导致血小板形态自双凹模式转变为球形模式，体积明显增大，即刻上机测试下，导致血小板测定数据明显较低。而在放置10 p="">0.05)。同时，随着放置时间的延长，血小板计数有一定的下降趋势，且在8 h开始呈现出显著差异，提示测定时间同样是造成血小板计数偏差的关键影响因素之一。
结合相关研究数据而言，无论是对于光散法还是对于阻抗法而言，在应用血细胞分析仪对血小板进行计数的过程当中，结果基本可靠且稳定。但对于存在血小板形态异常以及明显降低的对象而言，不同方法下的计数结果往往会产生较大的差异。因此，在病理因素影响下，血浆中会产生大量的非血小板颗粒，最终导致计数结果假性增多。当前相关报道当中认为能够确保血小板计数准确的方法有两种类型：第一类是建立在免疫学基础之上的计数方法，即使用荧光对血浆样本中的抗血小板抗体进行标记;第二类是建立在激光散射基础之上的测定方法，在激光散射计数干预下，分离非血小板颗粒以及血小板，从而确保计数的准确性[7-8]。但以上两种方法成本较高，普及性较差。故而当前所选取的复查方式主要以手工计数法为主。针对本方法计数精确性上的却是可以增加一项在血涂片上间接计数血小板的方法作为补充，使用抗凝血液推血片，在瑞氏蚺蛇处理下计数1000个红细胞及对应的血小板，根据两者之间的比值，按照血小板计数/红细胞计数×红细胞计数的方式，求得最终数据[9-10]。根据以上措施的落实，配合与临床医师之间的密切联系，能够达到消除血小板计数误差，提高血细胞分析精度的目的。
综上所述，实践工作中需要重视对抗凝剂类型、采血区域、放置时间等影响因素的分析与控制，必要时进行涂片以及直接计数复查，配合与临床医师之间的密切联系，能够达到消除血小板计数误差，提高血细胞分析精度的目的。
参考文献
[1]韩凝，郭树霞，胡成进，等.试析Sysmex-2100血细胞分析仪血小板检测正常其他参数不显示的原因[J].中华临床医师杂志(电子版)，2013，7(23)：11061-11062.
[2]胡明定.病毒性肝炎所致肝硬化患者血小板检测的临床意义[J].中国医药指南，2013，11(19)：600-601.
[3]谭江峡.凝血功能和血小板检测在肾病综合征患者中的临床应用[J].中国医药导刊，2014，16(2)：315-316.
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应该就是细胞自主的，有序的发生死亡，而且就是自然老死的情况，并且也是一个主动的过程，等等，这些都是细胞凋亡的原理。
指的就是维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡，和细胞坏死有很大的不一样，在这个过程中是可以由基因自己去进行控制，所以对于身体没有太大的损伤。
细胞凋亡是一种正常的基因程序性细胞死亡，其中老化细胞在其生命周期结束时收缩，其剩余片段被吞噬而没有任何炎症反应。
1972 年，Kerr、Wyllie 和 Currie 在一篇论文中首次引入了细胞凋亡这一术语，以描述一种形态上不同的细胞死亡类型。它由一系列导致细胞形态变化或死亡的生化变化组成。它导致普通成年人每天有 50 到 700 亿个细胞死亡。它也被称为“细胞自杀”，因为细胞经历了一个高度调控的过程，以程序化地从体内去除细胞。作为细胞周期的一部分，大多数细胞具有内置的细胞凋亡机制。这种机制可以让身体摆脱不必要的细胞或受感染的细胞。
细胞凋亡被认为是各种过程的重要组成部分，包括正常细胞周期、免疫系统的正常发育和功能、胚胎发育和化学诱导的细胞死亡。细胞凋亡是发育的一部分，因为它对于将大量组织分化为不同的群体至关重要。
细胞凋亡发生在可能已感染病毒甚至可能癌变的细胞中。这个过程通常发生在细胞检测到 DNA 中的缺陷并且无法修复它时。细胞凋亡也是免疫系统的重要组成部分，因为一旦异物从体内清除，它就会清除病原体特异性免疫细胞。
这也有助于去除可能与身体细胞发生反应并导致自身免疫疾病的免疫细胞。细胞凋亡的另一个原因是通过去除旧细胞为新细胞腾出空间来维持体内稳态。
启动细胞凋亡的外在途径涉及跨膜受体介导的相互作用。这些相互作用发生在配体和它们相应的死亡受体之间，这些受体都是肿瘤坏死因子 (TNF) 家族的一部分。TNF 受体家族的所有成员共享一个共同的富含半胱氨酸的胞外域，该域包含约 80 个氨基酸，称为“死亡域”。
检索策略：褪黑素*细胞凋亡*保护作用维普、万方的高级检索与cnKI里标准检索都差不多，检索时，建议将褪黑素、细胞凋亡可以放在题名字段下，保护作用放在主题字段。维普下载的题录信息如下： 1/5【题名】褪黑素对离体帕金森病模型黑质NF-KB表达及黑质细胞凋亡的影响【作者】邢红霞 彭海 刘敏 王玉梅 朱红灿【刊名】中国神经免疫学和神经病学杂志.2008(1)【机构】新乡医学院第一附属医院神经内一科,河南卫辉453100 华中科技大学同济医学院协和医院神经内科,湖北武汉430022 武汉市精神卫生中心神经内科,湖北武汉430022 郑州大学第一附属医院神经内科,河南郑州450052【ISSN号】1006-2963【CNNO号】11-3552/R【馆藏号】98536X【关键词】帕金森病 6-羟多巴胺 黑质细胞 凋亡 核因子-kB p65【分类号】R742.5【文摘】目的研究褪黑素（melatonin，MT）对6-羟多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）所制造的离体帕金森病（Pakinson disease，PD）模型的影响。方法将14只大鼠分成假手术组、MT组和对照组3组，MT组大鼠经腹腔连续3d注射MT，另两组以相同方法注射等量生理盐水，然后MT组和对照组分别取脑片置于含6-OHDA的人工脑脊液中孵育2h。应用TUNEL法、免疫组化技术观察黑质细胞凋亡的数量并检测黑质细胞NF-kBp65表达情况。结果假手术组未见明显黑质细胞凋亡，MT组较对照组黑质细胞凋亡明显减少，且黑质细胞NF—KBp65的表达也有所减少，与对照组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论MT对离体PD模型具有保护作用，其机制可能为抗凋亡。2/5【题名】褪黑素对巨核细胞凋亡的影响及作用机制研究【作者】周敏 徐酉华 李晓辉 李晓静 徐鸣 杨默【刊名】第三军医大学学报.2008(18)【机构】重庆医科大学附属儿童医院血液科,重庆400014 成都市儿童医院血液科,成都610014 香港大学李嘉诚医学院儿童及青少年科学系,香港【ISSN号】1000-5404【CNNO号】50-1126/R【馆藏号】92156X【关键词】褪黑素 巨核细胞 凋亡 AKT ERK【分类号】R329.28 R331.14【文摘】目的探讨褪黑素（melatonin，Mel）对巨核细胞凋亡的影响及其作用机制。方法巨核细胞细胞株CHRF-288-11去血清诱导凋亡，加或不加Mel共培养后，流式细胞仪检测凋亡指标：AnnexinV／PI、Caspase-3和JC-1，并与正常组和TPO组比较。同时检测信号通路AKT、ERK1／2，了解其参与保护作用的机制。结果Mel 200nmol／L作用72h后，CHRF细胞AnnexinV／PI、Caspase-3和JC-1的表达较对照组有明显下降，分别由42．9％、29．5％、47．7％降至31．7％（P〈0．05）、21．8％（P〈0．05）和37．2％（P〈0．05）。其中，JC-1的表达与TPO组（20．7±5．2）％比较，差异有统计学意义（P〈0．05），而Annexin V／PI、Caspase-3的表达与TPO组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。加入Mel后CHRF细胞的磷酸化AKT、ERK1／2水平明显增高，分别由（5．9±0．1）％、（6．1±0．4）％升至（9．5±0．1）％（P〈0．05）、（9．3±0．5）％（P〈0．05）。结论Mel可抑制巨核细胞凋亡，其保护机制可能通过AKT、ERK信号通路发挥作用。3/5【题名】褪黑素对糖尿病视网膜病变大鼠微血管细胞凋亡的保护作用【作者】夏培金 宋迎香 李文桐 邹俊杰 石勇铨 刘志民【刊名】第二军医大学学报.2007(7)【机构】第二军医大学长征医院内分泌科,上海200003 浙江省人民医院内分泌科,杭州310014【ISSN号】0258-879X【CNNO号】31-1001/R【馆藏号】91242X【关键词】糖尿病视网膜病变 大鼠模型 保护作用 细胞凋亡 微血管 褪黑素 免疫组织化学方法 链脲佐菌素【分类号】R587.2【文摘】目的：观察褪黑素（Mel）对糖尿病视网膜病变大鼠微血管细胞凋亡的保护作用。方法：链脲佐菌素（60mg／kg）诱导糖尿病大鼠模型，造模成功后按体质量和血糖随机分为3组：糖尿病组、小剂量Mel组[0．5mg／（kg·d）]、大剂量Mel组[10mg／（kg·d）]。另设正常对照组（7只）。干预12周后，应用免疫组织化学方法检测各组大鼠视网膜NF-κB、bcl—2、Bax的表达；图像分析仪测定阳性面积，计算出其表达量。4/5【题名】大鼠供心保存期间心肌细胞凋亡的动态变化及褪黑素的保护作用【作者】高思海 潘铁成 杨辰垣【刊名】中医杂志.2004(2)【机构】华中科技大学同济医学院附属同济医院胸心外科 华中科技大学同济医学院附属协和医院心外科 430030武汉【ISSN号】1001-1668【CNNO号】11-2166/R【馆藏号】90115X【关键词】器官保存 心脏移植 大鼠【分类号】R654.2【文摘】目的探讨大鼠供心保存期间心肌细胞凋亡的动态变化及褪黑素的保护作用。方法将 80只Wistar大鼠随机平均分为实验组和对照组。实验组在 4℃StThomas液中加入褪黑素(0 .1mmol/L)保存大鼠心脏 ;对照组单用StThomas液保存。分别于保存 4、8、12、2 4、3 6h后 ,各取出8只供心 ,TUNEL法染色检测细胞凋亡情况。以心肌凋亡阳性细胞数占总心肌细胞数的百分比作为心肌细胞凋亡指数。结果随着保存时间的延长 ,凋亡的心肌细胞数量明显增加 ,各时间点比较 ,差异有显著性 (P <0 .0 1) ;实验组各时间点心肌细胞凋亡指数明显小于相应对照组 (7.68%± 1.0 4%vs 2 4.3 7%± 1.2 3 % ,P <0 .0 1;8.2 7%± 1.17%vs 3 5.73 %± 1.98% ,P <0 .0 1;10 .14 %±1.2 2 %vs 42 .85%± 2 .3 6% ,P <0 .0 1;12 .3 1%± 1.54%vs 58.3 7%± 3 .12 % ,P <0 .0 1;14 .53 %± 1.89%vs 79.65%± 4.16% ,P <0 .0 1)...5/5【题名】褪黑素对氧自由基诱导的PC12细胞凋亡的保护作用【作者】杨玲玲 付振涛 孔峰 胡晓燕 曾季平 崔行【刊名】山东大学学报：医学版.2004(6)【机构】山东大学医学院生物化学与分子生物学研究所，山东济南250012 山东省疾病预防控制中心，山东济南250000【ISSN号】1671-7554【CNNO号】37-1390/R【馆藏号】95413A【关键词】活性氧 阿尔茨海默病 细胞凋亡【分类号】R741.02【文摘】目的：探讨氧自由基在阿尔茨海默病(Alzheimer Disease，AD)发生中的作用及可能机制，评价褪黑素(Melatonin，MT)的临床应用价值。方法：采用超氧自由基产生系统黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶系统(X／XO)作用于PC12细胞，以褪黑素拮抗其作用，观察细胞的形态学变化；MTT法检测细胞存活率，DNA电泳和流式细胞术分析细胞凋亡情况，RT-PCR技术测定凋亡相关基因bcl-2、bax的表达。结果：X/XO作用后，PC12细胞出现凋亡特征性改变，凋亡率增加，电泳呈现DNA ladders，凋亡相关基因bax上调：而10^-5M褪黑素即能改善凋亡情况。结论：氧自由基可诱导神经元凋亡从而促进AD发生，其机制与促凋亡相关基因Bax表达增高有关；褪黑素可减缓神经元凋亡，可用于临床预防与治疗。
Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges 单细胞T细胞受体测序：技术与挑战 T细胞的特性是能够识别无限范围内的自体抗原和外来抗原。这个能力是靠胸腺发育过程中通过一种基于体细胞重组的复杂分子机制实现的。该机制导致了表面抗原受体有很多种类的群体的表达，这种受体就叫做T细胞受体（TCRs）。TCRs具有细胞特异性，是T细胞的一种分子标记，在淋巴恶性肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤免疫学等多种背景下，TCRs被广泛用于监测T细胞的克隆类型（clonality）和多样性（diversity）。在这篇综述中，我们概述了用于研究TCR指令集的策略，从基于V段识别的先锋技术，到下一代测序所引入的革命，该技术允许阿尔法链和贝塔链的高通量测序。基于单细胞的方法将分析提高到更高的复杂性，现在提供了对成对的alpha和beta链进行排序的机会。我们还讨论了新的方法，通过整合TCR跟踪和mRNA单细胞测序提供了一个有价值的工具，将抗原特异性与转录动力学联系起来，并了解T细胞可塑性的分子机制。 人类T细胞在胸腺中由造血组织的祖细胞发育而来。在它们的发育过程中，它们获得了识别外来抗原的能力，并对许多不同的病原体提供保护。这种功能的灵活性是由高多态性表面受体的表达称为T细胞受体(TCRs)。TCR由两个不同的蛋白质链组成。绝大多数的人类T细胞表达细胞组成的α和β链而表达了TCR组成的一个小子集γ和δ链。αβ T细胞适应性免疫的关键调解人和识别抗原在协会主要组织相容性复合体(MHC)类I和II级蛋白质。γδ T细胞而不是MHC-restricted和参与先天反应组织。αβT细胞代表超过90%的总T细胞群和γδT相比更加多样化;出于这个原因,绝大多数的研究TCR的重点是αβ T细胞。 编码alpha (TCRA)和beta (TCRB)链的基因由多个不相邻的基因片段组成，包括TCRB基因的变量(V)、多样性(D)和连接(J)片段，以及TCRA基因的变量(V)和连接(J)片段。T细胞库的巨大多样性是由生殖系基因片段的随机组合(组合多样性combinatorial diversity)和已连接片段在连接位点的随机添加或删除(连接多样性junctional diversity)产生的。 Alpha和Beta链在体细胞上的V（D）J 排列。(A) TCRB和TCRA位点的基因组组织和体细胞重组。抗原库多样性是通过重组步骤来保证的，该步骤逐步重新排列T细胞受体(TCR)β链的V、D和J段，以及TCRα链的V和J段。这种变异性(组合多样性)进一步增加或删除核苷酸在连接位点(连接多样性)。(B)转录本和转录本的生产性重排（productive arrangements）。(C) TCR的结构。TCR由两个亚基TCR Alpha 和TCR Beta 组成，每个亚基分别位于一个恒定区域和一个负责抗原识别的可变区域。 由V(D)J结编码的序列称为互补决定区域3或CDR3。这个序列在α链和β链中都具有最高的可变性（variability），决定了T细胞识别MHC分子所呈现的抗原肽的能力（Figure 1B）。随后的异二聚体对alpha链和beta链进行配对，进一步增加了组合变异性，估计可能的组合总数超过10e18。T细胞库是动态的，直接反映了免疫反应的多样性:抗原呈递给一个幼稚的T细胞，事实上，与共刺激信号相关联，促使携带相同TCRs的细胞迅速克隆扩增，产生一批“效应细胞”。抗原清除后，这些细胞作为“记忆细胞”留在血液中的数量减少了。“TCR序列的特征一直具有很大的科学价值，因为它准确地描述了T细胞在多种疾病中的动态，包括恶性肿瘤、自身免疫性疾病和传染病。 利用流式细胞术和针对TCRBV亚群的单克隆抗体的组合，在蛋白质水平上进行了开拓性实验，以解剖T细胞库。这种方法是定性和定量的，但受限于特定单克隆抗体的可用性，没有提供任何关于CDR3多样性的信息。第一个基于基因组的方法是基于对群体中CDR3序列长度分布的分析。这种技术被称为免疫镜或CDR3光谱分析，其基础是利用针对不同可变片段和恒定区域的特异性引物，在CDR3区域扩增TCR转录产物，从而获得PCR片段的电泳分析。免疫镜比较了单个TCRBV亚科中不同长度产物的相对频率，该亚科在多克隆群体中呈高斯分布，而在克隆富集中呈偏态分布。第一个用于在核苷酸序列水平上查询TCR指令集的分子方法是基于传统的分子克隆和Sanger测序。这种方法提供了一个更具体的TCR曲目描述，但它不足以估计巨大的TCR多样性。真正的突破免疫特性的曲目来自高度敏感的高通量测序技术的引入大规模并行测序数以百万计的DNA分子,而不是单一的克隆细胞提供一个全面的知识的安排(α,β链,或两者兼而有之)包括这段和完整的CDR3上序列。 目前的测序技术采用从基因组DNA或cDNA开始的目标富集步骤，既提高了灵敏度，又降低了测序成本。常用的富集策略包括多重PCR、RNA诱饵富集和5’RACE PCR。多重PCR策略使用一个互补于所有可能的V段的多重正向PCR引物池和一个设计在J段(如果从基因组DNA开始)或在α和β链的恒定区域(如果从cDNA开始)上的反向引物池。这两种方法都有优点和缺点。从cDNA开始的PCR富集比基因组DNA有很多优势:(a) PCR伪产物的偏倚更小，因为扩增片段不包含内含子，因此更小;(b) cDNA分析只检测有效排列的片段(“表达的”和链);(c)由于mRNA转录本比模板基因组DNA更丰富，因此它能够更容易地检测较少表达的序列。基于诱饵的富集利用RNA诱饵直接从DNA或RNA测序(RNA-seq)文库中捕获TCR序列，捕获后再进行扩增。诱饵是特定的阿尔法和贝塔转录本，通常是共轭的磁珠。这一过程需要很少的扩增周期，减少PCR相关偏差的潜力。 第三种方法是基于转录本的方法，在模板切换（template-switch）步骤之后使用5'RACE。RNA由具有末端转移酶活性的酶逆转录，该酶在cDNA的3 '端添加一段非模板dCTPs。含有聚g束的非模板开关寡核苷酸然后与非模板拉伸结合，并允许逆转录酶切换模板并继续扩展模板直到寡核苷酸的末端。模板开关寡核苷酸包含一个通用序列，所有转录本包括TCR链共享。然后，在该序列上设计的正向引物与在α和β链的恒定区域上设计的反向引物一起使用，以丰富TCR转录本扩增片段的内容，然后可以对片段进行处理，生成测序文库。 使用基因组DNA作为起始材料反而更具挑战性，因为富集通常是通过多重PCR进行的，但内含子的存在和较长片段的扩增可能会引入更多的技术偏差。此外，非生产性的重新安排也被放大和排序，使表达的曲目的分析复杂化。这一革命性的方法首次被用于描述健康个体的TCR库多样性，并迅速适应于不同病理环境(如肿瘤免疫学和自体免疫)和多种临床应用(如监测造血细胞移植)中的库分析。 由于beta链具有较高的多样性，与alpha链相比，beta链具有更大的组合潜力，因此一直是所有TCR序列研究的主要目标。此外，β链代表T细胞的一个“独特标签”:T细胞经历了一个称为“等位基因排斥”的过程，导致只产生一个有效排列的β链基因，而两个α链等位基因都可以表达。“bulk”方法的局限性在于缺乏关于α和β链配对的信息，而α和β链配对真正反映了T细胞在体内的生物学功能，只能通过单细胞分析来实现。单细胞TCR全谱分析方法主要采用两种策略:从单细胞cDNA开始直接目标扩增和测序，或从单细胞RNA-seq数据重建TCR。 第一次尝试测序单细胞TCRα和β链使用与Sanger测序或高通量测序相关的多重PCR策略。Hans和他的同事们用多重PCR方法对浸润人结肠癌的T淋巴细胞的异质性进行了分析，以丰富来自同一细胞的TCR序列和一组“表型基因”。他们还实现了一个基于pcr的单细胞条形码策略来汇集所有的扩增子，并通过NGS对它们进行排序。条形码是一种短核苷酸序列，它唯一地标记细胞转录本，并用于追踪mRNA转录本的来源。通过这种原始的方法，他们可以将TCR序列与具有不同功能的特定T细胞子集相关联。一个类似的单细胞条形码策略被用来建立高通量的方法来识别具有相同的α和βTCR序列的克隆，并应用于乳腺癌和肺癌的肿瘤浸润淋巴细胞。 上图解释：单细胞T细胞受体(TCR)测序方法综述。直接富集和测序TCR。 在图(A)中，单细胞TCR转录本通过RT反应后的多重PCR进行富集，使用一组正向引物，涵盖所有带注释的V alpha 和V beta 片段，并在α和β链的恒定区域设计反向引物。然后通过PCR添加barcode adapter，并测序。在图(B)中，细胞通过微流体乳化装置以及特定的RT和PCR试剂在油包水的droplets中捕获。在每个液滴中，单个细胞的TCR alpha 和 beta转录本都被设计在alpha和beta链的恒定区域上的RT引物特异性地逆转录。利用设计在所有α和β片段上的正向引物池和设计在恒定区域上的反向引物，依次扩增cDNA。α和β引物在其5 '端包含重叠序列，通过重叠扩展机制可以合成TCRα和β融合序列。熔融分子聚集在一起，打破乳液，并通过巢式扩增和测序进一步丰富。从单细胞“全长”RNA测序(RNA-seq)数据重建TCR。图(C) 用微流体设备分选或捕获的单细胞被裂解，总mRNA通过oligo dT启动反应逆转录。通过模板切换机制，在转录本的5 '端添加一个通用序列。这个序列与RT反应中使用的dT引物共享，然后在文库制备前用于扩增cDNA。在文库制备步骤中，利用转座酶对全长cDNA进行“标记”，然后利用转座酶插入的标记序列对cDNA进行扩增，并插入测序barcode接头(AD1和AD2)。然后对文库进行排序，使用专用的生物信息学算法(TraCer、TraPes、VDJ Puzzle)从所有转录组中提取TCR序列。采用基于乳化剂的单细胞TCR测序和RNA-seq配对。图(D) 成千上万个平行的细胞被分成水滴中的油。裂解步骤后，它们的mRNA被使用含有相同“cell barcode”的特定RT引物池逆转录，该“cell barcode”是一种独特的分子标识符(UMI)，用于标记细胞转录组。每个引物的UMI都是不同的，这使得mRNA转录的数字计数和T7启动子的测序成为可能。然后通过体外转录扩增cDNA。扩增后的barcode RNA汇集在一起进行处理。然后利用扩增的RNA作为模板，对TCR序列进行富集，并根据InDrop协议生成RNA-seq文库。在RNA-seq文库制备过程中，RNA被片段化，只有3 '端转录本被测序。对于TCR富集，扩增的RNA使用一组横跨V alpha 和V beta 段的RT引物进行逆转录，然后使用“内部”V alpha 和V beta 和设计在恒定区域上的引物(primers)进行扩增。在此PCR反应中，还添加了测序barcode(AD1和AD2)。图(E) 成千上万个平行的细胞被分成油包水的液滴中（droplets）。裂解后，用oligo dT引物逆转录它们的mRNA。通过template-switch机制，在转录本的5 '端添加含有cell barcode和UMI的primer。RT反应后液滴破碎，利用设计在dT 和 switch oligonucleotides 上的external primer，将cDNAs pooled 和扩增。然后利用扩增的全长cDNA作为模板，富集TCR测序，或片段化处理，生成RNA-seq文库。TCR富集采用巢式PCR法，正向引物跨越switch oligo，反向引物设计在α和β链的恒定区域。然后将PCR产物部分片段化，加入测序接头(AD1和AD2)。 真正的突破来自于基于乳化剂的PCR技术。这些技术使用的设备可以泵入水中的油状乳剂，成千上万的单个细胞可以被捕获到液滴中，液滴与引物和PCR试剂一起工作，就像一个微型反应室。这种方法可以大幅增加并行处理的细胞数量，并能够生成具有代表性的单细胞和融合在一起的TCR基因文库。其中，细胞裂解后，在每一个液滴中释放出α和βTCR mRNA，并利用末端重叠的引物进行多重PCR逆转录扩增。在随后的反应中，重叠端退火，允许每条链的3 '端启动互补端3 '延伸。此步骤生成包含序列和序列的融合片段;融合片段在含有“阻断”引物的PCR中进一步扩增，这些引物可以防止未被扩增的片段被扩增。Turchaninova和他的同事应用这项技术来描述人类血液中的T细胞库，但是这种方法已经广泛应用于包括癌症在内的许多研究领域，最近在一个超高通量平台上重新调整，允许对数百万个细胞进行TCR配对测序。 单细胞RNA-seq技术的发展也为TCR分析开辟了新的前景。到目前为止，已经开发了许多不同的protocol，主要在细胞分离方法、cDNA合成和扩增以及文库制备步骤上有所不同。单细胞分离方法迅速发展在过去的几年里从手工操作到使用微流体或emulsion-based平台的高通量分离方法,这不仅提供了巨大的优势在throughput方面而且在灵敏度和准确性方面由于很小的反应量使用。所有测序方案的特点是在文库制备前的一个逆转录和扩增步骤。常用的扩增步骤不同，可通过PCR或体外转录进行扩增，分为两组:基于标记或全长cDNA测序protocol。 基于标记的策略在逆转录反应中引入“细胞条形码”，为“标记”单个细胞的整个cDNA池提供了可能。“标记策略”已经成倍地提高了通量，因为标记的cDNAs可以在扩增和库准备过程中被汇集，从而大大降低了成本和实验时间。主要缺点是，这些protocol在库制备过程中由于cDNAs片段化而失去了全长转录本的覆盖范围，并且与全长策略相比具有较低的敏感性(可检测基因的数量较少)。相反，全长策略更昂贵、更耗时(每个细胞的cDNA池被独立处理以生成单个测序库)，但更敏感，可以提供更广泛的信息，包括亚型、剪接和单核苷酸多态性。利用全长方法生成的单细胞RNA-seq数据提取T细胞库和异质性信息。来自scRNA-seq数据的全长(TCR)序列的组装允许alpha和beta链序列配对(在执行“bulk”分析时不可能)，并允许clonality信息与单个T细胞的整个转录组集成。这种方法也呈现非琐碎的分析问题:规范化reference-based组装方法,依赖的一致性读到“参考”体细胞基因组实际上是有偏见的重组和突变(CDR3上是特定为每个细胞)和缺乏一个完整的“参考”基因组需要从头组装为基础的生物信息学工具的发展。 所有可用的工具基本上都结合了基于引用的组装(reads与带注释的基因片段对齐)和从头组装(重建CD3区域)。最早用来重建成对TCR和β链的工具之一被称为TraCer (34)。为了验证 TraCer的性能，Stubbington和同事使用SMART-seq protocol和从小鼠脾脏分离的FluidigmC1系统(Fluidigm Corporation)生成单细胞RNA-seq数据。为了验证所识别的克隆型，他们使用了一种实验方法来丰富TCR序列，该方法使用了一种基于pcr的多路方法，从用于测序库生成的相同cDNA开始，该方法由NGS并行测序。两种策略之间的良好相关性证实了该方法的有效性。在同一篇论文中，他们将这一分析应用于沙门氏菌感染的小鼠模型，并能够监测感染后扩大的克隆型。该方法的优势在于将TCR克隆型与特定的基因表达谱相关联，该基因表达谱提供了对整个CD4+ T细胞群的详细分子描述，并在感染后监测CD4+ T细胞亚群的动态。 同样的方法也被用于分析T细胞亚群的异质性，以解决几个生物学问题，特别是与“肿瘤免疫”相关的问题。“在过去的几年里，T细胞在癌症中的作用已经被广泛研究，CD8+ T细胞和CD4+ T调节细胞被广泛描述分别在几种癌症中抑制或促进肿瘤进展。最近，郑和同事利用示踪剂对T细胞浸润性肝癌进行了解剖。他们分析了浸润的Treg和CD8+ T细胞的克隆富集，以了解肿瘤微环境中淋巴细胞募集的分子机制。通过对TCR表达谱的解剖，他们得出结论:Treg细胞在肿瘤中不存在克隆富集，提示从周围招募，而CD8+ T细胞经克隆富集，提示肿瘤内部存在克隆活化和扩增。在相同的研究思路下，陆续开发了scTCR Seq、TRAPes等工具，适用于短读单细胞RNA-Seq文库和VDJ Puzzle，可以同时分析基因表达和TCR多样性，并在抗原特异性循环CD8+ T细胞上进行了开发和验证。 最近修改基于标签的策略的尝试有望将来自相同细胞的RNA-seq和TCR测序结合起来。这些方法具有极大的优势，可以大幅增加并行处理的细胞数量，这对于描述非常罕见的T细胞群是至关重要的。 最近发表的一篇论文研究了小鼠和人类Treg细胞的T细胞库(41)。在本文中，Zemmour和同事使用不同的单细胞RNA-seq方法分析了Treg细胞的转录表型。他们发现，Treg细胞具有广泛的异质性，某些高度活化的亚群似乎与T细胞的转录相关。他们还表明，具有相同TCR的Treg在转录上比具有不同抗原特异性的Treg更相似，这说明Treg可塑性受TCR成形的影响较大。为了分析TCR指令表，Zemmour和他的同事使用了一种基于乳化剂的InDrop协议(图2D)的修改，该协议目前用于3 ' '端计数。 其中，细胞通过微流体装置形成油包水乳状液被捕获成水滴。细胞被捕获连同裂解缓冲液，试剂，特别是条形码引物，启动RT反应。条形码cDNAs是由上千个细胞并行合成的。将不同细胞的逆转录后的cDNAs通过破碎液滴汇集在一起，利用体外转录进行线性扩增，然后制备测序文库。正如本文所述，这种池策略成倍地提高了吞吐量，因为可以将数千个单元池放在一个库中。然而，片段化步骤牺牲了所有来自mRNA 5 '端(包括CDR3区域)的信息。Zemmour和他的同事们克服了这个问题，他们在线性放大后引入了一个TCR富集步骤，这个步骤使用了一个横跨所有V和beta段的多重RT池。此步骤生成与整个转录组库共享相同条形码的TCR alpha和beta库(图2d)。最近，10x基因组公司推出了一种类似的方法，将α和β链测序结合起来，并行地对数千个单细胞进行转录组分析(图2e)。该方法采用商业化的基于乳化剂的微流控平台(Chromium 10x)，可以生成用于单细胞RNA-seq文库制备和TCR目标富集和测序的扩增cDNA。通过PCR对扩增的cDNA进行TCR富集，使用设计在α和β链的恒定区域上的反向引物和设计在第二链合成过程中通过模板开关机制添加在5 '处的寡核苷酸序列上的通用正向引物。每个寡核苷酸包含一个独特的cell barcode，用于标记整个细胞转录组，包括TCR转录本。 T细胞受体库分析已成为了解健康个体和多种病理条件下T细胞生物学的基本工具，目前不仅应用于研究免疫介导性疾病的生物学，而且还应用于监测治疗后的免疫反应。CD3谱分型等前沿技术已被广泛用于提供克隆扩增的信息，但随着NGS技术的发展，在产量和应用方面出现了真正的革命。对成千上万个细胞的TCR进行并行测序是分析T细胞反应库复杂性和多样性的有力工具。这项技术的主要局限在于无法配对测序和测序，这削弱了我们对体内情况的理解。随着单细胞技术的快速发展和扩展，这一关键问题最近得到了解决，单细胞技术提供了配对的和单个细胞的序列信息。进一步的复杂性来自于将来自相同细胞的TCR库和基因表达谱联系起来的努力。这种分析提供了对感兴趣的种群的无偏分类，以及每个细胞的转录景观与其TCR之间的关联。这种方法有望开辟新的途径来描述免疫细胞亚群的特异性克隆性，即使是特征不明显的表型亚群也是如此，并为监测与克隆性密切相关的转录动力学效应提供了机会。
细胞工程论文
细胞工程是生物工程的一个重要方面。总的来说，它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。下面是我为大家整理的细胞工程论文，欢迎阅读。
【摘要】 目的制作去细胞肌肉组织工程支架，并检测其与人羊膜上皮细胞的生物相容性。方法 采用TNT和十二烷基磺酸钠结合的化学萃取方法制作去细胞肌肉组织工程支架，冰冻切片观察其结构。将人羊膜上皮细胞种入支架培养7 d后，用免疫组化检测羊膜上皮细胞的增殖活性、NT3及BDNF的表达,扫描电子显微镜观察其超微结构。结果 支架中细胞去除完全，其主要结构为平行排列的管状结构。细胞外基质的主要成分弹性纤维和胶原纤维保持完好。羊膜上皮细胞在支架里有增殖活性，并呈现NT3、BDNF免疫反应阳性。扫描电镜显示，羊膜上皮细胞在支架中分布均匀，生长良好。结论 成功的制作了去细胞肌肉组织工程支架，其与人羊膜上皮细胞有良好的相容性。
【关键词】 去细胞肌肉;人羊膜上皮细胞;生物相容性
近年来组织工程研究的重要进展之一就是采用自体或异体移植物制作天然生物降解材料的组织工程支架。其中去细胞移植物与机体有良好的生物相容性。去细胞肌肉支架可作为生物工程支架支持神经细胞轴突再生。Mligiliche等〔1〕把去细胞肌肉移植入大鼠坐骨神经缺损处,4 w后发现有大量神经轴突长入去细胞肌肉支架中。由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限，去细胞肌肉支架要发挥更大的作用往往需要向支架中植入种子细胞〔2，3〕。研究表明羊膜上皮细胞可分泌多种神经因子〔4，5〕，促进神经元轴突的生长，是一种良好的治疗神经系统疾病的种子细胞。本研究利用化学去细胞的方法制成去细胞肌肉支架，并把羊膜上皮细胞种入去细胞肌肉支架内，探究两者的相容性，为开展组织工程治疗神经系统方面的疾病提供新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 Wistar 大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。
1.1.2 试剂 IMDM培养基及小牛血清由Hyclone 公司提供。5′溴尿嘧啶核苷(BrdU) 及BrdU 单克隆抗体购自Neomarker公司;神经营养素(NT)3,脑源性神经营养因子(BDNF)兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德公司，SABC免疫组化试剂盒购自福州迈新生物公司。人羊膜上皮细胞株为本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 去细胞肌肉支架的制备 参考 Brown等〔6〕去细胞膀胱的制作方法制备去细胞肌肉支架，简述如下：取Wistar大鼠腹锯肌，放入蒸馏水中，在摇床中以37℃、50 r/min摇48 h后,转入3%的TritonX100溶液,摇床中37℃、50 r/min摇48 h。然后放入蒸馏水中，摇床37℃、50 r/min摇48 h。换成1% SDS溶液，摇床37℃，50 r/min摇48 h。PBS洗24 h。PBS中4℃保存备用。
1.2.2 支架形态结构的观察及成分鉴定 肉眼观察去细胞肌肉的形态。去细胞肌肉用4%多聚甲醛PBS固定1 h，5%蔗糖90 min，15%蔗糖90 min，30%蔗糖过夜以梯度脱水，OCT包埋，冷丙酮速冻，之后放入-70℃冰箱保存。恒冷箱切片机切片，HE 染色，观察其内部结构。此外对切片进行Van Gienson(VG)染色和 Weigert染色(VG+ET染色)检测支架的细胞外基质成分。
1.2.3 人羊膜上皮细胞的培养 人羊膜上皮细胞在DMEM培养液中(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素，200 μg/ml的谷氨酰胺)，37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，待单层培养细胞生长至80%汇合后，传代培养。
1.2.4 人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架相容性的鉴定
1.2.4.1 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合，弃去培养液，0.25%胰蛋白酶消化，当胞体回缩，细胞间隙变宽时，用血清终止消化，反复轻吹瓶壁细胞，制成单细胞悬液于离心管中，1 000 r/min，离心3 min。用DMEM重悬细胞。用1 ml注射器吸入细胞悬液，以2×106/ml 密度注入去细胞肌肉支架中分装至24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，培养1 w。掺入Brdu(终浓度为10 mg/L)，继续培养1 d后，恒冷箱切片机切片(方法同前)。切片经PBS 洗后，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min，血清封闭20 min;一抗用BrdU(1∶1 000稀释)单克隆抗体，BDNF和NT3多克隆抗体(1∶100稀释)4℃孵育过夜，PBS 洗后，二抗37℃孵育30 min，PBS 洗后，SABC37℃孵育30 min，DAB显色。光镜下观察。
1.2.4.2 扫描电子显微镜鉴定羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架上的生长情况 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合时，用上述方法消化下来后，把羊膜上皮细胞种植到去细胞肌肉支架中，放在24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养7 d后，用2%戊二醛固定后，梯度乙醇脱水，CO2临界点干燥，镀膜，采用扫描电子显微镜观察并拍照。
2 结 果
2.1 支架的组织结构与成分 去细胞肌肉外观呈乳白色,半透明,质地柔软。从大体上看，肌肉去细胞前后整体大小与形状无显著变化。支架纵切面的HE染色观察可见骨骼肌细胞成分消失,而纤维网架结构保持完整，支架内主要为平行管道。VG+ET染色证明支架成分主要为胶原纤维和弹力纤维等细胞外基质成分，胶原纤维为红色波浪状结构，弹性纤维为蓝色丝状结构，见图1。
2.2 羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架的兼容性 见图2，HE染色显示人羊膜上皮细胞在支架中生长良好，分布均匀(图
图1 去细胞肌肉支架大体与组织切片染色
图2 去细胞肌肉支架的病理图片2A)。免疫组化染色显示，BrdU阳性细胞数目多，提示支架中的人羊膜上皮细胞有增殖能力(图2B)。抗NT3和BDNF染色显示，支架中的人羊膜上皮细胞含有NT3、BDNF阳性颗粒，呈棕褐色分布在细胞质中(图2C，2D)。JSM5600LV扫描电子显微镜显示，在支架内部分布有大量细胞，细胞在支架中分布比较均匀，生长状态良好(图2E)。
3 讨 论
理想的支架材料应与细胞外基质类似，与活体细胞有良好的生物相容性〔7，8〕。去细胞肌肉作为治疗神经损伤的生物工程支架材料有如下优势：(1)去细胞肌肉的细胞外基质成分对组织细胞的'迁移、黏附、生长代谢都有重要作用，研究表明再生的轴突可以很好的黏附在去细胞肌肉支架上〔9〕。(2)去细胞肌肉的排列结构与神经膜管类似,仅在直径上略大于神经膜管〔10〕，它们提供了轴突可生长穿过的足够空间〔9〕，该结构对于诱导神经轴突再生是十分重要的。 Fansa等比较了接种施万细胞的不同去细胞生物材料(肌肉，静脉，神经外膜)桥接缺损的外周神经的结果，发现缺乏神经膜管样结构的去细胞肌肉支架(静脉和神经外膜支架)中的再生轴突是无序和排列混乱的，而有神经膜管样结构的去细胞肌肉支架中的再生轴突是有序排列的〔11〕。这种轴突再生的有序性对神经损伤的轴突再生同样也是十分重要的。(3)去细胞肌肉引起的免疫排斥反应较小〔9，12〕。这些优势都说明去细胞肌肉可作为治疗神经损伤的理想的材料。本研究采用的制作去细胞肌肉的方法主要用来减少异种移植材料的免疫排斥反应。该方法能有效的去除脂膜和膜相关抗原以及可溶性蛋白，并能有效的保留细胞外基质成分的原始空间结构。肌细胞正常呈平行分布，其细胞外基质成分也是平行分布的，从支架纵切面的结果看支架的纤维成分也是平行排布的，VG+ET染色结果显示细胞外基质的主要成分胶原纤维和弹性纤维保持完好。这些结果进一步证实此方法可成功制备去细胞肌肉支架。
由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限〔13〕，去细胞肌肉的生物相容性也有待验证。本研究用人羊膜上皮细胞作为种子细胞种入去细胞肌肉支架以探讨其相容性。研究表明，羊膜上皮细胞中含有多种生物活性因子，包括黏蛋白、转移生长因子、前列腺素E、表皮生长因子样物质,IL1，IL8 等因子，另外，还可分泌BDNF和NT3等重要的神经营养因子〔4〕。其中层黏蛋白、BDNF和NT3等生物活性因子对神经损伤的治疗具有十分重要的作用。羊膜上皮细胞可作为一种较理想的种子细胞，与去细胞肌肉支架结合可能成为治疗神经系统疾病的一个理想的组织工程材料。本实验观察到人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中分布均匀，抗BrdU、BDNF及NT3免疫组化显示去细胞肌肉支架中羊膜上皮细胞有良好的增殖能力，并能表达BDNF和NT3，说明羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中保持了良好的生物学活性。以上结果一方面证明了本研究制作的去细胞肌肉支架有良好的生物相容性，另一方面为应用羊膜上皮细胞和去细胞肌肉支架结合治疗神经系统疾病提供了理论和实验基础。
总之 ，本研究成功制备了去细胞肌肉支架，并证实人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中能分泌重要的神经营养因子，人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体为神经缺损再生提供了基底膜、神经营养因子等种种有利因素，构成了良好的神经再生微环境，有利于使神经缺损得到较好地修复，为进一步研究羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体治疗神经损伤奠定了一定的实验基础。
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12 Brown AL，Farhat W，Merguerian PA,et al.22 week assessment of bladder acellular matrix as a bladder augmentation material in a porcine model〔J〕.Biomaterials,2002;23：217990.
13 李培建，李兵仓，胥少汀.肌基膜管移植修复脊髓缺损的实验研究〔J〕.中华创伤杂志,2001;17(9)：5258.
细胞生物学的兴起从1893年O.赫特维希出版专著《细胞与组织》起到20世纪50年代，细胞学逐步从形态的描述和实验转向结构和功能的探讨。1931年E.鲁斯卡和M.克诺尔创建了第一台透射式电子显微镜，到1945年分辨率已达到 20埃。50、60年代随着电子显微镜的改进与相应技术的建立，以及受分子生物学的影响，对细胞的观察研究进入了新的层次，人们力求从亚细胞结构水平甚至分子水平结构上阐明细胞的整体功能。这就使细胞学发展到一个新的阶段，成为一门新兴的独立分支学科──细胞生物学。一.细胞概念的发展 1925年美国细胞学家E.B.威尔逊出版的《发育和遗传中的细胞》(第 3版)是19世纪中后期以来，有关细胞学研究的总结。他所提出的光学显微镜下的细胞模式图，包括细胞膜、细胞核、细胞质以及主要的细胞器和内含物等，一直沿用到1950年。50年代起,随着电镜的广泛应用,发现膜是细胞的基本结构。60年代还发现细胞质内的微管和微丝，以及由微管按一定规律集聚成的鞭毛、纤毛、基体和中心体等。因此，到70年代开始提出细胞主要是由膜系统结构组成的复杂的动态体系，它既有膜相结构（如细胞膜、内质网、高尔基器、核膜、线粒体、溶酶体、过氧化酶体等），又有非膜相结构（如核糖体、中心体、微管、微丝、细胞质基质、核仁、染色质、核基质等）。对于细胞的生物学特性则概括为：细胞是遗传信息和代谢信息的储存和传递的系统；细胞是从小分子合成复杂大分子，特别是核酸和蛋白质的系统；细胞又是一个内部有能量流动，并保持整体动态平衡的开放系统。二. 细胞膜的结构和功能1917年美国化学家、物理学家I.朗缪尔发表单分子薄膜的开创性实验结果，为现代的细胞膜结构概念奠定了基础。1935年英国生物学家J.F.丹尼利和 H.戴维森提出“丹尼利-戴维森模型”。他们认为细胞表面膜有一个类脂构成的核心，脂分子的极性端朝外，每边覆盖一层单分子的蛋白。50年代以来通过瑞典生物学家F.S.舍斯特兰德、美国物理学家J.D.罗伯逊等各自用电子显微镜所作的研究，于1959年指出多数膜是由暗-明-暗，即蛋白-磷脂-蛋白三层组成的“三合板”式结构。这种膜的模型有相当普遍性，故称单位膜。单位膜膜型未能反映膜的动态结构和膜功能的多样性与专一性。到70年代，又有人先后提出“流体镶嵌膜”模型，“晶格镶嵌膜”模型，反映了膜的流动性，但仍无定论。后来知道，把细胞与外界环境分隔开来的细胞外周膜的功能十分复杂。60年代以来的大量研究工作表明外周膜具有物质转运、能量转换、信息传递、细胞和分子识别等重要功能。三. 染色体的结构1924年确认植物细胞核同动物细胞核相同,也含有DNA。到30～40年代已分析出染色质内含有DNA、RNA，酸性蛋白和碱性组蛋白。50年代对各主要成分进行了定量测定,并明确了DNA和组蛋白结合成的核蛋白是染色体的主要成分。60年代又根据所含赖氨酸、精氨酸的多少，将组蛋白划分为H1、H2a、H2b、H3、H4五种。1953年DNA双螺旋结构的阐明,推动了染色体结构的研究。1957年美国的泰勒提出的边链模型，属于“蛋白质骨架”模型。同年英国的威尔金斯则提出以DNA为核心的模型。这两类模型在60～70年代均各有发展。1974年由A.L.奥林斯、D.E.奥林斯、科恩伯格和奥特脱等提出并经过多方证明的核小体模型,又完全替代了以DNA为核心的超盘绕模型。反映了对染色体结构的新认识。四. 线粒体的结构和功能1934年美国解剖学家R.R.本斯利和 N.L.霍尔成功地分离了豚鼠肝脏的线粒体， 开创了用生化方法直接研究细胞器的广阔前景。1948年已确定线粒体是细胞呼吸的场所，又是细胞能量转换的中心。50年代，罗马尼亚裔的美国细胞生物学家G.E.帕拉德(1952)和F.S.舍斯特兰德(1954)分别发表线粒体结构的报告,虽略有差异,但主要方面比较一致。1956年G.E.帕拉德提出线粒体由外膜、内膜、脊、外室、内室和基质等组成，不久就得到了普遍的承认。1962年用负染色法发现线粒体的内膜粒子。以后通过拆离重组实验，证明内膜粒子即ATP酶复合体。1973年查明ATP酶复合体头部、柄部和基部的各亚单位和分子量，其分子量总和与整体测定的分子量接近。线粒体最重要的功能是进行与 ATP合成有关的氧化磷酸化作用。关于氧化磷酸化的机理研究，1953年德国生化学家E.C.斯莱特提出化学偶联假说；1961年英国生化学家P.米切尔提出化学渗透偶联假说；1964年先由P.D.博耶后又由 D.E.格林提出构型偶联假说。3种假说都认为偶联涉及一种最初的受能状态，如高能的中间产物，H□离子梯度及构型的变化等，并由它们推动 ATP的合成。三者都各有依据，但也有未能证实的方面。
血清肿瘤标志物联合检测在肺癌诊断中的问题综论文
【 摘要 】 目的 探讨血清肿瘤标志物癌胚抗原（CEA）、细胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、鳞状细胞癌相关抗原（SCCA）联合检测在肺癌诊断中的临床应用价值。方法 68例肺癌患者为肺癌组， 65例健康体检者为对照组， 采用微粒子化学发光法检测血清中CEA、CYFRA21-1、NSE、SCCA含量， 并比较肿瘤标志物单独或联合检测肺癌的灵敏度、特异度和准确度。结果 肺癌组血清CEA、CYFRA21-1、NSE、SCCA含量均明显高于对照组（P<0.05）， 4种肿瘤标志物联合检测的灵敏度为81%， 准确度为86%， 明显高于单独检测， 差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 血清CEA、CYFRA21-1、NSE、SCCA检测在肺癌诊断中具有临床应用价值， 联合检测可提高诊断的灵敏度和准确度， 且具有较好的特异度， 有助于提高肺癌的检出率。
【关键词】 肺癌；肿瘤标志物；联合检测
目前， 肺癌的发病率和死亡率均位于我国恶性肿瘤之首[1]。肺癌早期发现和治疗具有重要的临床意义。血清肿瘤标志物不仅可用于肿瘤诊断， 并且对肿瘤分期、疗效及预后判断有重要的临床价值[2]， 但单项检测肿瘤标志物具有局限性， 本文通过检测CEA、CYFRA21-1、NSE、SCCA这4种肿瘤标志物在肺癌患者血清中的表达， 探讨肿瘤标志物在肺癌诊断中的应用价值及联合检测的意义。现报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 选择2011年7月～2013年12月在本院住院治疗的肺癌患者68例为肺癌组， 男39例， 女29例， 平均年龄（67.2±14.9）岁， 经病理组织学检查确诊为鳞癌的27例， 腺癌24例， 小细胞肺癌17例， 同期健康体检者65例为对照组， 男37例， 女28例， 平均年龄（67.6±15.1）岁。两组一般资料比较， 差异无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。
1. 2 检测方法 采集受检者清晨空腹静脉血4 ml， 及时分离血清， 采用微粒子化学发光法， 用深圳新产业PLUS200仪器及配套试剂检测CEA、CYFRA21-1、NSE、SCCA水平， 严格按仪器标准操作规程及试剂说明书操作， 检测当日室内质控均再控。正常参考区间分别为CEA 0～5 ng/ml， CYFRA21-1 0～7 ng/ml， NSE 0～10 ng/ml， SCCA 0～2.5 ng/L。
1. 3 阳性判定标准 单项检测时以结果大于正常参考区间上限为阳性， 联合检测时4种肿瘤标志物中有一项为阳性即判定为阳性。
1. 4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 组间比较采用t检验；计数资料以百分率（%）表示， 组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。按照标准公式计算肿瘤标志物对肺癌诊断的灵敏度、特异度和准确度。灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）×100% ；特异度=真阴性/（真阴性+假阳性）×100%；准确度=（真阳性+真阴性）/（真阳性+假阳性+真阴性+假阴性）×100%。
2 结果
2. 1 4种血清肿瘤标志物含量比较 肺癌组血清CEA、CYFRA21-1、NSE、SCCA含量均明显高于对照组， 差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2. 2 不同病理组织类型肺癌患者4种血清肿瘤标志物阳性率比较 CEA在肺腺癌中的阳性率高于鳞癌和小细胞肺癌（P<0.05）；cyfra21-1在3种肺癌中的阳性率均较高， p="">0.05）；NSE在小细胞肺癌中的阳性率高于鳞癌和腺癌（P<0.05）；SCCA在鳞癌中的阳性率高于腺癌和小细胞肺癌（P<0.05）。4项联合检测的阳性率均高于单项检测。见表2。
2. 3 4种肿瘤标志物单项和联合检测用于诊断肺癌的灵敏度、特异度和准确度 4种肿瘤标志物单独用于诊断肺癌时， 灵敏度最高的是CYFRA21-1（56%）， 最低的.是CEA （29%）， 4种指标联合检测后灵敏度可达81%， 4种肿瘤标志物联合检测的灵敏度、准确度均明显高于各项单独检测， 差异有统计学意义（P<0.05）。联合检测后特异度略有下降， p="">0.05）。见表3。
3 讨论
肺癌是一种恶性肿瘤。近年来， 虽然临床肿瘤诊断和治疗学有着很大的进展， 但肺癌的死亡率仍然居高不下[3]， 肺癌的诊断除影像学、细胞学和组织病理学以外， 肿瘤标志物的检测也是一种主要方法。肿瘤标志物主要是指在血液、体液及组织中可检测到的与肿瘤相关的物质， 这些物质达到一定的水平时能揭示某些肿瘤的存在， 肿瘤标志物在肿瘤发生明显影像学改变之前就可以通过血清学方法检测出来， 为肿瘤的早期诊断、早期治疗提供了一个新的途径。由于肺癌组织病理的多样性， 同种病理组织细胞的异质性和肿瘤生物学行为的复杂性， 多种肿瘤标志物联合检测不失为一种能有效提高肺癌检出率的手段[4]。
CEA属于非器官特异性肿瘤相关抗原， 也是最早被发现的肿瘤标志物之一， 在肿瘤的发生和转移过程中有十分重要的作用[5]。肿瘤状态时， 癌细胞分泌CEA进入血液和淋巴循环， 因此肿瘤患者血清中CEA含量可见不同程度的升高。本研究表明， 肺癌患者血清CEA水平明显高于健康对照组， 并且在肺腺癌中的阳性率达到75%， 在鳞癌和小细胞肺癌中的阳性率较低， 分别为26%和24%， 因此CEA可作为肺腺癌的辅助性诊断指标之一。
NSE是一种糖酵解酶， 为烯醇化酶的同工酶， 存在于中枢、周围神经组织和神经外胚层起源的恶性肿瘤中， 小细胞肺癌是一种神经内分泌起源的肿瘤， NSE作为小细胞肺癌的血清肿瘤标志物具有较高的敏感度和特异度[6]。本研究结果显示NSE在小细胞肺癌中的阳性率为71%， 在鳞癌和腺癌中的阳性率较低， 分别为22%和25%， 也证明了NSE在鳞癌和腺癌的诊断中意义较低， 可作为小细胞肺癌的辅助性诊断指标之一。
CYFRA21-1是细胞角蛋白19的片段， 为正常及恶性的上皮细胞支架蛋白， 主要分布在单层上皮细胞， 在上皮组织来源的肿瘤组织中的含量明显增高， 是非小细胞肺癌较敏感的肿瘤标志物[7]。本研究观察到CYFRA21-1在肺鳞癌中的阳性率为78%， 其次是肺腺癌， 阳性率为54%， 在小细胞肺癌中的阳性率很低， 与文献报道一致。
SCCA为鳞状细胞癌相关抗原， 是用单克隆技术从肿瘤相关抗原TA4提纯出的一个糖蛋白片段， 本研究观察到SCCA在肺鳞癌中的阳性率为67%， 在腺癌和小细胞癌中的阳性率均较低。
本研究结果显示4种肿瘤标志物在肺癌患者血清中的含量均明显高于健康对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）， 表明这4种肿瘤标志物的检测在肺癌的临床诊断中均有一定的应用价值。但单项检测的阳性率均不高， CEA仅在肺腺癌中阳性率较高， NSE可作为小细胞肺癌的辅助性诊断指标之一， CYFRA21-1在肺鳞癌中的阳性率较高， SCCA是具有较好特异度的鳞癌标志物。而这4种肿瘤标志物联合检测后在各组织类型的肺癌中均具有较高阳性率。研究也表明， 它们作为单一诊断指标应用于临床具有一定的特异性， 但灵敏度和准确度均不理想， 联合检测后提高了灵敏度和准确度， 有利于肺癌的早期诊断和治疗。
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肺癌 是致死率较高的癌种，死亡病例一直高居世界癌症死亡榜首。近年来，随着免疫治疗的发展，以免疫疗法为基础的综合治疗大大改善了预后，并已成为治疗转移性非小细胞肺癌的主要方法。 新辅助免疫治疗 包括术前和术后。其主要目的是激活患者的免疫系统，诱导已经浸润到肿瘤内部的免疫细胞发挥抗肿瘤作用，杀灭肿瘤细胞，缩小肿瘤，降低肿瘤分期。 近期，一项 新辅助免疫治疗 研究项目NADIM刊发了其3年随访结果，显示新辅助免疫治疗联合化疗，能够为可切除IIIA期小细胞肺癌患者带来病理缓解和生存获益。 NADIM是一项II期研究，共纳入46例IIIA期可切除的非小细胞肺癌患者。具体的 治疗方案 如下： 01 患者接受三个周期的纳武利尤单抗+紫杉醇+卡铂治疗，每21天为一个周期。 02 在治疗结束后6-7周内进行手术。 03 手术后的第3～8周开始接受为期1年的纳武利尤单抗术后维持治疗。 此研究的主要终点是24个月时的无进展生存期，结果在之前已经发表过：无进展生存率为63.4%，主要病理缓解率为82.9%。这次发表的论文主要涉及次要终点——3年总生存期和生物标记物的分析。 研究人员按照ITT人群和PP人群来评估无进展生存期和总生存期。 ITT人群：包括所有接受新辅助治疗的患者。 PP人群：包括所有接受肿瘤切除并至少接受一周期辅助治疗的患者。 此次研究随访数据表明，治疗完成3年后： 01 ITT组和PP组的存活率分别为81.9%和91.0%。这是IIIA期非小细胞癌患者前所未有的高存活率，其生存时间是以往历史系列报道的三倍。 02 两组患者36个月和42个月的无进展生存率均为69.6%，病情进展的患者的中位进展时间为19.4个月。 03 接受手术的患者的总生存期显著改善（HR：0.14；95%CI）。 04 27例(73.0%)患者在辅助治疗过程中出现1级或2级不良事件，最常见的是疲乏，在10例患者（27.0%）中出现，5例(13.5%)患者出现3级或4级的不良事件。没有注意到长期毒性。 生物标志物方面，研究人员发现： 01 PD-L1在肿瘤细胞中表达的高低与无进展生存期或总生存期的改善无关，无法作为预测预后的指标。 02 肿瘤突变负荷的评估与生存结果无关，无法作为预测预后的指标。 03 循环肿瘤DNA水平不但与肿瘤大小显著相关，而且，比起循环肿瘤DNA水平高的患者，循环肿瘤DN水平低的患者的无进展生存期和总生存期显著改善，提示循环肿瘤DNA可以作为预测预后的生物标志物。 小知识 循环肿瘤DNA是肿瘤细胞在坏死或凋亡过程中产生的，是一种特征性的肿瘤生物标记。 这项3年随访结果表明，新辅助纳武利尤单抗联合化疗，能够为可切除IIIA期非小细胞肺癌患者带来病理缓解和生存获益，而循环肿瘤DNA有望作为长期生存的预测指标。 不过，由于此次II期研究的样本数量较少，接下来还需要更大样本的III期随机对照试验来进一步验证。参考文献： Provencio M, Serna-Blasco R, Nadal E, et al. Overall Survival and Biomarker Analysis of Neoadjuvant Nivolumab Plus Chemotherapy in Operable Stage IIIA Non–Small-Cell Lung Cancer (NADIM phase II trial)[J]. Journal of Clinical Oncology, 2022: JCO. 21.02660.
细胞生物是指所有具有细胞结构的生物。这是我为大家整理的关于细胞生物学术论文，仅供参考!
细胞因子的生物学活性
关键字： 细胞因子
细胞因子具有非常广泛的生物学活性，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其它细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢等。
一、免疫细胞的调节剂
免疫细胞之间存在错综复杂的调节关系，细胞因子是传递这种调节信号必不可少的信息分子。例如在T-B细胞之间，T细胞产生IL-2、4、5、6、10、13，干扰素γ等细胞因子刺激B细胞的分化、增殖和抗体产生;而B细胞又可产生IL-12调节TH1细胞活性和TC细胞活性。在单核巨噬细胞与淋巴细胞之间，前者产生IL-1、6、8、10，干扰素α，TNF-α等细胞因子促进或抑制T、B、NK细胞功能;而淋巴细胞又产生IL-2、6、10，干扰素γ，GM-CSF，巨噬细胞移动抑制因子(MIF)等细胞因子调节单核巨噬细胞的功能。许多免疫细胞还可通过分泌细胞因子产生自身调节单核巨噬细胞的功能。许多免疫细胞还可通过分泌细胞因子产生自身调节作用。例如T细胞产生的IL-2可刺激T细胞的IL-2受体表达和进一步的IL-2分泌，TH1细胞通过产生干扰素γ抑TH2细胞的细胞因子产生。而TH2细胞又通过IL-10、IL-4和IL-13抑制TH1细胞的细胞因子产生。通过研究细胞因子的免疫 网络调节，可以更好地理解完整的免疫系统调节机制，并且有助于指导细胞因子做为生物应答调节剂(biologicalresponsemodifier’BRM)应用于临床 治疗免疫性疾病。图4-1 细胞因子与TH1、TH2的相互关系(略)
二、免疫效应分子
在免疫细胞针对抗原(特别是细胞性抗原)行使免疫效应功能时，细胞因子是其中重要效应分子之一。例如TNFα和TNFβ可直接造成肿瘤细胞的凋零(apoptosis)’使瘤细胞DNA断裂’细胞萎缩死亡;干扰素α、β、γ可干扰各种病毒在细胞内的复制，从而防止病毒扩散;LIF可直接作用于某些髓性白血病细胞，使其分化为单核细胞，丧失恶性增殖特性。另有一些细胞因子通过激活效应细胞而发挥其功能，如IL-2和IL-12刺激NK细胞与TC细胞的杀肿瘤细胞活性。与抗体和补体等其它免疫效应分子相比，细胞因子的免疫效应功能，因而在抗肿瘤、抗细胞内寄生感染、移植排斥等功能中起重要作用。
三、造血细胞刺激剂
从多能造血干细胞到成熟免疫细胞的分化发育漫长道路中，几乎每一阶段都需要有细胞因子的参与。最初研究造血干细胞是从软琼脂的半固体培养基开始的，在这种培养基中，造血干细胞分化增殖产生的大量子代细胞由于不能扩散而形成细胞簇，称之为集落，而一些刺激造血干细胞的细胞因子可明显刺激这些集落的数量和大小因而命名为集落刺激因子(CSF)。根据它们刺激的造血细胞种类不同有不同的命名，如GM-CSF、G-CSF、M-CSF、multi-CSF(IL-3)等。目前的研究表明，CSF和IL-3是作用于粒细胞系造血细胞，M-CSF作用于单核系造血细胞，此外Epo作用于红系造血细胞，IL-7作用于淋巴系造血细胞，IL-6、IL-11作用于巨核造血细胞等等。由此构成了细胞因子对造血系统的庞大控制 网络。某种细胞因子缺陷就可能导致相应细胞的缺陷，如肾性贫血病人的发病就是肾产生Epo的缺陷所致，正因如此，应用Epo 治疗这一疾病收到非常好的效果。目前多种刺激造血的细胞因子已成功地用于临床血液病，有非常好的 发展前景。
四、炎症反应的促进剂
炎症是机体对外来刺激产生的一种病理反应过程，症状表现为局部的红肿热痛，病理检查可发现有大量炎症细胞如粒细胞、巨噬细胞的局部浸润和组织坏死，在这一过程中，一些细胞因子起到重要的促进作用，如IL-1、IL-6、IL-8、TNFα等可促进炎症细胞的聚集、活化和炎症介质的释放’可直接刺激发热中枢引起全身发烧’IL-8同时还可趋化中性粒细胞到炎症部位’加重炎症症状.在许多炎症性疾病中都可检测到上述细胞因子的水平升高.用某些细胞因子给动物注射’可直接诱导某些炎症现象’这些实验充分证明细胞因子在炎症过程中的重要作用.基于上述理论研究结果’目前已开始利用细胞因子抑制剂治疗炎症性疾病’例如利用IL-1的受体拮抗剂(IL-1receptor antagonist’IL-lra)和抗TNFα抗体治疗败血性休克、类风湿关节炎等，已收到初步疗效。
五、其它
许多细胞因子除参与免疫系统的调节效应功能外，还参与非免疫系统的一些功能。例如IL-8具有促进新生血管形成的作用;M-CSF可降低血胆固醇IL-1刺激破骨细胞、软骨细胞的生长;IL-6促进肝细胞产生急性期蛋白等。这些作用为免疫系统与其它系统之间的相互调节提供了新的证据。
细胞衰老的分子生物学机制
摘要：细胞衰老(cellular aging)是细胞在其生命过程中发育到成熟后，随着时间的增加所发生的在形态结果和功能方面出现的一系列慢性进行性、退化性的变化。细胞衰老是基因与环境共同作用的结果，是细胞生命活动过程的客观规律。为研究细胞衰老分子生物学机制，本文就此展开研究。
关键词：细胞衰老;分子生物学;机制研究
细胞的衰老和死亡与个体的衰老和死亡是两个不同的概念，个体的衰老并不等于所有细胞的衰老，但是细胞的衰老又是同个体的衰老紧密相关的。细胞衰老是个体衰老的基础，个体衰老是细胞普遍衰老的过程和结果。
细胞衰老是正常环境条件下发生的功能减退，逐渐趋向死亡的现象。衰老是生界的普遍规律，细胞作为生物有机体的基本单位，也在不断地新生和衰老死亡。生物体内的绝大多数细胞，都要经过增殖、分化、衰老、死亡等几个阶段。可见细胞的衰老和死亡也是一种正常的生命现象。我们知道，生物体内每时每刻都有细胞在衰老、死亡，同时又有新增殖的细胞来代替它们。
衰老是一个过程，这一过程的长短即细胞的寿命，它随组织种类而不同，同时也受环境条件的影响。高等动物体细胞都有最大增殖能力(分裂)次数，细胞分裂一旦达到这一次数就要死亡。各种动物的细胞最大裂次数各不相同，人体细胞为50～60次。一般说来，细胞最大分裂次数与动物的平均寿命成正比。通过细胞衰老的研究可了解衰老的某些规律，对认识衰老和最终找到延缓或推迟衰老的方法都有重要意义。细胞衰老问题不仅是一个重大的生物学问题，而且是一个重大的社会问题。随着科学发展而不断阐明衰老过程，人类的平均寿命也将不断延长。但也会出现相应的社会老龄化问题以及呼吸系统疾病、心血管系统疾病、脑血管病、癌症、关节炎等老年性疾病发病率上升的问题。因此衰老问题的研究是今后生命科学研究中的一个重要课题。
1 细胞衰老的特征
科学研究表明，衰老细胞的细胞核、细胞质和细胞膜等均有明显的变化：①细胞内水分减少，体积变小，新陈代谢速度减慢;②细胞内酶的活性降低;③细胞内的色素会积累;④细胞内呼吸速度减慢，细胞核体积增大，核膜内折，染色质收缩，颜色加深。线粒体数量减少，体积增大;⑤细胞膜通透性功能改变，使物质运输功能降低。形态变化总体来说老化细胞的各种结构呈退行性变化。
衰老细胞的形态变化表现有：①核：增大、染色深、核内有包含物;②染色质：凝聚、固缩、碎裂、溶解;③质膜：粘度增加、流动性降低;④细胞质：色素积聚、空泡形成;⑤线粒体：数目减少、体积增大;⑥高尔基体：碎裂;⑦尼氏体：消失;⑧包含物：糖原减少、脂肪积聚;⑨核膜：内陷。
2 分子水平的变化
①从总体上DNA复制与转录在细胞衰老时均受抑制，但也有个别基因会异常激活，端粒DNA丢失，线粒体DNA特异性缺失，DNA氧化、断裂、缺失和交联，甲基化程度降低;②mRNA和tRNA含量降低;③蛋白质含成下降，细胞内蛋白质发生糖基化、氨甲酰化、脱氨基等修饰反应，导致蛋白质稳定性、抗原性，可消化性下降，自由基使蛋白质肽断裂，交联而变性。氨基酸由左旋变为右旋;④酶分子活性中心被氧化，金属离子Ca2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+等丢失，酶分子的二级结构，溶解度，等电点发生改变，总的效应是酶失活;⑤不饱和脂肪酸被氧化，引起膜脂之间或与脂蛋白之间交联，膜的流动性降低。
3 细胞衰老原因
迄今为止，细胞衰老的本质尚未完全阐明，难以给明确的定义，只能根据现有的认识，从不同的角度概括细胞衰老的内涵。细胞衰老是各种细胞成分在受到内外环境的损伤作用后，因缺乏完善的修复，使“差错”积累，导致细胞衰老。根据对导致“差错”的主要因子和主导因子的认识不同，可分为不同的学说，这些学说各有其理论基础和实验证据[1]。
3.1差错学派 有以下七种学说，有代谢废物积累学说、大分子交联学说、自由基学说、体细胞突变学说、DNA损伤修复学说、端粒学说、生物分子自然交联说等。其中最主要的自由基学说和端粒学说。
3.1.1自由基学说 自由基是一类瞬时形成的含不成对电子的原子或功能基团，普遍存在于生物系统。其种类多、数量大，是活性极高的过渡态中间产物。正常细胞内存在清除自由基的防御系统，包括酶系统和非酶系统。前者如：超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)，非酶系统有维生素E，醌类物质等电子受体。机体通过生物氧化反应为组织细胞生命活动提供能量，同时在此过程中也会产生大量活性自由基。自由基的化学性质活泼，可攻击生物体内的DNA、蛋白质和脂类等大分子物质，造成损伤，如DNA的断裂、交联、碱基羟基化。实验表明DNA中OH8dG(8-羟基-2‘-脱氧鸟苷)随着年龄的增加而增加。OH8dG完全失去碱基配对特异性，不仅OH8dG被错读，与之相邻的胞嘧啶也被错误复制。大量实验证明实，超氧化物岐化酶与抗氧化酶的活性升高能延缓机体的衰老。Sohal等(1994、1995)，将超氧化物岐化酶与过氧化氢酶基因导入果蝇，使转基因株比野生型这两种酶基因多一个拷贝，结果转基因株中酶活性显著升高，平均年龄和最高寿限有所延长。
英国学者提出的自由基理论认为自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因。自由基就是一些具有不配对电子的氧分子，它们在机体内漫游，损伤任何于其接触的细胞和组织，直到遇到如维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、OPC(原花青素)之类的生物黄酮等抗氧化剂将其中和掉或被机体产生的一些酶(如SOD)将其捕获。自由基可破坏胶原蛋白及其它结缔组织，干扰重要的生理过程，引起细胞的DNA突变。此外还可引起器官组织细胞的破坏与减少[2]。例如神经元细胞数量的明显减少，是引起老年人感觉与记忆力下降、动作迟钝及智力障碍的又一重要原因。器官组织细胞破坏或减少主要是由于自由基因突变改变了遗传信息的传递，导致蛋白质与酶的合成错误以及酶活性的降低。这些的积累，造成了器官组织细胞的老化与死亡。
生物膜上的不饱和脂肪酸易受自由基的侵袭发生过氧化反应，氧化作用对衰老有重要的影响，自由基通过对脂质的侵袭加速了细胞的衰老进程[3]。 自由基作用于免疫系统，或作用于淋巴细胞使其受损，引起老年人细胞免疫与体液免疫功能减弱，并使免疫识别力下降出现自身免疫性疾病。
3.1.2端粒学说 染色体两端有端粒，细胞分裂次数多，端粒向内延伸，正常DNA受损。
3.2遗传学派 认为衰老是遗传决定的自然演进过程，一切细胞均有内在的预定程序决定其寿命，而细胞寿命又决定种属寿命的差异，而外部因素只能使细胞寿命在限定范围内变动。
参考文献：
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[2]胡玉萍，吴建平.细胞衰老与相关基因的关系[J].中外健康文摘，2012，09(14)：35-37.
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免疫学的发展是人们在实践中不断探索、不断总结和不断创新的结果。下面我给大家分享一些免疫学技术论文，大家快来跟我一起欣赏吧。
心理神经免疫学研究
摘要心理神经免疫学(Psychoneuroimmunology)是一门探索人类心身健康奥秘的新型边缘学科。它研究神经系统如何将心理因素转换为可以影响健康的生理状态的机制，特别是脑和行为如何影响免疫系统，又如何受到免疫系统的影响的。免疫系统和神经系统之间是否真正存在联系一直有争论，我们实验室围绕高级神经活动对免疫系统的作用开展了研究。工作包括：条件反射性免疫抑制和增强、情绪应激与免疫、心理行为干预与癌症等。这些工作不仅证实了心理调控，比如信号刺激、情绪和意念想象等，确实可以影响免疫系统的功能，而且对有关机制进行了探讨。
关键词心理神经免疫学，条件反射性免疫，情绪应激，心理行为干预。
分类号B845
有人统计，人类疾病有2/3与心理刺激、生活境遇有关，其中心身疾病占1/3。实际上，心理因素可以影响生理因素的观点是各国文化群体都普遍认可的。也就是说，精神和躯体之间是互相联系的。然而心理因素如何影响健康和疾病却一直是个谜。随着科学的发展，一门新兴交叉型边缘学科，心理神经免疫学(Psychoneuro- immunology)诞生了。它融合了心理学、生物化学、免疫学、行为学、解剖学、分子生物学和临床医学等多种学科，研究神经系统如何将心理因素转换为可以影响健康的生理状态的机制，特别是脑和行为如何影响免疫系统，又如何受到免疫系统的影响的。这些研究对认识精神活动在健康和疾病中的作用打开了科学之窗。人们看到了免疫系统，这一保护机体免受传染病和肿瘤侵袭的防御系统，是精神和躯体之间的桥梁[1,2]。但是，尽管已经有很多研究表明神经系统可以影响免疫系统，依然有不少生理学家认为免疫系统是独立的自我调节系统。实际上这涉及一个由来已久的争议问题，即心身分离还是心身交互作用的问题。本文的目的就是依据我们自己的工作，阐明心理行为因素在调节免疫功能中的作用及其相应的机制。这些工作包括了条件反射性免疫抑制和增强、情绪应激的免疫效应、心理行为干预与癌症等。
1心理神经免疫调节的研究
1.1条件反射性免疫抑制和增强
条件反射性免疫是中枢神经系统调节免疫系统的重要证据。自从Ader和Cohen在1975年第一次发表关于条件反射性免疫抑制(conditioned immunosuppression, CIS)的工作以来，这一实验范式得到了广泛的关注。在这种实验范式中，一种对于实验动物来说在味觉上新异的溶液，比如糖精水，被用作条件刺激(conditioned stimulus, CS)，而免疫抑制剂如环磷酰胺、环孢霉素A等具胃肠道毒副效应的药物作为非条件刺激(unconditioned stimulus, UCS)，二者配对呈现。随后再次给与条件刺激，则发现实验对象出现了条件性味觉厌恶的行为现象，而且免疫功能也受到了显著的抑制。针对这一现象的解释是有争议的。有的认为这是条件反射性的调节作用，是中枢神经系统调控免疫功能的重要证据之一。另一些则认为可能是应激的作用。动物对糖精水的厌恶行为也即味觉厌恶性条件反射的建立不能排除某种程度的应激的存在，而应激则会引起肾上腺皮质激素的升高，从而抑制免疫功能[3]。为弄清条件性免疫抑制的实质，我们分别采用一次性和两次性的CS-UCS结合训练方式，并在不同时程呈现条件刺激，观察由条件刺激引起的味觉厌恶性行为与条件反射性免疫抑制的关系，发现两者的表现方式和表现程度并不同步，条件反射性免疫抑制并非是厌恶行为反应或情绪应激的伴随产物 [3,4]。并进一步发现不具明显毒性作用的生物免疫抑制剂作为UCS时，也能建立条件性的免疫抑制效应[5]。条件刺激不仅可诱发动物的细胞免疫抑制反应而且可诱发体液免疫反应的抑制作用，并且随着强化水平的增加，条件反射性免疫抑制效应增强[6]。这些实验证明条件反射性免疫抑制是条件刺激的作用，而不是应激效应。对CIS的合理的解释是脑中CS―UCS的联想学习过程，中枢神经系统储存了对条件刺激(CS)的知觉信息，该条件刺激与UCS的免疫抑制反应相偶联，CS再次呈现时就产生一个直接信号激活免疫系统引起反应。
利用联想学习原理，条件反射性免疫调节应该是双向的。也就是说，条件刺激可以产生免疫抑制效应，也就可以产生免疫增强效应。建立起条件反射性免疫增强(conditioned immuno-enhancement, CIE)的模式将更有利于证明条件反射性免疫调节是中枢神经系统调控免疫系统的结果。而且由于CIE所用药物的免疫效应与CIS有所不同，CIE模式将为脑和免疫系统相互作用的研究提供新视角。为次，我们在国际上首次尝试以卵清白蛋白(ovalbumin, OVA)抗原作为非条件刺激，糖精水作为条件刺激，经过一次配对，在初次抗体反应曲线的上升阶段再次单独呈现条件刺激时，诱导出条件反射性抗OVA抗体生成的增加[7]。虽然该条件性抗体增强的幅度较低，但从统计学上看，条件反射组和非条件反射组之间有了临界值差异。但该模式最初没有得到完全成功的验证[8]。为重复检验条件性抗体增强效应，再次分别用糖精水和电针作为条件刺激，进一步观察和分析条件性抗体增强的动态反应，对条件反射性抗体增强的发生发展过程做一完整的描述。
在用糖精水作为条件刺激的重复实验中[9]，不同于先前工作的是，再次单独呈现条件刺激的时间是放在初次抗体反应的下降段，而不是放在初次抗体反应曲线的上升段。这是考虑到在基础抗体值比较低时，条件反射本身的效应可能得到充分体现。而实验结果也证实了这一点。统计学数据表明，抗体水平在条件反射组和其他控制组之间的差异均达到了p<0.01甚至0.001的水平。
我们还发现，条件刺激诱发的抗体生成曲线在动力学上与抗原再次进入体内引起的二次抗体反应曲线很相似。单独给予条件刺激后约15天左右出现明显的抗OVA抗体水平增高，20、25天左右达到峰值，以后明显下降并逐渐接近正常水平[10]。这一结果不仅仅证明了联想学习可以调节免疫功能，而且发现了条件反射性免疫过程与抗原引发免疫应答过程的基本规律是类似的。这些工作从免疫增强的方向论证了信号刺激的免疫调节作用，建立了稳定可靠的CIE模型。
从临床角度出发，条件反射性免疫增强的重要意义在于通过脑的调控提高免疫力，增强机体对疾病的抵抗力。考虑到CIE模式在人类临床应用的可能性，寻找合适的条件刺激很重要。因为甜味饮料是人类日常生活中经常会遇到的，从新异性的角度考虑，糖精水或甜味饮料都不太适用于人类。因此尝试将一种躯体感觉信号――外周电针刺激――作为条件刺激，考察它能否诱发特异性抗体增强反应。 电刺激信号是通过两支刺入肌肉5mm的细钢针发送的。为了减少实验误差，选择传统医学中的穴位足三里作为针刺的位置，因此这种条件刺激物也可以称为电针。在这个研究中我们选择的电压强度分别为2伏特和4伏特[11]。
在本研究中，先是将电针刺激和腹腔注射OVA进行一次配对。经过一段时间的间隔，再次对动物实施电针。然后分别在第二次电针后的第10，17，24和31天经尾静脉取血，检测抗体值。结果发现，不管是2伏特还是4伏特的电针，均能显著提高抗体浓度，在第10和第17天时最为明显。研究还发现，甚至在麻醉状态下，电针和卵清白蛋白也可以实现配对，也就是说，在条件反射训练时麻醉的动物也出现了反射性抗体生成增加。没有发现电针本身对抗体生成有任何影响。这些结果进一步证实，仅需经过条件刺激和非条件刺激的一次配对，再次呈现的条件刺激即可诱发出条件反射性免疫反应。验证了条件反射性抗体增强的客观存在性和普遍性。而且，电针被用作为一个有效的条件刺激物，将为把条件反射性免疫调节在临床上得到应用提供了一种可能性。
1.2条件反射性免疫调节的神经机制
条件反射性免疫抑制效应和免疫增强效应都表明与免疫无关的信号刺激能转变为具有触发免疫反应的非条件刺激的性质，这种转换必然发生在脑内，因而可以说这是脑对免疫系统调控的直接证据，但脑内究竟发生了什么并不清楚，条件反射性免疫调节的相关神经回路和脑机制还远远没有弄清[2]。为了直接洞察脑的变化，探讨脑内中枢整合机理，找寻直接观察脑内活动的指标是必要的。
C-fos蛋白是神经元激活的一个标志物。它通常处于不活动或表达很低的状态，但在受刺激时能作出短暂而迅速的反应，可成为神经元兴奋水平的客观指标。利用免疫组化技术，我们发现，再次单独呈现条件刺激可以导致包括脑干，边缘系统和大脑皮质在内的区域大量c-fos蛋白的表达。其中有一些脑区尤为重要。不论是条件性抑制范式还是条件性增强范式，再次单独呈现条件刺激都可以引起岛叶皮质、杏仁中央核和下丘脑室旁核c-fos蛋白的大量表达。这些结果表明，条件性免疫反应是和大脑的活动相关联的[10,12,13]。
但是必须指出的是，在我们和其他作者报道的关于脑机制的研究中，所采用的条件刺激物都是糖精水。我们的实验已经证实，以电针作为条件刺激也可以很好地诱发出条件性免疫改变，而电针和糖精水所激活的脑区是大不相同的，因此在今后的研究中阐明以电针为条件刺激所激活的大脑区域将有助于进一步确定与条件反射性免疫调节有关的共同脑机制，排除刺激引起的非特异性相关。
目前关于条件反射性免疫的神经化学机制研究也很缺乏。由于中枢胆碱能系统被认为与学习记忆有很密切的关系，该系统的这些功能主要是由毒蕈样受体(muscarinic receptor, M受体)介导的。为再次验证条件反射性免疫与学习过程有关，实验采用对M受体具有阻断作用的药物东莨菪碱作为工具药，考察整个M受体系统在条件反射性免疫调节中的作用。结果发现在以电针为条件刺激的条件反射性抗体增强模式的学习阶段是中枢胆碱能M受体依赖的，但在条件反射的唤起阶段是非胆碱能受体依赖的。在条件反射训练前阻断M受体，条件反射性免疫不再发生。但在条件反射训练完成后再抑制乙酰胆碱的合成，则不会影响条件刺激诱发的免疫反应。这些结果表明中枢乙酰胆碱参与了学习阶段的记忆形成过程，但不影响已经形成的记忆的再提取。这从神经生化的角度论证了条件反射性抗体生成的增加与学习记忆有关[14]。
2情绪应激与免疫
除条件反射性免疫的研究外，应激与免疫的研究是进行精神行为因素对免疫功能作用研究的另一热点[2]。已经有很多证据表明，应激可以导致免疫功能改变。但是，相关的动物研究大多采用电击或束缚的方式来引起应激效应。尽管这些模型也含有心理应激的成分，但其主要成分是生理性的。为了考察情绪应激对行为、神经内分泌和免疫功能的影响，研究采用两种情绪应激的动物模型：一种是传统的，以电击装置为信号刺激诱发曾有过电击经历大鼠的情绪应激。另一种是本实验室新建的，用空瓶刺激诱发定时喂水大鼠的情绪应激。这两种类型情绪应激源激活的脑区有许多共同点[15]。
在传统的电击信号刺激模式中[16]，动物分成4组：电击组、情绪应激组、装置对照组A1和装置对照组A2。电击组动物用OVA免疫后2周内无规律给予10分钟/日，共6日的足电击，其余时间内无处置;情绪应激组动物除给予电击组动物电击的当天同样强度和频率的足电击外，在2周内的其余时间将其每天置于电击装置内10分钟而无电击(恐惧的情绪应激);对照组A1动物仅在给予电击组动物电击的当天被置于电击装置中10分钟而无电击;对照组A2的动物则每天被置于电击装置中10分钟而无电击。结果发现情绪应激组动物的呆滞行为和排泄行为显著增加;去甲肾上腺素、肾上腺素及皮质酮水平均显著提高。在抗OVA 抗体水平和脾脏指数上， 情绪应激组动物较装置对照组A2动物显著降低，而其余各组间无显著差异。并发现脾脏指数分别与肾上腺素含量和去甲肾上腺素含量呈显著负相关。
在空瓶刺激诱发的情绪应激模式中[17]，动物先进行一周2次/日的定时饮水训练，然后腹腔注射OVA抗原以激发特异性抗体反应。此后动物被分成3组：分别为情绪应激组、生理应激组、和对照组。情绪应激组的动物每天只有一次饮水的机会，而另一次则给予一只空的饮水瓶，持续14天，以产生情绪应激。生理应激组的动物也是只有一次饮水的机会，但并不另外再给一次空瓶的刺激。这种设置的目的是控制缺水本身可能造成的生理应激的影响。对照组保持每天两次饮水不变。结果发现情绪应激产生了很显著的行为改变，即攻击行为和探究行为显著增加;血浆皮质酮、肾上腺素和去甲肾上腺素的水平显著提高;白细胞计数和抗OVA抗体浓度显著下降。抗体水平和脾脏的重量与儿茶酚胺水平之间均存在显著的负相关。但情绪应激的时间作用点和时程对应激的免疫效应有影响 。与此相对的是，缺水导致的生理应激只能诱发探究行为，升高皮质酮水平，降低白细胞计数。但它不诱发攻击行为，不影响抗体水平和脾脏指数，也不激活交感神经系统。这些结果进行了反复的验证 [18~20]。
上述两种模式的研究结果都证明，情绪应激对免疫功能产生了抑制效应，激活了下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)和交感神经系统(sympathetic nervous system, SNS)。由于抗体水平和脾脏指数与儿茶酚胺水平存在显著的负相关，而与皮质酮水平无关，提示交感神经系统的激活可能及情绪应激对体液免疫功能调节的中介机制。而皮质酮水平可能只是应激的一种反应。
为了进一步澄清HPA轴与SNS在情绪应激免疫调节中的作用 ，我们分别采用糖皮质激素合成抑制剂美替拉酮阻断HPA轴，外周交感神经末梢的6-OHDA损毁SNS的活动。结果发现，对SNS的阻断能消除情绪应激对体液免疫功能的抑制。而HPA轴的阻断没有这种作用。这些实验证明是交感神经系统介导了情绪应激所致的体液免疫抑制。进一步的证据是，非选择性β-肾上腺素能受体(β-adrenergic receptor, β-ADR)拮抗剂心得安可以逆转情绪应激诱发的体液免疫抑制作用，表明SNS是通过b-ADR介导情绪应激导致的体液免疫功能的抑制。在此基础上，进一步发现参与的受体亚型是选择性的b2-ADR而非b1-ADR[21,22]。
尽管以往大多数研究者认为，应激引起的免疫功能抑制主要是因为应激可以导致肾上腺皮质激素的释放，从而导致免疫功能下降。换句话说，免疫功能的抑制与应激激活的HPA轴有关。但采用我们的情绪应激模型，发现情绪应激引起的体液免疫功能抑制主要是由交感神经系统β-肾上腺素能受体介导的。这为阐明情绪应激的免疫抑制效应的机理提供了新资料。
3心理行为干预与癌症
正如上述研究发现的，心理因素比如情绪或者条件性学习可以引起动物的行为和免疫功能的改变。我们考虑是否可以通过心理行为干预手段来影响癌症病人的免疫功能。虽然有研究报道，癌症可以通过将心理、情绪等多种因素整合起来影响病人的整个机体，但研究结果并不一致[23]。为此，我们打算通过两个研究来考察行为干预对于癌症病人的作用。纳入第一个研究的是40个正在接受放疗的乳腺癌患者，根据年龄、教育程度、癌症分期和接受治疗的状况，她们被随机而匹配地分成两个组：一组接受为期一个月的心理行为干预，另一组作为对照。首先指导干预组病人学会渐进性肌肉放松，然后对她们进行想象训练。想象自己漫步在海滩上，初升的太阳照在脸上，海水轻柔地漫过脚面等等。然后想象免疫细胞如何杀死癌细胞，被杀死的癌细胞又是如何被海水冲刷掉。在干预的前后，分别采取病人的唾液和血液，测定NK细胞的活性。结果发现心理―行为干预可以显著提高NK细胞活性。而且需通过服药来克服放疗引起的白细胞计数降低的副作用的患者比例显著下降[24]。该研究表明，心理行为干预对免疫功能的改善和恢复具有非常显著的作用。
第二个研究纳入120名正在接受放化疗的癌症患者。同样的，依据匹配原则他们被分为一个干预组和一个控制组。除了干预的时间延长到3个月以外，其他的实验条件与上述研究基本相同。所测定的指标包括白细胞计数、NK细胞活性和免疫球蛋白(IgG，IgM，IgA)等。结果发现，干预组在所有免疫功能参数上都得到了不同程度的提高，其中NK细胞活性显著提高[25]，生活质量也都得到明显的改善，治疗引起的副作用在很大程度上也得到了缓解。不论是乳腺癌还是肺癌患者，不论是放疗患者还是化疗患者，干预组的生活质量评分，包括躯体功能、角色功能、情绪功能、认知功能和社会功能上都显著高于控制组。同时干预组的症状评分，包括疲劳、呕吐、疼痛和食欲不振等都有显著下降[26~28]。而且，通过行为干预，患者学会运用更为积极的认知方式来应对癌症，摒弃原先的逃避心理，从而使得情绪状态、身体机能和生活质量都得到很好的改善[29,30]。成长策略和社会支持有助于提高癌症生存者的生活质量，增加正性情感[31]。这些结果反复证明了，NK细胞的活性对认知行为干预的作用相当敏感，心理行为干预确实改善了癌症患者及其生存者的生活质量。免疫功能的提高， 特别是NK细胞活性的增强可能在心理行为干预中起着重要的中介作用。
4结语
中枢神经系统和免疫系统之间存在着相互作用。上述三个方面的工作证明某些心理过程，比如联想性学习、情绪、行为想象、和认知策略等确实可以对免疫功能产生影响。也即高级神经精神活动能调节免疫功能。但免疫系统的变化也能影响高级神经精神活动的功能。免疫系统的紊乱不仅导致疾病，也与衰老、性格和行为变化有关。如抑郁症或“病态行为”就与细胞因子如白细胞介素-1有关[32,33]。但这方面的研究尚需深入展开。随着中枢神经系统和免疫系统之间相互作用研究的深入，在人类健康的维护和疾病的防治上将会有新的前景。
致谢：作者感谢曾对本文的研究工作做出重要贡献的博士后、博士生、硕士生和研究助手，他们是王建平、李杰、邵枫、黄景新、陈极寰、王玮雯、刘艳、郑丽、李波、吕倩、卫星、郭友军。
参考文献
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