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摘要：目的观察中药合剂对缺氧大鼠脑组织的抗氧化保护作用。方法中药合剂的主要成分为丹参、当归、党参、黄芪，生药含量4 g/ml。以低压舱减压模拟缺氧，分别观察低氧、常氧条件下中药合剂对SD大鼠脑组织谷胱甘肽含量（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）和过氧化氢酶（CAT）活性的影响，并检测不同浓度中药合剂在体外的抗羟自由基效力。结果①低氧暴露动物脑组织GSH含量下降，GSHPX和CAT活性降低（P＜01）。使用中药合剂后，GSH与GSHPX显著提高。②常氧状态下，中药合剂就可提高GSH含量与GSHPX活性。③体外实验显示中药合剂能直接清除H2O2/Co2+体系中产生的羟自由基。结论 在该实验条件下，中药合剂对大鼠缺氧脑组织有一定的抗氧化神经保护作用。药物的这种作用与其提高机体自身的抗氧化能力以及其直接的清除自由基作用有关。 关键词：缺氧； 中药合剂； 抗氧化； 谷胱甘肽过氧化物酶； 过氧化氢酶 Anti-oxidative Protective Effect of Chinese Herbal Mixture on Hypoxic Rat Brain XIAO Feng, JIANG ZhengLin*, LI Xia, CHEN Jian, PAN YongJin, GU Yong-Jian, SHI Zhong-yuan (Nantong University, Jiangsu Province 226001, China; Huaian Hospital Attached to Nanjing Medical University, Huaian 223000, China; Institute of Sea Engineering Sciences, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200231, China) Abstract：ObjectiveTo observe the effect of Chinese herbal mixture against hypoxic brain in MethodsHypoxic state was established in hypobaric We investigated the effects of Chinese herbal mixture on content of GSH, activities of GSH-PX and CAT of rat brain in both hypoxic and normoxic In another experiment, the hydroxyl radical scavenging activity of above mixture was measured in vitro using alizarin violet ResultsContent of GSH and activities of GSHPX and CAT all decreased significantly in hypoxic group, but GSH and GSHPX decreased less with pretreatment of Chinese herbal In normoxic state, GSH and GSH-PX were elevated with Chinese herbal In addition, Chinese herbal mixture scavenged hydroxyl radical in in vitro H2O2/Co2+ experimental system in a dosedependent ConclusionThe results suggest the mechanisms are related to the Chinese herbal mixture of this study plays an antioxidative neuroprotective role on rat brain exposed to hypoxia, and that elevation of the activity of anti-oxidative enzyme GSHPX and the content of GSH, and a direct free radical-scavenging Key wordsHypoxia; Chinese herbal mixture; Anti-oxidation; GSH-PX; Catalaze 近年的实验研究认为实施神经保护是预防和治疗缺氧脑损伤的有效措施，尤其是抗氧化药物的研制和应用已成为神经元损伤防治研究的热点之一。国内外研制的许多西药神经保护剂由于具有一定的毒副作用，临床应用受到局限〔1〕。我国传统中药抗缺氧作用的研究表明，中药具有作用温和、保护作用和神经细胞损伤的多样性相一致的特点，但目前研究限于单味药的较多，对复方制剂抗氧化、清除自由基能力的报道不多。对丹参、当归、党参、黄芪等中药的研究表明，它们均具有提高机体对缺氧的耐受性，清除氧自由基，降低血黏度，改善微循环等多种功能〔2,3〕。我们运用建立的低压低氧模型，观察预先给予上述药物制成的合剂对缺氧脑损害的抗氧化保护作用及在体内、体外的抗自由基的能力，并分析其可能的作用机理，为临床应用提供实验依据。 1 材料和方法 1 材料 SD大鼠40只，其中用于缺氧研究的24只，由南通大学实验动物中心提供，体重(240±20) g，分为常氧组（雄性5只，雌性4只）、低氧组（8只，雌雄各半）、中药合剂组（雄性4只，雌性3只）；用于常氧状态研究16只，购于上海复旦大学实验动物科学部，体重(230±20) g，分成对照组和中药合剂组，每组8只，均雌雄各半。中药合剂由上海交通大学海洋水下工程科学研究院提供，主要成分为丹参、当归、党参、黄芪，生药含量4 g/ml。GSH，GSHPX，CAT试剂盒购自南京建成生物工程研究所。茜素紫（C20H12O7）Chroma公司生产，上海化学试剂站分装厂分装，其他试剂均为国产AR级。 2 方法 1 给药方法中药合剂组均于实验（缺氧）前48，24，1 h腹腔内注射（）给药，用量：1 ml/200 g・wt。其余两组注射等量的生理盐水。 2 低氧暴露将中药合剂组和低氧组动物放入低压舱内（舱容积为01 m3），关闭舱门，调整舱内压力，在1 h内分3阶段将压力减至相当于海拔8 040 m高度的空气压力（0～3 130～6 080～8 040 m）；在中间两阶段分别停留10及15 min，保持8 040 m高度的压力5 h后加压出舱，加压时间10 min。常氧组作为实验对照在舱边常压环境下停留6 h。 3 样本制备中药合剂组和低氧组出舱后与常氧组动物一起迅速断头，取左侧脑组织，在0～4℃的冰冷生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重（约100～130 mg），加9倍量的0～4℃生理盐水，在冰水浴中用玻璃匀浆器制成10％脑匀浆，用离心机3 000 r/min，离心15 min，吸取上清液备测。常氧实验的对照组和中药合剂组动物脑匀浆的制备于最后一次给药后1 h进行。 3 检测指标 GSH，GSHPX，CAT 3种指标的测定均依试剂盒说明书按步操作。Folin酚法测定脑匀浆的蛋白含量。利用改良茜素紫光度法检测H2O2/Co2+体系产生的羟自由基，测定中药合剂对羟自由基的清除率〔4〕。测定时按文献〔5〕每个药物浓度作3个平行样，计算其平均值。 4 统计学处理脑匀浆的GSH，GSHPX，CAT测定结果用(±s)表示，用S0统计软件对数据进行统计学处理，采用单因素方差分析，两两比较用Scheffe法。羟自由基清除率的数据采用非线性回归的Four parameter logistic standard curve模拟，按下式计算EC50：y = min + (max - min) / (1 + (x / EC50)^Hillslope)。 2 结果 1 中药合剂对缺氧处理后脑匀浆GSH，GSH-PX，CAT的影响结果见表1。 表1 中药合剂对大鼠缺氧处理后脑组织GSH，GSH-PX，CAT的影响（略） 与常氧组比较，ΔP＜01；与低氧组比较，*P＜05；#P＜01 表1显示，大鼠经低氧暴露后，脑组织GSH含量,GSH-PX和CAT活力3项指标均明显降低（P＜01）。预先使用中药合剂后，再经低氧暴露，此时三项指标均有所回升，与低氧组比较GSH与GSH-PX的改变有统计学意义（P＜05或P＜01），但与常氧组比较降低仍很明显（P＜01）。结果表明中药合剂有一定的抗氧化神经保护作用。 2 中药合剂对常氧状态下脑匀浆GSH，GSH-PX，CAT的影响结果见表2。 表2 中药合剂对常氧状态下脑组织GSH，GSH-PX，CAT的影响（略） 与生理盐水组比较，*P＜05,**P＜01;n=8 表2显示，与生理盐水组比较，中药合剂组GSH，GSH-PX，CAT都有所升高，仅GSH，GSH-PX的改变有统计学意义（P＜05或P＜01）。表明常氧状态下，中药合剂能提高脑组织的GSH水平和GSH-PX活力，增强脑组织的抗氧化能力。 3 中药合剂在体外抗羟自由基的作用结果见图1。如图1所示，中药合剂在体外对羟自由基的清除率和药物浓度有明显的量-效关系，即浓度越大，清除效果越佳，但达到一定的浓度后即趋向饱和。根据计算，清除反应体系中50%的羟自由基，中药合剂的浓度(EC50)为：07 ml/10 ml，折合生药浓度为8 mg/ml。 图1 羟自由基的清除率与药物浓度量-效关系（略） 3 讨论 研究表明缺氧脑损伤是一个复杂的病理生理过程，涉及多种神经递质系统功能紊乱、细胞内钙超载、一氧化氮及自由基的神经毒性及炎性损害等机制。其中自由基急剧增高是缺氧时的重要病理生理基础〔6〕。正常情况下，人体内自由基不断产生，又不断被清除。脑缺氧时，机体内存在的氧化-抗氧化系统失衡，形成恶性循环，从而导致自由基在体内的大量堆积。清除自由基、抗氧化制剂可分为酶类自由基清除剂和非酶类自由基清除剂两大类。酶类自由基清除剂主要有超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、过氧化氢酶（CAT）。本文结果显示，缺氧导致脑匀浆中GSH-PX ，CAT活性及GSH含量下降，表明脑组织内抗氧化体系的抗氧化能力降低，而中药合剂能明显地降低缺氧时GSH含量和GSH-PX活力的下降程度，提高脑组织的抗氧化能力，有助于减轻脑缺氧损伤状况。通过进一步实验，我们发现中药合剂在正常状态下，亦能提高脑组织的GSH-PX 活性和GSH含量。并且，体外抗羟自由基实验显示，中药合剂还具有直接的清除羟自由基的作用，且具有剂量依赖关系。这些结果表明，脑缺氧时若使用中药合剂具有抗缺氧神经保护作用，这一药效可能与组方中的药物提高机体抗氧化酶的活力，以及自身就具有的清除氧自由基的作用有关。GSH具有重要的生理功能，它能通过GSH-PX还原体内不断生成的脂质过氧化物和过氧化氢，以消除它们对酶和膜蛋白上巯基的氧化作用，维持细胞及组织的正常功能及代谢〔7〕，而反应中生成的GSSG可以经谷胱甘肽还原酶所催化，利用磷酸戊糖旁路所生成的还原型辅酶Ⅱ（NADPH）重新还原成GSH缺氧时，由于过氧化物生成的速度大大超过细胞内NADPH的生成速度，使得GSH/GSSG的比值下降，并导致GSH-PX活性下降造成氧化应激，而GSH-PX是一种含硒的酶，在脑中含量高，和超氧化物歧化酶(SOD)协同处理自由基的过程中起主要作用，是主要的H2O2清除酶〔8〕，可清除线粒体和胞质中产生的H2O2，从而防止羟自由基(・OH)的产生。羟自由基的化学性质非常活泼，被认为是对生物体危害最大的自由基〔9〕，它和自由基清除剂及组织发生反应的能力都很强，这样，很高浓度的自由基清除剂才能有效果。实际上，自由基清除剂在很高浓度时，往往产生明显的副作用，这限制了许多药物的应用〔10〕，但中药有很大的优越性，其作用温和，并且作用环节多，各环节之间可能还会产生协同作用。综上所述，在本实验条件下，中药合剂对大鼠缺氧脑组织有一定的抗氧化神经保护作用，这种作用与药物提高机体自身的抗氧化能力及其直接的清除自由基作用有关。本研究为这一中药合剂用于抗缺氧脑损伤提供了重要的参考依据。 参考文献： 〔1〕 Chauhan N, Zhao ZH, Barber PA, et Lessons in experimental ischemia for clinical stroke medicine〔J〕 Curr Opin Neurol, 2003, 16(1): 〔2〕 闻红斌，章军建中药对缺氧性脑损伤保护作用及其机制的研究进展〔J〕现代中西医结合杂志，2003，12(10)： 〔3〕 张润峰，李 霞丹参与缺血再灌注损伤研究进展〔J〕山西医科大学学报，2003，17(5): 〔4〕 肖 峰，潘永进，姜正林对《茜素紫光度法检测H2O2/Co2+产生的羟自由基》一文中自由基清除率计算公式的刍议〔J〕化学试剂，2005, 27(5):301, 〔5〕 熊辉岩，张晓峰，谭大风，等大黄属三种植物不同部分提取物清除羟自由基的体外实验研究〔J〕食品科学,2003,24(1): 〔6〕 Rauca C, Zerbe R, Jantze H, et The importance of free hydroxyl radicals to hypoxia preconditioning〔J〕 Brain Res, 2000, 868(1): 〔7〕 蔡爱玲，康爱华谷胱甘肽血红蛋白与氧化应激状态〔J〕国外医学・临床生物化学与检验学分册，2002，23(3)： 〔8〕 Crack PJ, Taylor JM, de Haan JB, et glutathione peroxidase-1 contributes to the neuroprotection seen in the superoxide dismutase-1 transgenic mouse in response to ischemia/reperfusion injury〔J〕 J Cereb Blood Flow Metab, 2003, 23(1): 〔9〕 Halliwell B Free radicals and antioxidants: a personal view〔J〕 Nutr Rev, 1994, 52(8): 〔10〕 Kontos HA Oxygen radicals in cerebral ischemia:the 2001 Willis lecture〔J〕 stoke, 2001, 32(11): 基金项目：2003年江苏省高校自然科学基金资助项目（N03KJD310185) (南通大学，江苏 南通 226001; 南京医科大学附属淮安第一医院，江苏 淮安 223000;上海交通大学海洋水下工程科学研究院，上海 200231)