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高分辨率光学显微术在生命科学中的应用【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。1 传统光学显微镜的分辨率光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]：横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径, 用折射率很高的材料。Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。2 高分辨率三维显微术在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy, I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12,13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率,还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色,可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。3 表面高分辨率显微术表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域, 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。【参考文献】[1] 汤乐民,丁 斐.生物科学图像处理与分析[M].北京:科学出版社,2005：205.[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. 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分光计的调节及其棱镜折射率的测定研究与分析杨贵宏（08物理2班 200802050253）引言：我们的生活离不开阳光，通常我们认为阳光是一种单色光（单一波长的光）。其实，笼罩在我们周围的光线本身是复色光（由两种或两种以上的单色光组成的光线），他是由不同波长波线的单色光组成的。广义的说，具有周期性的空间结构或光学性能（如透射率、折射率）的衍射屏，统称光栅。光栅的种类很多，有透射光栅和反射光栅，有平面光栅和凹面光栅，有黑白光栅和正弦光栅，有一维光栅，二维光栅和三维光栅，等等。此次实验所使用的光栅是利用全息照相技术拍摄的全息透射光栅光栅的表面若被污染后不易清洗，使用时应特别注意。分光计是一种能精确测量角度的光学仪器，常用来测量材料的折射率、色散率、光波波长和进行光谱观测等。由于该装置比较精密，控制部件较多而且复杂，所以使用时必须严格按照一定的规则和程序进行调整，以便测量出准确的结果。摘要： 分光计是一种能精确测量折射角的典型光学仪器，经常用来测量材料的折射率、色散率、光波波长和进行光谱观测等。由于该装置比较精密，控制部件较多而且操作复杂，所以使用时必须严格按照一定的规则和程序进行调整，方能获得较高精度的测量结果。关键词：分光计、棱镜、折射率Abstract: The spectrometer can accurately measure the angle of refraction is a typical optical instruments, often used to measure the material's refractive index, dispersion rate, wavelength, and spectral observations. As the more sophisticated devices, control components and operation are more complex, and therefore must be used strictly in accordance with certain rules and procedures to adjust to get the high precision measurement : spectrometer, prism, the refractive index二、实验目的： 1、了解分光计结构，学会正解调节和使用分光计的方法； 2、用分光计测量三棱镜的顶角； 3、学会用最小偏向角法测量三棱镜的折射率。三、实验仪器：分光计主要由五个部件组成：三角底座，平行光管、望远镜、刻度圆盘和载物台。图中各调节装置的名称及作用见表1。 图 1分光计基本结构示意图表1 分光计各调节装置的名称和作用代号 名称 作用1 狭缝宽度调节螺丝 调节狭缝宽度，改变入射光宽度2 狭缝装置 3 狭缝装置锁紧螺丝 松开时，前后拉动狭缝装置，调节平行光。调好后锁紧，用来固定狭缝装置。4 平行光管 产生平行光5 载物台 放置光学元件。台面下方装有三个细牙螺丝7，用来调整台面的倾斜度。松开螺丝8可升降、转动载物台。6 夹持待测物簧片 夹持载物台上的光学元件7 载物台调节螺丝（3只） 调节载物台台面水平8 载物台锁紧螺丝 松开时，载物台可单独转动和升降；锁紧后，可使载物台与读数游标盘同步转动9 望远镜 观测经光学元件作用后的光线10 目镜装置锁紧螺丝 松开时，目镜装置可伸缩和转动（望远镜调焦）；锁紧后，固定目镜装置11 阿贝式自准目镜装置 可伸缩和转动（望远镜调焦）12 目镜调焦手轮 调节目镜焦距，使分划板、叉丝清晰13 望远镜光轴仰角调节螺丝 调节望远镜的俯仰角度14 望远镜光轴水平调节螺丝 调节该螺丝，可使望远镜在水平面内转动15 望远镜支架 16 游标盘 盘上对称设置两游标17 游标 分成30小格，每一小格对应角度 1’18 望远镜微调螺丝 该螺丝位于图14－1的反面。锁紧望远镜支架制动螺丝 21 后，调节螺丝18，使望远镜支架作小幅度转动19 度盘 分为360°，最小刻度为半度（30′），小于半度则利用游标读数20 目镜照明电源 打开该电源20，从目镜中可看到一绿斑及黑十字21 望远镜支架制动螺丝 该螺丝位于图14－1的反面。锁紧后，只能用望远镜微调螺丝18使望远镜支架作小幅度转动22 望远镜支架与刻度盘锁紧螺丝 锁紧后，望远镜与刻度盘同步转动23 分光计电源插座 24 分光计三角底座 它是整个分光计的底座。底座中心有沿铅直方向的转轴套，望远镜部件整体、刻度圆盘和游标盘可分别独立绕该中心轴转动。平行光管固定在三角底座的一只脚上25 平行光管支架 26 游标盘微调螺丝 锁紧游标盘制动螺丝27后，调节螺丝26可使游标盘作小幅度转动27 游标盘制动螺丝 锁紧后，只能用游标盘微调螺丝26使游标盘作小幅度转动28 平行光管光轴水平调节螺丝 调节该螺丝，可使平行光管在水平面内转动29 平行光管光轴仰角调节螺丝 调节平行光管的俯仰角四、实验原理：三棱镜如图1 所示，AB和AC是透光的光学表面，又称折射面，其夹角 称为三棱镜的顶角；BC为毛玻璃面，称为三棱镜的底面。图2三棱镜示意图 1．反射法测三棱镜顶角 如图2 所示，一束平行光入射于三棱镜，经过AB面和AC面反射的光线分别沿 和 方位射出， 和 方向的夹角记为 ，由几何学关系可知： 图3反射法测顶角2．最小偏向角法测三棱镜玻璃的折射率假设有一束单色平行光LD入射到棱镜上，经过两次折射后沿ER方向射出，则入射光线LD与出射光线ER间的夹角 称为偏向角，如图3所示。 图4最小偏向角的测定转动三棱镜，改变入射光对光学面AC的入射角，出射光线的方向ER也随之改变，即偏向角 发生变化。沿偏向角减小的方向继续缓慢转动三棱镜，使偏向角逐渐减小；当转到某个位置时，若再继续沿此方向转动，偏向角又将逐渐增大，此位置时偏向角达到最小值，测出最小偏向角 。可以证明棱镜材料的折射率 与顶角 及最小偏向角的关系式为 实验中，利用分光镜测出三棱镜的顶角 及最小偏向角 ，即可由上式算出棱镜材料的折射率 。实验内容与步骤：1．分光计的调整（分光计结构如右图所示） 在进行调整前，应先熟悉所使用的分光计中下列螺丝的位置： ①目镜调焦(看清分划板准线)手轮； ②望远镜调焦(看清物体)调节手轮(或螺丝)；③调节望远镜高低倾斜度的螺丝；④控制望远镜(连同刻度盘)转动的制动螺丝；⑤调整载物台水平状态的螺丝；⑥控制载物台转动的制动螺丝；⑦调整平行光管上狭缝宽度的螺丝；⑧调整平行光管高低倾斜度的螺丝； 图5 ⑨平行光管调焦的狭缝套筒制动螺丝。(1)目测粗调。将望远镜、载物台、平行光管用目测粗调成水平，并与中心轴垂直(粗调是后面进行细调的前提和细调成功的保证)。(2)用自准法调整望远镜，使其聚焦于无穷远。①调节目镜调焦手轮,直到能够清楚地看到分划板"准线"为止。 ②接上照明小灯电源，打开开关，可在目镜视场中看到如图4所示的“准线”和带有绿色小十字的窗口。 图6目镜视场 ③将双面镜按图5所示方位放置在载物台上。这样放置是出于这样的考虑：若要调节平面镜的俯仰，只需要调节载物台下的螺丝a1或a2即可，而螺丝a3的调节与平面镜的俯仰无关。图7平面镜的放置 ④沿望远镜外侧观察可看到平面镜内有一亮十字，轻缓地转动载物台，亮十字也随之转动。但若用望远镜对着平面镜看，往往看不到此亮十字，这说明从望远镜射出的光没有被平面镜反射到望远镜中。我们仍将望远镜对准载物台上的平面镜，调节镜面的俯仰，并转动载物台让反射光返回望远镜中，使由透明十字发出的光经过物镜后（此时从物镜出来的光还不一定是平行光），再经平面镜反射，由物镜再次聚焦，于是在分划板上形成模糊的像斑（注意：调节是否顺利，以上步骤是关键）。然后先调物镜与分划板间的距离，再调分划板与目镜的距离使从目镜中既能看清准线，又能看清亮十字的反射像。注意使准线与亮十字的反射像之间无视差，如有视差，则需反复调节，予以消除。如果没有视差，说明望远镜已聚焦于无穷远。 (3)调整望远镜光轴，使之与分光计的中心轴垂直。 平行光管与望远镜的光轴各代表入射光和出射光的方向。为了测准角度，必须分别使它们的光轴与刻度盘平行。刻度盘在制造时已垂直于分光计的中心轴。因此，当望远镜与分光计的中心轴垂直时，就达到了与刻度盘平行的要求。具体调整方法为：平面镜仍竖直置于载物台上，使望远镜分别对准平面镜前后两镜面，利用自准法可以分别观察到两个亮十字的反射像。如果望远镜的光轴与分光计的中心轴相垂直，而且平面镜反射面又与中心轴平行，则转动载物台时，从望远镜中可以两次观察到由平面镜前后两个面反射回来的亮十字像与分划板准线的上部十字线完全重合，如图6（c）所示。若望远镜光轴与分光计中心轴不垂直，平面镜反射面也不与中心轴相平行，则转动载物台时，从望远镜中观察到的两个亮十字反射像必然不会同时与分划板准线的上部十字线重合，而是一个偏低，一个偏高，甚至只能看到一个。这时需要认真分析，确定调节措施，切不可盲目乱调。重要的是必须先粗调：即先从望远镜外面目测，调节到从望远镜外侧能观察到两个亮十字像；然后再细调：从望远镜视场中观察，当无论以平面镜的哪一个反射面对准望远镜，均能观察到亮十字时，如从望远镜中看到准线与亮十字像不重合，它们的交点在高低方面相差一段距离如图6(a)所示。此时调整望远镜高低倾斜螺丝使差距减小为h/2，如图6(b)所示。再调节载物台下的水平调节螺丝，消除另一半距离，使准线的上部十字线与亮十字线重合，如图6(c)所示。之后，再将载物台旋转180o ，使望远镜对着平面镜的另一面，采用同样的方法调节。如此反复调整，直至转动载物台时，从平面镜前后两表面反射回来的亮十字像都能与分划板准线的上部十字线重合为止。这时望远镜光轴和分光计的中心轴相垂直，常称这种方法为逐次逼近各半调整法。图8亮十字像与分划板准线的位置关系 （4）调整平行光管 用前面已经调整好的望远镜调节平行光管。当平行光管射出平行光时，则狭缝成像于望远镜物镜的焦平面上，在望远镜中就能清楚地看到狭缝像，并与准线无视差。 ①调整平行光管产生平行光。取下载物台上的平面镜，关掉望远镜中的照明小灯，用钠灯照亮狭缝，从望远镜中观察来自平行光管的狭缝像，同时调节平行光管狭缝与透镜间的距离，直至能在望远镜中看到清晰的狭缝像为止，然后调节缝宽使望远镜视场中的缝宽约为1mm。 ②调节平行光管的光轴与分光计中心轴相垂直。望远镜中看到清晰的狭缝像后，转动狭缝（但不能前后移动）至水平状态，调节平行光管倾斜螺丝，使狭缝水平像被分划板的中央十字线上、下平分，如图7(a)所示。这时平行光管的光轴已与分光计中心轴相垂直。再把狭缝转至铅直位置，并需保持狭缝像最清晰而且无视差，位置如图7(b)所示。图9狭缝像与分划板位置 至此分光计已全部调整好，使用时必须注意分光计上除刻度圆盘制动螺丝及其微调螺丝外，其它螺丝不能任意转动，否则将破坏分光计的工作条件，需要重新调节。 2. 测量 在正式测量之前，请先弄清你所使用的分光计中下列各螺丝的位置：①控制望远镜（连同刻度盘）转动的制动螺丝；②控制望远镜微动的螺丝。(1)用反射法测三棱镜的顶角 如图2 所示，使三棱镜的顶角对准平行光管，开启钠光灯，使平行光照射在三棱镜的AC、AB面上，旋紧游标盘制动螺丝，固定游标盘位置，放松望远镜制动螺丝，转动望远镜（连同刻度盘）寻找AB面反射的狭缝像，使分划板上竖直线与狭缝像基本对准后，旋紧望远镜螺丝，用望远镜微调螺丝使竖直线与狭缝完全重合，记下此时两对称游标上指示的读数 、 。转动望远镜至AC面进行同样的测量得 、 。可得 三棱镜的顶角 为 重复测量三次取平均。(2) 棱镜玻璃折射率的测定 分别放松游标盘和望远镜的制动螺丝，转动游标盘（连同三棱镜）使平行光射入三棱镜的AC面，如图3 所示。转动望远镜在AB面处寻找平行光管中狭缝的像。然后向一个方向缓慢地转动游标盘（连同三棱镜）在望远镜中观察狭缝像的移动情况，当随着游标盘转动而向某个方向移动的狭缝像，正要开始向相反方向移动时，固定游标盘。轻轻地转动望远镜，使分划板上竖直线与狭缝像对准，记下两游标指示的读数，记为 、 ；然后取下三棱镜，转动望远镜使它直接对准平行光管，并使分划板上竖直线与狭缝像对准，记下对称的两游标指示的读数，记为 、 ，可得 重复测量三次求平均。用上式求出棱镜的折射。五、实验注意事项：1．望远镜、平行光管上的镜头，三棱镜、平面镜的镜面不能用手摸、揩。如发现有尘埃时，应该用镜头纸轻轻揩擦。三棱镜、平面镜不准磕碰或跌落，以免损坏。 2．分光计是较精密的光学仪器，要加倍爱护，不应在制动螺丝锁紧时强行转动望远镜，也不要随意拧动狭缝。 3．在测量数据前务须检查分光计的几个制动螺丝是否锁紧，若未锁紧，取得的数据会不可靠。 4．测量中应正确使用望远镜转动的微调螺丝，以便提高工作效率和测量准确度。 5．在游标读数过程中，由于望远镜可能位于任何方位，故应注意望远镜转动过程中是否过了刻度的零点。 6．调整时应调整好一个方向，这时已调好部分的螺丝不能再随便拧动，否则会造成前功尽弃。 7．望远镜的调整是一个重点。首先转动目镜手轮看清分划板上的十字线，而后伸缩目镜筒看清亮十字。 六、思考题：1． 分光计的调整有哪些要求？其检察的标准？答：①几何要求：“三垂直”。即载物小平台的平面，望远镜的主光轴、平行光管的主光轴均必须与分光计的中心轴垂直。②物理要求：“三聚焦”。即叉丝对目镜聚焦，望远镜对无穷远聚焦，狭缝对平行光管物镜聚焦。③检验三垂直的标准：“四平行”。即载物小平台平面、望远镜的主光轴、平行光管的主光轴和读数刻度盘四者相互平行。④检验三聚焦的标准：“三清晰”。即目镜中观察叉丝清晰，亮十字反回的像（绿十字）清晰，在望远镜中看到狭缝清晰。2． 即是重点又是难点内容的望远镜系统如何调整？ 答：①目测粗调②打开小灯调节目镜，看清叉丝。③在载物台上放双平面镜（位置如胶片图所示，为什么？），调节物镜（仰俯角和伸缩）和载物台（螺钉），使双平面镜两面有绿十字像并清晰、无视差，此时望远镜已聚焦无穷远。④调整望远镜的光轴与分光计转轴垂直。使双平面镜两面有绿十字像。再用“减半逐步逼近法”使望远镜的光轴与分光计的中心轴垂直（对照胶片讲解，必要时示范讲解），即叉丝的像与调整叉丝完全重合。3． 平行光管如何调整？答：①用已调节好的望远镜作基准，调节平行光管下部仰俯螺钉，使其出射平行光。②调节平行光管的狭缝宽度（强调：不要损坏刀口！）③使平行光管光轴与分光计转轴垂直。使目镜中看到的水平和竖直的狭缝像均居中。 七、误差分析：在测量三棱镜折射率实验中,当调节分光计的平行光管光轴与望远镜光轴垂直于中心转轴后,由实验可知载物台平面的倾斜程度对最小偏向角的测量没影响,但顶角的测量随着载物台平面的倾斜程度不同,有着不同程度的影响。八、实验心得:1、提高了我们综合分析的能力，当面对一个问题时，首先要考虑怎样解决，既而开始考虑解决的具体方法，在实验前必须提前预习,把整个实验的原理,流程和注意的事项掌握清楚,这才能保证你实验既快又好的完成.在预习时要有目的,心中明白哪里里是实验的重点,哪里是必须注意的问题.设计实验步骤，并预测实验中可能出现的问题。对实验的每一个细节进行分析，尽可能的减小实验误差。这些都使我们初步培养了实验的素质和能力。 2、培养了实验中科学严谨的态度，尊重客观事实，对待任何实验都客观认真仔细。实验正式开始前,应该先清点下实验仪器和材料,并对其进行检查,以确保实验顺利进行.在动手前先将心中的实验知识对照一起过一遍再开始动手。实验过程更始需要很精细的态度和求实的态度。对每个步骤，每个细节都要留心。 3、养成了我们做事认真细致有耐心的习惯。在实验中,你必须有耐心,因为实验中每个变化都可能是细微的,必须集中精神才能去发现它,不可以急于求成。如果实验数据与正确数据相差过大时,应该把整个实验过程回想一下,对照每一步骤寻求问题所在,重新做一次。 4、悉了很多仪器的使用方法，在光学实验室良好的环境和设备的情况下，我们得到了很好的锻炼，对很多仪器的调试、测量，以及如何减小实验误差等，都有了很明确的认识。我想，这在我们以后的实验过程中会非常有用。 5、实验老师们的耐心讲解和对工作的认真态度给我留下了很深刻的印象。辅导我们实验的每一位老师，对工作都极其认真，在实验前,老师通常会给大家讲解下实验的注意事项,对于我们实验中出现的问题都给予耐心的讲解，而且，在我们实验进行中和实验结束后，老师们都启发我们思考实验的一些外延内容，这对我们将实验所进行的内容跟课本密切联系起来，将知识更充分地掌握。九、试验总结：首先：光学试验的仪器测量都十分精密，实验中一个很小的环节都有可能导致试验的失败，以“应用全反射临界角法测定三棱镜的折射率”为例，在实验过程中要注意分光仪在进行本次实验时已做过校正，因此时在测量时就应该注意，只能调节载物台倾斜度调节螺丝，而对于像平行光管倾斜度调节螺丝、望远镜倾斜度调节螺丝等就不应该再进行调节，否则将会导致实验失败。 第二：对于数据的处理，光学实验也有较高的要求，数据不但要求准确度高，精确度也要高，而且通常要记录多组数据，最后取平均。 第三：光学实验的测量仪器在进行测量时，通常要求一个稳定的实验环境，当有光源时，通常要在实验开始前先打开光源，这样在进行实验时，光源已经达到稳定。对于“全息照相”，对环境的稳定性要求更高，实验仪器都放在防震台上，在仪器排好光路后，要用手轻敲台面，看光路是否改变，在进行曝光前，更是要求室内实验人员不得大声说话，因为声波震动而引起的空气密度变化都有可能导致实验失败，在装片后还必须有一个使台面上各元件自然稳定的时间，即使干涉条纹稳定下来了，时间也不得少于3分钟。可以说这是我做过的六次实验中对稳定性要求最高的实验 第四：我始终认为做好实验预习是最重要的，在作实验前，通过预习，我们可以了解要做实验的原理及要使用的仪器的使用方法，这样在实验之前就已对试验有了大概的了解，然后在课堂上通过老师的讲解，可以迅速掌握仪器的使用方法，这样做起实验来才会得心应手，同时也可以减少因不了解实验仪器的使用方法而导致的实验失败，甚至是对仪器造成损坏，可以说做好实验预习是一举多得的事情。九、参考文献：[1]、普通物理实验3光学部分 高等教育出版社 杨述武、赵立竹等编 2008年版；[2]、大学物理实验 章世恒 主编 西南交通大学出版社 2009 年1月 ；[3]、大学物理实验教程（第2版） 何春娟 主编 西北工业大学出版社 2009年4月。
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随着社会的不断进步，人民对提高生活质量的需求，尤其是对视力保健的关注度越来越高。统计数据表明， 中国 在校小学生佩戴眼镜的人数比例达到30％，中学生为50％，而大学生则达到了75％，成为名符其实的眼镜王国”。 一、应社会需求 发展 起来的新学科 1988年，中国计量 科学 研究院(以下简称“计量院”)组织了新中国成立以来首次、也是北京市第一次眼镜市场的产品质量调查。根据英国标准化协会(BSI)的标准，京城20多家大眼镜店被抽查的上千副眼镜的质量合格率不足10％。 为此，我国著名光学专家王大珩院士率先向社会发出呼吁：眼镜是保健用品，不是一般的商品，全社会都应陔关注消费者的视力健康!一些政协委员和人大代表电纷纷提出提案，建议国家有关部门对眼镜行业进行治理和整顿。 眼镜质量问题引起了原国家技术监督局的高度重况和关注．眼镜立即在“质量万里行”活动中被列为重点监督的产品。计量院正是从这时开始涉足眼科光学领计量和检测标准的研究的。近20年过去了，具有中国旖色的眼科光学计量取得了长足的发展和进步。 二、眼科光学与相关产业密切结合、与其他学科相巨交叉 眼科光学是集眼科学、计量学、光学和光学仪器、验光学、眼镜学、像质评价技术、光电检测技术、光谱光度学、神经学、生物学、材料学、制造工艺等为一体的新兴的边缘学科。眼科光学计量是眼科诊断、 治疗 、视力矫正和眼保健的基础保证。 根据国际标准化组织(ISO)的专业划分，至少有五大产业领域与眼科光学密切相关，它们是眼镜镜片、眼科仪器、角膜接触镜、人工晶体和个体眼部防护用品。由此可见，眼科光学又是医疗卫生、眼镜行业和光学 工业 的结合体。 三、具有中国特色的眼科光学计量体系 根据日益增长的国际市场和贸易全球化的需要，20世纪80年代中期，ISO在IS0C172“光学和光子学”标准化技术委员会下面设立了SC7“眼科光学和仪器”标准化分技术委员会。由于信息不畅以及行业划分的制约，中国的眼科光学计量研究与国际IS0C172，sC7的建立虽然同步，却又毫不相干。而国际计量界的同行们，无论是德国联邦物理技术研究院(PTB)、美国国家标准与技术研究院(NIST)，还是英国国家物理实验室(NPL)，都还没有开展这一领域的研究。 命运注定，中国眼科光学计量的生存、确立和发展必须自主创新。 1。独创性 由于有了计量院这样一支实力雄厚的技术队伍的实质性介入，仅仅十几年，中国已经开始步人国际先进水平的行列。 在国家质检总局的大力支持下．计量院会同全国质监系统先后研究建立了顶焦度计量基准、验光机顶焦度工作基准、角膜接触镜顶焦度工作基准等一系列有代表性的基、标准装置，并在全国范围内建立了具有中国特色的顶焦度量值传递和溯源体系，如图1所示。 纵观国际眼科光学大家庭，中国的眼科光学计量颇具独创性。正如国际计量局局长瓦拉德于2005年下半年参观计量院眼科光学实验室时所说的：“我在你们这里看到了一片新天地。” 2．建标与量值传递的新模式 传统的计量工作，往往是先投入巨资研究检测装置，待建立计量基准或计量标准后，再对社会开展周期检定和量值溯源。 计量院在开展眼科光学计量研究的初期．面临着技术上走哪条路的抉择。由于服科光学计量服务的对象是一个个不同的生命体，从某种意义上说．如果初期没有选择好突破口，计量检定方法不能通过临床医学的考验，就不可能得到今天医学界的承认，更不会被国内外市场广泛使用并接受，也绝无可能发展到今天的规模和水平。回顾 历史 ，眼科光学计量所实现的突破在于： (1)选择了以动态或在线检测为研究目标 事实证明，这种模式能够较好地适应眼镜行业或医学界在使用现场进行动态测量或在线校准和检测的需求显然，传统的、基于静态或分量程的工业计量模式，以及高成本低使用率的计量建标和检定模式．不适于眼科临床医学的需求。而中国自主研发的各种眼科光学计量标准器具，如标准镜片和标准模拟眼等，则以其高科技含量、低成本高使用率、便于携带等显著特点．一下子就被国内外客户广泛接受，并占领了市场。 (2)以Map手段实现量值传递的新模式 面对具有3．6亿用户的眼镜市场，我们只有通过大面积的建标和计量检定，才能有效控制眼镜行业的产品质量，才能保证全国范围内顶焦度量值的统一。而Map了用客传递手段，就像勾画一张全国地图一样，把顶焦度一级或二级标准、验光机顶焦度标准、瞳距仪检定装置、透射比计量标准装置、角膜曲率计检定标准等通过自上而下的逐级推广、很快就覆盖了全国除 台湾 和西藏以外的大部分省、市地区计量所，甚至远销海外。这种新模式，满足了我国眼镜行业分布区域大、计量检定贯穿始终、无所不在的市场的需求。 四、计量基标准与科研成果转化 眼科光学领域内的基本物理量是顶焦度——VertexPowero 围绕着顶焦度这个重要物理量，我国先后研究建立了各项基(标)准，并将其迅速转化为市场上可流通的商用计量标准器具。例如：“顶焦度标准镜片”、“主观式和客观式标准模拟眼”、“接触镜顶焦度专用标准镜片”、“眼镜片透射比测量装置”、“瞳距仪计量检定装置”和“商用瞳距仪样机”、“角膜曲率计标准器”等。 上述计量标准器具均可直接用于对眼科光学计量仪器进行强制检定和计量校准，且具有包容性强、较长期的适应性、研究费用低廉、易于操作和大范围推广等优点，有利于调动地方质监部门的积极性。 上下齐抓共管大好局面的形成，使我国政府对眼科光学领域的产品质量实施市场监督的目标能够落到实处。 五、发挥龙头作用、形成计量院与地方技术机构双赢的局面 眼科光学计量之所以能够在短短十几年里取得如此快速的发展．并为提高我国眼镜行业产品质量的提高作出举足轻重的贡献，除了计量院自身的努力之外，另一个重要的原因就是这项工作得到了全国各地质监部门的积极响应和大力协助。 目前．除台湾、西藏以外的大多数省市级的计量和质检机构都开展了眼科光学计量检定和产品质量监督工作．各地技术机构直接使用计量院提供的计量标准器具。这种“统一研制、统一推广、统一培训、统一周期检定”的“四个统一”模式有效解决了巨大市场需求下的量值溯源和量值统一问题，使将原来看起来十分复杂和困难的技术管理和市场监督工作变得简化和顺畅起来。 眼科光学计量走出了一条计量为国民 经济 服务、为社会发展服务、为提高人民生活质量和身体健康服务的新思路，不但使社会和国民从中受益，也形成了计量院与地方技术机构双赢共进的新局面。 六、中国眼科光学计量研究实现“从零的突破到质变的跨越” 眼科光学计量所走过的路。为计量科学技术的发展开拓了广阔的研究领域，使计量科学更贴近生活，更贴近国民经济。也锻炼和造就了一批了解市场、了解 企业 需求。通过为社会服务而发现和寻找科研方向的新型的科技人员。 顶焦度计量标准(基准)、验光机工作基准、角膜接触镜顶焦度工作基准的相继研发成功。确立了计量院在国内眼科光学领域的“科研龙头”地位．同时。为提高中国在国际眼科光学界的地位赢得了关键的一票。
眼视光行业从业人员资格认证的必要性调查报告【摘要】目的 调查不同人群对眼视光行业从业人员资格认证的必要性的看法。方法 采用问卷调查的形式对不同职业、不同年龄、不同学历人群共300人进行问卷调查。结果 目前眼视光从业人员资格认证还未完全规范。结论 眼视光学在维护视觉健康方面具有非常重要的作用,视光从业人员应进行专业规范化培训及职业资格认证,持证上岗,依法从业势在必行。【关键词】眼视光从业人员 资格认证 必要性人类对外界信息的获取主要依靠于视觉,眼睛收集到的信息占80%,然而,我们的视觉健康正在受到极大的威胁。据世界卫生组织(WHO)估计全世界有盲人4000万～5000万,低视力是盲人的3倍,为亿～亿,其中75%即约1亿多患者可通过手术及屈光矫正得以恢复或提高视力。我国盲人有500万,低视力有750万,在我国,老年低视力和儿童低视力二种人群不应忽视。我国个儿童中有87个为视力残疾,而在60—69岁的老年人中个人有400人为视力残疾,70—79岁为800人,80—89岁为人,而90岁或以上视力残疾可高达人,我国老年人视力残疾已是我们必须面临的十分严峻的挑战。我国每年出现新盲人45万,低视力135万。鉴于此1999年WHO提出“视觉2020,全球行动消灭可避免盲,享有看见的权利”的活动,我国是成员国之一。五种可避免盲分别为白内障、沙眼、河盲(只存在于某些非洲及少数拉美国家)儿童盲及低视力与屈光不正。按生活视力<～为标准,低视力的患病率为,从病因上看屈光不正占其中的,白内障占[1],屈光不正主要依靠于屈光矫正康复或提高视力,白内障患者术后很多也需要验光和屈光矫正来弥补手术未能解决的问题。可见眼视光学在低视力的康复和眼保健方面具有非常重要的作用。眼视光学在美国已发展成为一个独立医疗保健学科,眼视光从业人员有光学师,视光医师和眼科医师,光学师以眼测量和制作为主,无需医疗背景,视光医师、眼科工程师需经过8年的医科或视光专业教育,分别获得MD(医学博士)或OD(视光学博士),两者均需获得工程师资格和执照,视光工程师侧重眼保健工作,类似眼内科,眼科医师主要以手术为主,类似眼外科,在欧州,也大致如此[2]。我国是近视大国,近视占总人数的30%,其中青少年近视率在30—70%,但是由于历史等原因,传统的眼镜行业成为一个垄断,市场混乱,影响国民视觉健康。眼视光行业是否应持证上岗、依法从业成了热点,焦点问题。曲靖医学高等专科学校自2005年开始,率先在眼视光专业大力推行“双证培养”模式,特色、服务培训了初、中、高级验光员、磨镜工10批,在校的眼视光专业学生双证率达99%,使大批学生在实习时就持证顶岗、带薪实习,由于动手能力强基础扎实,毕业生供不应求,分布在上海、南京、广州等地,实现100%就业,营造出了学历文凭与职业资格证书“两件证书”制度并建的氛围。同时,用职业资格证书这个有力的手段,规范视光行业为培训质量提高了职业培训的影响力。目前,我们有深圳博士、天明、750、大全等多家视光行业多年与我们合作成为我们的实习基地,并招聘眼视光专业的毕业生,这与我们的“双证培养”是分不开的,眼视光行业职业资格认证已成为就业的真正“通行证”。云南省有眼视光相关企业200余家,我们从各视光中心、眼科、眼镜店,采用问卷调查,统计得出眼视光行业相关人员对眼视光执业资格认证的必要性及专业培训的需求:从眼视光从业人员的学历构成:硕士及以上学历,本科17%,专科80%,高中及同等学历;认为现在的眼视光职业培训及认证较规范,认为一般,认为不规范;60%认为对眼视光从业人员进行规范的职业培训及认证非常有必要,认为有必要,认为可培训也可不培训;50%认为规范的职业培训及认证对眼视光从业人员的职业发展非常重要,45%认为重要,5%认为一般;65%认为眼视光从业人员进行规范的职业培训及认证对更好的为诊疗对象服务有很大帮助,认为有帮助,认为可能有;认为规范的职业培训及认证对今后的发展非常重要,40%认为重要,认为一般;对规范的职业培训及认证的发展趋势非常有信心,60%有信心,持怀疑态度。云南省目前有两家高等医学院校开设了眼视光专业,有专科、本科二个层次。通过问卷调查,统计得出眼视光专业学生对规范的职业培训及认证的认识:15%的学生认为规范的职业培训及认证规范,35%认为一般,50%认为不规范;60%认为对眼视光从业人员进行规范的职业培训及认证非常有必要,40%认为有必要;55%认为规范的职业培训及认证对自己的职业发展非常重要,35%认为重要,10%认为一般;70%认为眼视光从业人员进行规范的职业培训及认证对更好的为诊疗对象服务有很大帮助,30%认为有帮助;65%表示一定会选择规范的职业培训及认证,35%表示应该会。同时,我们还对不同职业、不同年龄、不同学历层次的人群进行了调查。综上所述,眼视光学维护视觉健康方面具有非常重要的作用;但是目前眼视光从业人员资格认证还未完全规范,视光从业人员应进行专业规范化培训及职业资格认证,持证上岗,依法从业势在必行。党的十四届三中全会通过的《中共中央关于建设社会主义市场经济体制若干问题的决定》中提出在我国实行学历文凭和职业资种证书并建的制度。这是关系到我国劳动队伍整体素质的提高。关系到我国经济方式转变和增强国际竞争力的一项重大举措。2003年3月,劳动保障部颁布了6号部令,要求对技术复杂、量大面广、涉及人身安全、重大财产安全及广大消费者利益的职业,求职者未经培训、未取得相应的资格证书不得就业[3]。眼视光行业从业人员执业资格的认证制度是引导和规范职业培训的主要手段,要把培训引导到促进就业的方向上来。职业资格认证以职业活动为导向,以实际操作为主要依据,以第三方认证原则为基础。它的建立是以国家法律为依据,实行的是靠政府权威力推行的管理模式,是我国劳动人事制度的重要组成部分,大力推行眼视光行业职业资格认证制度,可全面提高眼视光行业素质,提高工作能力和就业能力。视光行业就业上岗是有一定的职业能力水平。可以说职业资格证书就是眼视光行业就业的“通行证”。参考文献[1] 孙葆忱.低视力学[M].北京:人民卫生出版社,2004.[2] 王光霁.视光学基础[M].北京:高等教育出版社,2005.[3] 劳动和社会保障部培训就业司、劳动和社会保障部职业技能鉴定中心组织编写. 全国职业技能鉴定管理与考评人员培训教材国家职业技能鉴定教程[M].北京:中国出版集团现代教育出版,2009.\
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六、绪论 小二号黑体加粗居中。内容500字左右，小四号宋体，行距：20磅
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(三)表格
每个表格应有自己的表序和表题，表序和表题应写在表格上方正中。表序后空一格书写表题。表格允许下页接续写，表题可省略，表头应重复写，并在右上方写“续表××”。
(四)插图
每幅图应有图序和图题，图序和图题应放在图位下方居中处。图应在描图纸或在洁白纸上用墨线绘成，也可以用计算机绘图。
(五)论文中的图、表、公式、算式等，一律用阿拉伯数字分别依序连编编排序号。序号分章依序编码，其标注形式应便于互相区别，可分别为：图、表、公式()等。
文中的阿拉伯数字一律用半角标示。
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(一)小二号黑体加粗居中。内容8—10篇， 五号宋体， 行距：20磅。参考文献以文献在整个论文中出现的次序用[1]、[2]、[3]……形式统一排序、依次列出。
(二)参考文献的格式：
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光学专业毕业论文提纲模板
光学专业毕业论文提纲怎么写?下面我以《在胡克参考球观念下诞生的新理论》论文提纲为例，为大家介绍论文提纲的写作技巧。
论文题目： 在胡克参考球观念下诞生的新理论
在光学的发展历史上，曾经有几位学者做出过杰出贡献。其中，依萨克-牛顿(I. Newton1642--1727)[1] 认为，光是发光体发射的一种微粒，人们通常说的粒子性。 到公元二十世纪初，爱因斯坦等人[2] 认为，光是一份一份的，每一份被称为光量子。综合牛顿与爱因斯坦的研究思想，作者经过详细思考后认为，一份光量子为一个独立的能量体，它是由更细微的能量颗粒按照某种方式集合而成的一个能量体，是一个具有空间形态的几何体。作者为了不再引进更多的新名称而称它为基本能量单元体。这种能量单元体颗粒也有学者称它为亚光子[3]。波动性代表人物惠更斯()[4] 提出了光的球面波观点，作者不能理解的是：一个光粒子是怎样产生的一个球面波，一个子波的能量又是多少?恐怕科学巨匠和高手也不理解他的具体描述。
1 自然条件下的光辐射
一份光量子能量的大小，我们不可能将一份光量子的内部结构分拆开进行测量和计算至少在当前这个时代是这样。接下来我们只有间接地使它与粒子(实物体)发生相互作用后所产生的效应进行描述。
如示，设想，这些实物粒子在常温下处于稳定状态(只有温度处在绝对零度或附近时的实物粒子才可能处于基态)，当它没有吸收外来能量时，也就不存在能量的外泻(辐射)，这时它处于临时稳定状态。在中，从S 发出的光经透镜L 后照射一透明物质，光子-1从实物粒子之间的狭小空隙(真空区域)中穿刺而过，光子-2 被实物粒子所吸收;我们构想，这个理想化粒子具有吸收一切能量段光子的能力，将吸收的每份光子又完全彻底地辐射出去(在粒子中不作任何残留)。即是，认为实物粒子辐射出去的光子与它所吸入光子的能量完全相同。显然，粒子在这一过程中经历了两个阶段：它吸收一份光子便从初始的稳定状态跃升至高的能量状态，这过程即为能量的上涨阶段;而高能态的它是极不稳定的，?即开始泻能，从高能态辐射光子而回落到原有的初始状态。粒子所经历吸能和泻能这一过程的两个阶段，就认为是粒子完成了一次能量的上涨和回落，简称粒子能量的一次涨落。粒子能量的一次涨落总会经历一段时间过程(哪怕很短)。
在中我们假设粒子在发射光子-1 后又吸收相同能量的光子，然后再辐射出光子-2;这一过程所经历的时间称为粒子能量的一次涨落(称为一个周期)，用符号T 表示。 在这个涨落周期内光子(在真空中)所运动的路程为CT, 即是：光子-1 和光子-2 之间的距离就称为一个涨落光程(为了直观，这里假定两份光子是在同一直线上)，用符号λ0 表示。
为了与经典理论相对应，便将涨落光程另名为涨落长度，光的涨落长度对照成经典概念的光波[5] 波长λ0 。 由于不同能量光子与实物粒子发生相互作用的涨落周期各异，因而涨落长度λ也不相同。显然，光子能量与涨落长度成为一一对应。涨落周期T 的倒数称为涨落频率(将光的涨落频率对照理解成经典概念光波频率), 用符号у表示, у = 1?T 。为此，作者将新旧概念对照列表：
显然，不同颜色(或称为能量)的光，它涨落一次的时间不相同，涨落光程也不相同。即是，光的涨落长度不相同。光子能量与涨落长度成为单值对应。
2 新建概念和观点
胡克参考球
当一份光子从粒子中辐射出去以后，作者假想，光量子是沿实物粒子的自旋切线方向辐射出去的，所以它离开粒子时刻就具有一速度C 。在科学史上，胡克()[6] 认为：光是由快的振动所组成， 可于刹那之间，或者说以非常大的速度，传播过任何距离;在均匀媒质中每一个振动都将产生一个圆球，这个圆球将恒稳地向外扩大。 胡克认为，光的行为如同声音在空气中的传播。 而现代研究认为，光是一种粒子，光子的运动方向是任意地自由取向， 即是：光子的运动方向有可能是OA、OB、OE 和 OF … 等方向的任意一个。 一份光子不可能同时射向两个或两个以上的几个方向，由于光子运动方向的不确定性，所以，作者为此设计一个数学模型半径为R = Ct 的参考球，并坚信它(光子)肯定会出现在这个圆球球面上的某一点，这个光子参考球如所示。
作为一个向外辐射能量(光子)的实物粒子O ，它不可能同时辐射出两份或两份以上的多份光子，因此，一个参考球的球面上就只有一份光子出现。由于它是不受我们的具体操控，也就不能确定它的具体方向，所以，它的运动方向是自由取向。经考证，最先提出扩散圆球概念的是胡克，作者构想的这个数学模型虽然与胡克所描述的物理意义大不相同，但提议将这个光子参考球命名为光子胡克参考球，简称为胡克参考球或胡克球。
惠更斯包络面
惠更斯()提出的包络面概念及惠更斯原理：波所到达的每一点都可以看作是新的波源，从这些点发出的波叫做子波;而新的波面就是这些子波在同一时刻所到达位置的包迹。 惠更斯所称的子波，其实应该理解成胡克提出的扩散圆球 [6] 。
但惠更斯原理对客观?物的描述是不准确的，比如，在真空中运动的光子，是以发射源为参考点的。它不是按照惠更斯包络面形式向外部空间扩散, 而是以胡克参考球方式向外部空间扩散，如所示。只有当这份光子被空间某一实物粒子完全吸收以后，又被完全辐射出去并产生了一个胡克圆球，实物粒子就是这个胡克参考球的中心。显然，包络面是由很多个胡克参考球包络而形成的，于是我们得到：
跟包络面相互作用的每一个质点，都可以看着是新的'发射源或扰动中心，从这些点发出的胡克球叫做次圆球; 而新的包迹就是这些次圆球在同一时刻所到达位置的重叠。
3 综述与讨论
早期的胡克和惠更斯理论说的都是一个一个脉冲，而不是具有一定波长的波列。后来，数学家欧勒(L. Euler,1707-1783)[5]认为, 光谱里每一种颜色必与某一定光波波长相对应。这就是最早提出波动光学的基本模式。不难看出，光波一词，是人为的一种假设。
虽然后来有实验支持，但本文作者应用胡克参考球模型和惠更斯包络面概念相结合，同样对光的干涉、衍射、折射、反射、偏振及全息[7-11]等实验结果作出了更合理的解释。
包络面的物理意义：作者对惠更斯包络面的分析，设有包络面从点O 以速度C 向四周扩散，已知t 时刻的包络面是半径为R1 的球面S1。 用惠更斯原理杨发成理论来求(t + T )时刻的包络面。S1 面上的各点都可以看作新的扰动源，它们在T 时间内发出半径为Ct 的胡克球，这些胡克参考球的包迹, 便成为新的包络面S2 和S3 ，并且S2 和S3的扩展方向相反(由于光子能量作用在粒子上的涨落时间非常小，在此处讨论可以忽略它)。
4 结论
在真空中，一份光粒子出现在以源点为中心、半径为光速与时间乘积的球面上，这个数学模型称为胡克参考球; 两个或两个以上的多个胡克参考球球面在同一时刻所到达位置的包迹，称著包络面。
参考文献
[1] I . Newton , Phil . Trans . No .80 (Feb .1672) , 3075 .
[2] A . Einstein , Ann .d . Physik . (4) .17 (1905) , 132 ;20 (1906) , 199 .
[3] Chong An Zhang, Wide Existence of Wave with the Non- Medium Transmission in the Nature, MatterRegularity 12 (3) 207-214 (2003).
[4] Chr . Huygens , Traite de La Lumiere , Brighton Press, 1690 .
[5] L. Euler, Opuscula varii argumenti, Berlin (1746), 169 .
[6] R . Hooke , Micrographia . (1665) , 47 .
[7] D. Gabor, Nature, 161(1948),777; Proc. Roy. Soc., A, 197(1949),454; Proc. Roy. Soc., B, 64(1951),449.
[8] D. Gabor, Rev. Mod. Phys., 28(1956), 260.
很好写啊，光电工程毕业论文，我写的是《LED照明光学系统的设计及其阵列光照度分布研究》，不过几万字的研究生论文自己完成还要工作，肯定没时间。还是同事给我的莫文网，有专业老师帮忙写就是快，专业的说
采访专业人才论文 眼视光技术专业是一门以保护眼视觉健康为主要内容，集眼科、视光学及视觉服务为 一体的眼保健、预防、治疗和康复全程全面的服务专业，旨在培养集眼保健技术、专业验光 配镜技能、服务理念于一体“医工商”复合型眼视光技术人才。 我国眼镜市场潜力巨大， 全国近视人群约 4 亿， 老花人群超过了 亿， 这些人中 90% 都需要眼镜。根据目前我国眼镜店数量计算大约需要 24 万名视光师，但是视光专业每年的毕 业生却不足千人，因此培养既能从事医学验光、眼镜定配技术，又能从事眼镜行业经营管理 工作需要的高级应用型眼视光技术人才，才能不断满足人们群众日益增长的视力保健服务的 需要。而如今，人们对眼部疾病的认识与预防的认知很是缺乏。今天我就给大家介绍一下眼 睛的疾病与预防的方法。我主要给大家介绍的是屈光不正这种常见的眼部疾病。 一、屈光不正 1>屈光不正的定义：屈光不正是指眼在不使用调节时，平行光线通过眼的屈光作用后， 不能在视网膜上结成清晰的物像，而在视网膜前或后方成像。它包括远视、近视及散光。 2>屈光不正的分类：最常见的屈光不正有三种： 1、近视眼：看不清远处物体； 2、远视眼：看不清近处物体； 3、散光眼：因角膜（覆盖眼球的一层透明膜）不规则弯曲而引起的影象变 型。 老视眼是第四种屈光不正，指在一手臂长的距离内有阅读和视觉困难，老视眼与其他 几种屈光不正的区别是，它与年龄有关，几乎是人人会发生的。屈光不正无法预防，但可通 过验光作出诊断，并可选择眼镜、隐形眼镜或手术加以矫正。 3>屈光不正的因素：造成屈光不正的原因很多，其中遗传因素是很重要的原因。当然不 合理的用眼也是不可忽视的原因，儿童处于生长发育时期，又不注意用眼卫生，如看书、写 字的姿势不正确，或光线不好，造成眼与书的距离太近，或看书时间过长，或走路、坐车看 书等都可造成眼睛过度疲劳，促成屈光不正。 4>屈光不正的临床表现： 1、近视 轻度或中度近视，除视远物模糊外，并无其它症状，在近距离工 作时，不需调节或少用调节即可看清细小目标，反而感到方便。但 在高度近视眼，工作时目标距离很近，两眼过于向内集合，这就会 造成内直肌使用过多而出现视力疲劳症状。 2、远视 远视眼的视力，由其远视屈光度的高低与调节力的强弱而决定。轻 度远视，用少部分调节力即可克服，远、近视力都可以正常，一般无 度远视，用少部分调节力即可克服，远、近视力都可以正常，一般无 症状。这样屈光不正图示的远视称为隐性远视。稍重的远视或调节力 稍不足的，因而远、近视力均不好。这些不能完全被调节作用所代偿 的剩余部分称为显性远视，隐性远视与视之总合称为总合性远视。远 视眼由于长期处于调节紧张状态，很容易发生视力疲劳症状。视力疲 劳症状是指阅读、写字或作近距离工作稍久后，可以出现字迹或目标 模糊，眼部干涩，眼睑沉重，有疲劳感，以及眼部疼痛与头痛，休息 片刻后，症状明显减轻或消失。此种症状一般以下午和晚上为最常见。 严重时甚至恶心、呕吐。有时尚可并发慢性结膜炎、睑缘炎或麦粒肿 反复发作。 3、散光 屈光度数低者可屈光不正示意图无症状，稍高的散光可有视力减退， 看远、近都不清楚，似有重影，且常有视力疲劳症状。 5>屈光不正的检查方法：屈光检查法包括主观检查法和客观检查法：主观检查法：1、 根据视力检查初步分析判断屈光性质法；2、插片验光法；3、交叉柱镜及散光矫正器验光法； 4、云雾法；5、散光表验光法；6、针孔片及裂隙片检查法；7、激光散斑图法。客观检查法 1、直接检眼镜检查法；2、视网膜镜检查法；3、带状光检影法；4、角膜计；5、自动验光仪 等。[5]基本治疗。 6>屈光不正的治疗： 1、近视治疗 治疗：轻度和中度近视，可配以适度凹透镜片矫正视力。高度近视 戴镜后常感觉物象过小、头昏及看近物困难应酌情减低其度数，或 戴角膜接触镜,但后者如处理不当可引起一系列角膜并发症。放射状 角膜切开术；在角膜周边部（瞳孔区以外）作 8～16 条放射状切口， 可使角膜中央变平坦，以降低眼的屈光度，达到矫治近视的目的。 一般对 2～8D 近视眼的矫正效果好，其矫正效果与切口深度，放射 状角膜切开的条数以及保留中央透明区的大小有关。但此种手术对 角膜造成一定损伤，处理不当可出现角膜穿孔、内皮失代偿及感染 等严重并发症，而且远期效果尚未完全确定，故对此手术应采取慎 重态度。 2、远视治疗 治疗：远视眼，如果视力正常，又无自觉症状，不需处理。如果有 视力疲劳症状或视力已受影响，应配戴合适的凸透镜片矫正。远视 程度较高的，尤其是伴有内斜视的儿童应及早配镜。随着眼球的发 育，儿童的远视程度有逐渐减退的趋势，因此每年还须检查一次， 以便随时调整所戴眼镜的度数。除配戴凸镜矫正外，还可以用角膜 接触镜矫正。 3、散光治疗 治疗：一般轻度而无症状者可不处理，否则应配柱面透镜片矫正， 近视性散光用凹柱镜片，远视性散光用凸柱镜片。 以上即是屈光不正的简单介绍。 目前人们对于眼视光技术这个名词还是很陌生，总有一些人对于这个名词都不知道。而 我们眼视光技术专业主要是培养眼视光行业中的高级技术人才， 毕业生可以从事屈光度检测、 眼镜定配、眼镜检测、眼科基本病理咨询等方面的具有专业理论知识和较强实践工作能力的 高技能专业人才。而目前主要的课程包括视光学基础、验光学、眼科临床、眼镜光学、隐形 眼镜基础、眼视光器械学、医学基础、眼镜定配技术、斜弱视、市场营销、专业英语等。眼 视光专业人才主要的就业方向是服务型行业如：各类眼镜店、医院眼视光门诊、眼镜生产企 业、眼镜贸易企业等。 目前我国正处于近视高发期,眼镜市场的需求巨大,而相应的眼视光技术专业人才却很 短缺。我国加入 W TO 和职业资格认证制度的实施,给高职高专医科院校开展眼视光技术职业 教育带来了机遇。而此对于我们从事眼视光专业的这一行业的人来讲也是一种机遇，所以我 们要抓住机遇，从而来发展自己的事业，同时也为眼视光技术这一行业献出自己一份力量。 姓名：刘孟鸿 学号：19 号
高分辨率光学显微术在生命科学中的应用【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。1 传统光学显微镜的分辨率光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]：横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径, 用折射率很高的材料。Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。2 高分辨率三维显微术在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy, I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12,13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率,还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色,可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。3 表面高分辨率显微术表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域, 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。【参考文献】[1] 汤乐民,丁 斐.生物科学图像处理与分析[M].北京:科学出版社,2005：205.[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:3790-3795.[3] Booth MJ, Neil MAA, Juskaitis R, et al. Adaptive aberration correction in a confocal microscope[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002, 99:5788-5792.[4] Goldman RD,Spector cell imaging a laboratory manual[J].Gold Spring Harbor Laboratory Press,2005.[5] Monvel JB,Scarfone E,Calvez SL,et deconvolution for three-dimensional deep biological imaging[J].Biophys,2003,85:3991-4001.[6] 李栋栋,郭学彬,瞿安连.以三维荧光反卷
光学专业毕业论文提纲模板
光学专业毕业论文提纲怎么写?下面我以《在胡克参考球观念下诞生的新理论》论文提纲为例，为大家介绍论文提纲的写作技巧。
论文题目： 在胡克参考球观念下诞生的新理论
在光学的发展历史上，曾经有几位学者做出过杰出贡献。其中，依萨克-牛顿(I. Newton1642--1727)[1] 认为，光是发光体发射的一种微粒，人们通常说的粒子性。 到公元二十世纪初，爱因斯坦等人[2] 认为，光是一份一份的，每一份被称为光量子。综合牛顿与爱因斯坦的研究思想，作者经过详细思考后认为，一份光量子为一个独立的能量体，它是由更细微的能量颗粒按照某种方式集合而成的一个能量体，是一个具有空间形态的几何体。作者为了不再引进更多的新名称而称它为基本能量单元体。这种能量单元体颗粒也有学者称它为亚光子[3]。波动性代表人物惠更斯()[4] 提出了光的球面波观点，作者不能理解的是：一个光粒子是怎样产生的一个球面波，一个子波的能量又是多少?恐怕科学巨匠和高手也不理解他的具体描述。
1 自然条件下的光辐射
一份光量子能量的大小，我们不可能将一份光量子的内部结构分拆开进行测量和计算至少在当前这个时代是这样。接下来我们只有间接地使它与粒子(实物体)发生相互作用后所产生的效应进行描述。
如示，设想，这些实物粒子在常温下处于稳定状态(只有温度处在绝对零度或附近时的实物粒子才可能处于基态)，当它没有吸收外来能量时，也就不存在能量的外泻(辐射)，这时它处于临时稳定状态。在中，从S 发出的光经透镜L 后照射一透明物质，光子-1从实物粒子之间的狭小空隙(真空区域)中穿刺而过，光子-2 被实物粒子所吸收;我们构想，这个理想化粒子具有吸收一切能量段光子的能力，将吸收的每份光子又完全彻底地辐射出去(在粒子中不作任何残留)。即是，认为实物粒子辐射出去的光子与它所吸入光子的能量完全相同。显然，粒子在这一过程中经历了两个阶段：它吸收一份光子便从初始的稳定状态跃升至高的能量状态，这过程即为能量的上涨阶段;而高能态的它是极不稳定的，?即开始泻能，从高能态辐射光子而回落到原有的初始状态。粒子所经历吸能和泻能这一过程的两个阶段，就认为是粒子完成了一次能量的上涨和回落，简称粒子能量的一次涨落。粒子能量的一次涨落总会经历一段时间过程(哪怕很短)。
在中我们假设粒子在发射光子-1 后又吸收相同能量的光子，然后再辐射出光子-2;这一过程所经历的时间称为粒子能量的一次涨落(称为一个周期)，用符号T 表示。 在这个涨落周期内光子(在真空中)所运动的路程为CT, 即是：光子-1 和光子-2 之间的距离就称为一个涨落光程(为了直观，这里假定两份光子是在同一直线上)，用符号λ0 表示。
为了与经典理论相对应，便将涨落光程另名为涨落长度，光的涨落长度对照成经典概念的光波[5] 波长λ0 。 由于不同能量光子与实物粒子发生相互作用的涨落周期各异，因而涨落长度λ也不相同。显然，光子能量与涨落长度成为一一对应。涨落周期T 的倒数称为涨落频率(将光的涨落频率对照理解成经典概念光波频率), 用符号у表示, у = 1?T 。为此，作者将新旧概念对照列表：
显然，不同颜色(或称为能量)的光，它涨落一次的时间不相同，涨落光程也不相同。即是，光的涨落长度不相同。光子能量与涨落长度成为单值对应。
2 新建概念和观点
胡克参考球
当一份光子从粒子中辐射出去以后，作者假想，光量子是沿实物粒子的自旋切线方向辐射出去的，所以它离开粒子时刻就具有一速度C 。在科学史上，胡克()[6] 认为：光是由快的振动所组成， 可于刹那之间，或者说以非常大的速度，传播过任何距离;在均匀媒质中每一个振动都将产生一个圆球，这个圆球将恒稳地向外扩大。 胡克认为，光的行为如同声音在空气中的传播。 而现代研究认为，光是一种粒子，光子的运动方向是任意地自由取向， 即是：光子的运动方向有可能是OA、OB、OE 和 OF … 等方向的任意一个。 一份光子不可能同时射向两个或两个以上的几个方向，由于光子运动方向的不确定性，所以，作者为此设计一个数学模型半径为R = Ct 的参考球，并坚信它(光子)肯定会出现在这个圆球球面上的某一点，这个光子参考球如所示。
作为一个向外辐射能量(光子)的实物粒子O ，它不可能同时辐射出两份或两份以上的多份光子，因此，一个参考球的球面上就只有一份光子出现。由于它是不受我们的具体操控，也就不能确定它的具体方向，所以，它的运动方向是自由取向。经考证，最先提出扩散圆球概念的是胡克，作者构想的这个数学模型虽然与胡克所描述的物理意义大不相同，但提议将这个光子参考球命名为光子胡克参考球，简称为胡克参考球或胡克球。
惠更斯包络面
惠更斯()提出的包络面概念及惠更斯原理：波所到达的每一点都可以看作是新的波源，从这些点发出的波叫做子波;而新的波面就是这些子波在同一时刻所到达位置的包迹。 惠更斯所称的子波，其实应该理解成胡克提出的扩散圆球 [6] 。
但惠更斯原理对客观?物的描述是不准确的，比如，在真空中运动的光子，是以发射源为参考点的。它不是按照惠更斯包络面形式向外部空间扩散, 而是以胡克参考球方式向外部空间扩散，如所示。只有当这份光子被空间某一实物粒子完全吸收以后，又被完全辐射出去并产生了一个胡克圆球，实物粒子就是这个胡克参考球的中心。显然，包络面是由很多个胡克参考球包络而形成的，于是我们得到：
跟包络面相互作用的每一个质点，都可以看着是新的'发射源或扰动中心，从这些点发出的胡克球叫做次圆球; 而新的包迹就是这些次圆球在同一时刻所到达位置的重叠。
3 综述与讨论
早期的胡克和惠更斯理论说的都是一个一个脉冲，而不是具有一定波长的波列。后来，数学家欧勒(L. Euler,1707-1783)[5]认为, 光谱里每一种颜色必与某一定光波波长相对应。这就是最早提出波动光学的基本模式。不难看出，光波一词，是人为的一种假设。
虽然后来有实验支持，但本文作者应用胡克参考球模型和惠更斯包络面概念相结合，同样对光的干涉、衍射、折射、反射、偏振及全息[7-11]等实验结果作出了更合理的解释。
包络面的物理意义：作者对惠更斯包络面的分析，设有包络面从点O 以速度C 向四周扩散，已知t 时刻的包络面是半径为R1 的球面S1。 用惠更斯原理杨发成理论来求(t + T )时刻的包络面。S1 面上的各点都可以看作新的扰动源，它们在T 时间内发出半径为Ct 的胡克球，这些胡克参考球的包迹, 便成为新的包络面S2 和S3 ，并且S2 和S3的扩展方向相反(由于光子能量作用在粒子上的涨落时间非常小，在此处讨论可以忽略它)。
4 结论
在真空中，一份光粒子出现在以源点为中心、半径为光速与时间乘积的球面上，这个数学模型称为胡克参考球; 两个或两个以上的多个胡克参考球球面在同一时刻所到达位置的包迹，称著包络面。
参考文献
[1] I . Newton , Phil . Trans . No .80 (Feb .1672) , 3075 .
[2] A . Einstein , Ann .d . Physik . (4) .17 (1905) , 132 ;20 (1906) , 199 .
[3] Chong An Zhang, Wide Existence of Wave with the Non- Medium Transmission in the Nature, MatterRegularity 12 (3) 207-214 (2003).
[4] Chr . Huygens , Traite de La Lumiere , Brighton Press, 1690 .
[5] L. Euler, Opuscula varii argumenti, Berlin (1746), 169 .
[6] R . Hooke , Micrographia . (1665) , 47 .
[7] D. Gabor, Nature, 161(1948),777; Proc. Roy. Soc., A, 197(1949),454; Proc. Roy. Soc., B, 64(1951),449.
[8] D. Gabor, Rev. Mod. Phys., 28(1956), 260.
很好写啊，光电工程毕业论文，我写的是《LED照明光学系统的设计及其阵列光照度分布研究》，不过几万字的研究生论文自己完成还要工作，肯定没时间。还是同事给我的莫文网，有专业老师帮忙写就是快，专业的说
高分辨率光学显微术在生命科学中的应用【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。1 传统光学显微镜的分辨率光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]：横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径, 用折射率很高的材料。Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。2 高分辨率三维显微术在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy, I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12,13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率,还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色,可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。3 表面高分辨率显微术表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域, 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。【参考文献】[1] 汤乐民,丁 斐.生物科学图像处理与分析[M].北京:科学出版社,2005：205.[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:3790-3795.[3] Booth MJ, Neil MAA, Juskaitis R, et al. Adaptive aberration correction in a confocal microscope[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002, 99:5788-5792.[4] Goldman RD,Spector cell imaging a laboratory manual[J].Gold Spring Harbor Laboratory Press,2005.[5] Monvel JB,Scarfone E,Calvez SL,et deconvolution for three-dimensional deep biological imaging[J].Biophys,2003,85:3991-4001.[6] 李栋栋,郭学彬,瞿安连.以三维荧光反卷